硫化氫對(duì)外周動(dòng)脈血管成形術(shù)再狹窄的影響及機(jī)制

汲桐羽 沈 雷 丁淑麗 何 軍 張曉東 馮化杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

硫化氫對(duì)外周動(dòng)脈血管成形術(shù)再狹窄的影響及機(jī)制

汲桐羽 沈 雷 丁淑麗1何 軍 張曉東 馮化杰2

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 研究硫化氫(H2S)對(duì)外周動(dòng)脈血管成形術(shù)再狹窄的影響及機(jī)制。方法 64只清潔級(jí)新西蘭白兔隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組。建立外周血管成形術(shù)模型，治療組每天腹腔注射125 μmol/kg硫氫化鈉溶液，對(duì)照組每天腹腔注射等劑量生理鹽水，每組持續(xù)給藥7 w。在給藥期間的第3、7周，切取頸總動(dòng)脈，進(jìn)行HE染色，觀察血管腔面積和中膜面積變化；ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-8表達(dá)，并檢測(cè)羥脯氨酸的含量變化。結(jié)果 與對(duì)照組相比，治療組血管腔面積均有顯著增加(P<0.01)，血管中膜面積顯著降低(P<0.01)，MMP-8含量明顯降低(P<0.01)，羥脯氨酸含量明顯降低(P<0.01)。結(jié)論 硫化氫通過(guò)下調(diào)MMP-8的表達(dá)，降低膠原蛋白的含量而改善外周血管成形術(shù)后出現(xiàn)的血管再狹窄。

硫化氫；外周動(dòng)脈血管成形術(shù)；羥脯氨酸

近年來(lái),腦、下肢、心、腎等器官的動(dòng)脈形成硬化斑塊，出現(xiàn)動(dòng)脈閉塞性病變的發(fā)病率不斷上升，由此導(dǎo)致的心腦梗死、急性血栓栓塞等疾病嚴(yán)重威脅老年患者的生命安全〔1〕。隨著影像醫(yī)學(xué)和介入醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)(PTA)及血管內(nèi)支架術(shù)等外周血管成形手術(shù)對(duì)暫時(shí)緩解各類動(dòng)脈硬化閉塞疾病發(fā)揮了良好的作用。但是隨著手術(shù)時(shí)間延長(zhǎng)，后期出現(xiàn)的繼發(fā)性血管狹窄又成為影響患者身體健康的重要致病因素〔2〕。因此，早期預(yù)防外周動(dòng)脈血管成形術(shù)再狹窄，將對(duì)保持血管通暢具有重要意義。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，硫化氫(H2S)參與了人體新陳代謝、能量轉(zhuǎn)化等重要生理過(guò)程，并拮抗血管損傷，對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)效應(yīng)〔3〕，但對(duì)外周血管成形術(shù)再狹窄的影響報(bào)道較少。本研究擬觀察H2S對(duì)外周血管成形術(shù)后管腔再狹窄的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 64只體重(2.78±1.14)kg雄性清潔級(jí)新西蘭白兔購(gòu)于蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組，每組32只。治療組每天腹腔注射115 μmol/kg硫氫化鈉溶液，對(duì)照組每天腹腔注射等劑量生理鹽水，每組持續(xù)給藥7 w。

1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)儀器 硫氫化鈉(成都科龍化學(xué)試劑公司)，生理鹽水(哈爾濱三精制藥廠)，羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒(美國(guó)RD公司)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-8酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó)RD公司)，IX73型顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，BJ000045酶標(biāo)儀(Bio-Tek)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 外周血管成形術(shù)模型的建立〔4〕以1.2 ml/kg標(biāo)準(zhǔn)，兔耳緣靜脈注射2.5%戊巴比妥生理鹽水溶液，頸部常規(guī)備皮、 消毒，分離左側(cè)頸動(dòng)脈鞘。在頸總動(dòng)脈分叉處至遠(yuǎn)心端0.5 cm處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在結(jié)扎線近心側(cè)進(jìn)行穿刺，2.5 mm球囊插入頸總動(dòng)脈4 cm，7個(gè)大氣壓充盈球囊后緩慢往返拖動(dòng)，持續(xù)60 s，間歇90 s后重復(fù)進(jìn)行，總共5次。

1.3.2 血管管腔面積和中膜面積 兩組動(dòng)物分別于造模后第3、7天取材，一部分以4%多聚甲醛溶液固定，石蠟切片，HE染色，使用Image-Pro Plus軟件計(jì)算管腔面積和血管中膜面積；另一部分標(biāo)本液氮保存，用于ELISA實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 羥脯氨酸含量測(cè)定 將兩組第3天和第7天的100 mg頸總動(dòng)脈凍干粉末分別溶于1 ml乙酸，按照羥脯氨酸試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格操作后，分光光度計(jì)比色，560 nm波長(zhǎng)讀取吸光度，計(jì)算羥脯氨酸含量。

1.3.4 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMP-8蛋白的表達(dá) 稱取兩組100 mg頸總動(dòng)脈凍干粉未，并加入裂解液，充分研磨裂解，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 血管管腔面積和中膜面積 與對(duì)照組相比，治療組血管腔面積均有增加(P<0.01)；隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，治療組第7天比第3天的血管管腔面積逐漸增加(P<0.01)。與對(duì)照組相比，治療組血管中膜層面積顯著降低(P<0.01)。見表1。

2.2 羥脯胺酸含量測(cè)定 與對(duì)照組相比，治療組羥脯氨酸含量明顯降低(P<0.01)；隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，治療組第7天比第3天的羥脯氨酸含量逐漸降低(P<0.01)，見表1。

2.3 MMP-8蛋白的表達(dá) 在各觀察時(shí)間點(diǎn)，治療組MMP-8表達(dá)均比對(duì)照組降低(P<0.01)，見表1。

表1 兩組頸總動(dòng)脈血管管腔面積和中膜面積、羥脯氨酸及MMP-8含量比較 ±s)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與同組第3天比較：2)P<0.01

3 討 論

發(fā)生在心臟、腦、四肢等部位的動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)病率一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，因?yàn)閯?dòng)脈硬化性疾病而導(dǎo)致的心腦血管疾病嚴(yán)重威脅患者的生命安全，這類疾病已經(jīng)成為制約我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)進(jìn)步的重要慢性疾病之一〔5〕。隨著醫(yī)學(xué)研究的深入和治療技術(shù)的發(fā)展，經(jīng)皮血管成形術(shù)已經(jīng)成為挽救危重心腦血管疾病患者的重要手段，但是術(shù)后出現(xiàn)的血管再狹窄等問(wèn)題也困擾著醫(yī)學(xué)界，基于外周血管成形術(shù)后再狹窄的病理改變是血管中膜層的膠原蛋白分泌增多，導(dǎo)致血管管腔狹窄，因此，尋找抑制膠原蛋白增多的辦法有可能對(duì)外周血管成形術(shù)后再狹窄的發(fā)生具有重要意義。細(xì)胞外基質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞生長(zhǎng)的重要微環(huán)境，膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，器官纖維化的主要病理變化是細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白含量大量增多〔6〕，造成膠原蛋白增多的主要原因是MMP和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)比例失調(diào)，前者主要作用是降解膠原蛋白，后者則對(duì)膠原蛋白具有保護(hù)作用。正常情況下，MMP/TIMP比例為1∶1，動(dòng)態(tài)的調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白的降解和產(chǎn)生，若兩者比例失調(diào)則會(huì)出現(xiàn)膠原蛋白合成和降解失衡，出現(xiàn)器官或組織的纖維化疾病〔7〕。而MMP活性增強(qiáng)也可以引起膠原蛋白的降解和變性，從而導(dǎo)致組織或器官的間質(zhì)出現(xiàn)纖維化改變。MMP-8作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族重要的成員，參與心血管系統(tǒng)細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白的代謝活動(dòng)〔8〕。目前研究認(rèn)為，羥脯氨酸作為膠原蛋白的重要組成成分，其含量可以間接反映細(xì)胞外機(jī)制中膠原蛋白的含量變化，是測(cè)定膠原蛋白含量的重要指標(biāo)。H2S作為在一氧化氮(NO)之后被發(fā)現(xiàn)的重要內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，參與多種生物學(xué)效應(yīng)及心血管調(diào)節(jié)作用，尤其是對(duì)心血管組織的重構(gòu)具有重要意義〔9〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予H2S的治療組，頸總動(dòng)脈成形術(shù)后的管腔明顯比對(duì)照組增大，這可能是由于血管的中膜層膠原蛋白含量發(fā)生變化，而在治療組的動(dòng)脈中膜觀測(cè)中發(fā)現(xiàn)，其厚度明顯降低，證明了筆者的推測(cè)。對(duì)治療組和對(duì)照組血管中的MMP-8進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)治療組MMP-8比對(duì)照組降低，同時(shí)，治療組羥脯氨酸含量也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是由于H2S通過(guò)下調(diào)MMP-8表達(dá)水平，糾正了MMP/TIMP表達(dá)失衡，進(jìn)而減輕外周血管成形術(shù)損傷后的血管內(nèi)膠原蛋白含量，有利于維護(hù)血管管腔的通暢性。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，H2S可下調(diào)肝癌細(xì)胞中MMP-9和MMP-2的表達(dá)，對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞遷移具有重要意義〔10〕；并發(fā)現(xiàn)H2S通過(guò)下調(diào)MMP-1表達(dá)以及維持MMP-1/TIMP-1的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)改善心肌纖維化，逆轉(zhuǎn)心臟功能具有重要關(guān)系〔11〕。綜上所述，H2S可以發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成或分解的效果，對(duì)抑制組織或器官纖維化、改善器官功能具有重要意義〔12〕。

1 寧 靚,王永生,楊 波,等.老年隱性高血壓患者血壓變異性與頸動(dòng)脈粥樣硬化及尿微量白蛋白的相關(guān)性〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2015;35(1):86-7.

2 Seung-Woon R.Duration of dual antiplatelet treatment in the era of next generation drug-eluting stents〔J〕.World J Cardiol,2014;6(4):148-53.

3 張紀(jì)存,柳云恩,王文越,等.硫化氫對(duì)心力衰竭發(fā)生發(fā)展影響的研究進(jìn)展〔J〕.臨床心血管病雜志,2014;30(5):371-3.

4 劉會(huì)武,張 艷,孫江波.益氣活血復(fù)方對(duì)兔頸總動(dòng)脈球囊損傷后PDGF-B mRNA表達(dá)的影響〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009;18(7):727-39.

5 牛子冉,方蓮花,杜冠華.動(dòng)脈粥樣硬化血管鈣化調(diào)節(jié)及中藥防治研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2015;31(6):741-4.

6 文 利,張 政.MicroRNA-21在器官纖維化中的研究現(xiàn)狀〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014;39(5):638-41.

7 張 紅,鄔時(shí)國(guó),干亞丹.MMP-2、MMP-9及TIMP-2、TIMP-1在非黑色素性皮膚癌中的表達(dá)〔J〕.檢驗(yàn)與臨床,2013;51(11):103-5.

8 聞江雄,孟照輝,謝月輝.基質(zhì)金屬蛋白酶8在心血管疾病中的研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述,2012;18(12):1785-7.

9 鄧 平,趙正春.硫化氫與心血管疾病關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)心血管雜志,2013;18(2):146-8.

10 陳 寧,王珊珊,陳玉涵,等.外源性硫化氫對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2自噬的影響〔J〕.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015;36(1):116-20.

11 張巧麗,杜軍保.氣體信號(hào)分子硫化氫與心血管疾病研究進(jìn)展〔J〕.實(shí)用兒科臨床雜志,2010;25(1):63-71.

12 李 芳,曾 歐,羅 健,等.硫化氫對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化及MAPK1/3和MMP-8表達(dá)的影響〔J〕.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015;35(4):549-52.

〔2016-09-28修回〕

(編輯 曲 莉)

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院科研項(xiàng)目(YT201310)；齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院院內(nèi)青年基金(QY2015Q-07)

馮化杰(1962-)，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事心血管疾病生理學(xué)機(jī)制研究。

汲桐羽(1992-)，女，本科在讀，主要從事心血管疾病發(fā)病機(jī)制研究。

R541.4

A

1005-9202(2017)10-2405-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.024

1 黑龍江省出入境檢驗(yàn)檢疫局 2 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院