依達拉奉對腦缺血再灌注大鼠腦紅蛋白和14-3-3γ蛋白的影響

韋俊杰 李呂力 李曉峰 李燕華 陳 淵 張麗香 范秉林 陳 志 封 渾

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院神經內科，廣西 南寧 530021)

依達拉奉對腦缺血再灌注大鼠腦紅蛋白和14-3-3γ蛋白的影響

韋俊杰 李呂力 李曉峰 李燕華 陳 淵 張麗香 范秉林 陳 志 封 渾

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院神經內科，廣西 南寧 530021)

目的 探索依達拉奉對腦缺血再灌注大鼠腦紅蛋白(Ngb)和14-3-3γ蛋白的影響。方法 采用大腦中動脈閉塞法建立大鼠腦缺血再灌注模型，將48只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和依達拉奉預處理組；采用酶聯免疫吸附法檢測血清Ngb和14-3-3γ水平，采用蛋白免疫印跡、免疫組化檢測腦組織中Ngb和14-3-3γ表達。結果 模型組大腦和血清的Ngb和14-3-3γ水平均高于假手術組(P<0.05)，依達拉奉預處理組大腦和血清的Ngb和14-3-3γ水平均高于模型組(P<0.05)。結論 依達拉奉能通過上調腦缺血再灌注大鼠血清和腦組織中Ngb和14-3-3γ水平發(fā)揮腦保護作用。

依達拉奉；腦缺血再灌注；大腦中動脈閉塞；腦紅蛋白；14-3-3γ蛋白

依達拉奉具有清除自由基、抗凋亡、抑制黏附因子等作用〔1，2〕。缺血性腦卒中最有效的治療手段是超急性期的血管再通治療(溶栓和取栓等)，但是血管再通后會出現缺血再灌注損傷，導致病情加重，而神經保護性蛋白能通過阻斷腦缺血再灌注病理損害的發(fā)生，防止或減輕缺血引起的腦損害。腦缺血后會誘導腦紅蛋白(Ngb)和14-3-3γ蛋白等神經保護蛋白生成增多〔3〕。本實驗擬探討依達拉奉是否通過調節(jié)Ngb 和 14-3-3γ蛋白表達對腦缺血再灌注損傷起到神經保護作用。

1 材料和方法

1.1 動物和分組 健康清潔級成年雄性SD大鼠共48只，體重280～320 g，購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。將大鼠隨機分為假手術組、模型組和依達拉奉預處理組，每組16只。

1.2 主要試劑 依達拉奉溶液由南京先聲藥業(yè)公司提供，規(guī)格5 ml∶10 mg。Ngb、14-3-3γ兔抗大鼠多克隆抗體分別購自武漢博士德、美國ABGENT公司，Ngb、14-3-3γ 的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購于武漢華美公司。

1.3 方法

1.3.1 制模及干預 模型組和依達拉奉預處理組采用石蠟線栓法制作大鼠右側大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，3.5%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠放在操作臺上，仰臥固定四肢，取頸部正中切口，剪毛消毒皮膚，剪開皮膚并鈍性分離組織肌肉，動作輕柔避免損傷刺激迷走神經，暴露頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈,結扎頸外動脈，從頸總動脈插線栓入頸內動脈，深度約20 mm，絲線固定，清創(chuàng)縫合傷口。缺血 2 h后再緩慢拔出栓子，使栓子頭端回到頸總動脈內即可。假手術組僅暴露右側頸總動脈后縫合，不做其余處理。依達拉奉預處理組于術前3 d開始，每日3 ml/kg體重分兩次腹腔注射依達拉奉溶液，直至動物解剖。假手術組和模型組均于同時間段腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.3.2 神經功能評分 參照5分制評分標準,待大鼠麻醉清醒后予以評分。0分，沒有神經功能缺失癥狀；1 分，輕度局灶性神經功能缺損(不能夠完全伸展左側前肢)；2分，中度局灶神經功能缺損(向左側轉圈)；3分，重度神經功能缺損(向左側傾斜)；4分，不能夠自發(fā)行走，意識水平降低。1～3分為模型制作成功，剔除死亡與不成功的動物并重新選取SD大鼠制模成功后補充。

1.3.3 血清采集及檢測 缺血再灌注24 h后用3.5%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉后經心臟取靜脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min后分離血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 ELISA 血清Ngb和14-3-3γ濃度檢測采用ELISA試劑盒按說明書進行操作。在450 nm波長測量光密度值(OD值)。以標準物濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，用Curve Exert1.3軟件制作標準曲線并計算出樣本的實際濃度值。

1.3.5 蘇木素-伊紅(HE)染色 隨機取10只大鼠麻醉后經左心室插管灌注生理鹽水，繼以4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注，待灌注充分后解剖分離出大腦，將大腦浸泡在4℃的4%多聚甲醛中固定24 h，逐級予乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片行HE染色。經脫蠟、脫水、蘇木素染色、伊紅液染色、封片后，置于200倍光學顯微鏡下觀察大腦梗死灶周邊區(qū)域。

1.3.6 免疫組化 取上述蠟塊行4 μm連續(xù)切片，經脫蠟，脫水，抗原修復，血清封閉后，加入抗Ngb(1∶200)、抗14-3-3γ(1∶100)的一抗，4℃孵育過夜。加生物素標記二抗孵育，清洗后再加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液孵育，二氨基聯苯胺(DAB)顯色后在光學顯微鏡下觀察。陰性對照除以PBS代替一抗外，余步驟相同。陽性表達為細胞質內出現棕黃色顆粒。選取梗死灶周邊的5個隨機視野(40×10倍)，用Image pro-plus 6.0軟件對選定的視野進行半定量檢測，測定每個視野的積分光密度值(IOD)和陽性面積(area)，計算平均積分光密度(IOD/area)。

1.3.7 蛋白免疫印跡 隨機取6只大鼠，麻醉后立即冰上取腦組織，加組織裂解液后勻漿、離心后提取總蛋白，考馬斯亮藍法定量蛋白,取5 μg 蛋白加入SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，確定片段大小后，電印跡轉染到聚偏氟乙烯膜，封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)室溫1 h，繼之用目的蛋白Ngb(1∶5 000)、14-3-3γ(1∶5 000)和GAPDH(1∶10 000)的一抗4℃過夜孵育，TBST沖洗，再用結合辣根過氧化物酶的二抗孵育。化學發(fā)光法顯現蛋白帶，拍照，用 Lab4.3對條帶進行密度分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件行成組t檢驗、單因素方差分析；兩組間差異比較當方差齊時采用SNK檢驗，方差不齊時采用Games-Howell檢驗。

2 結 果

2.1 HE染色結果 假手術組腦組織HE染色未見病理性改變。模型組的梗死灶內可見大量細胞壞死,組織溶解后留下空洞，梗死灶周圍均可見細胞數明顯減少、細胞腫脹,部分細胞的細胞核固縮、深染或溶解。依達拉奉預處理組梗死灶周圍的病理性損傷比模型組明顯減輕。見圖1。

2.2 血清Ngb 和14-3-3γ的濃度 模型組血清Ngb和14-3-3γ的濃度均高于假手術組(P<0.05)，而依達拉奉預處理組血清Ngb和14-3-3γ濃度均高于模型組(P<0.05)。見表1。

圖1 3組腦組織HE染色結果(×200)

組別Ngb14?3?3γ假手術組4123±794027±005模型組6694±11201)057±0101)依達拉奉預處理組11384±56701)2)095±0391)2)

與假手術組比較：1)P<0.05;與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.3 大腦Ngb和14-3-3γ的免疫組化表達 模型組大腦梗死灶附近的Ngb和14-3-3γ水平均高于假手術組(P<0.05)。相對于模型組，依達拉奉預處理組大腦的Ngb和14-3-3γ水平均明顯升高(P<0.05)。見表2，圖2，圖3。

2.4 大腦Ngb和14-3-3γ的蛋白表達 模型組患側大腦的Ngb和14-3-3γ蛋白表達均高于假手術組(P<0.05)。依達拉奉預處理組大腦的Ngb和14-3-3γ蛋白表達相對模型組均明顯升高(P<0.05)。見圖4，表3。

表2 3組大腦Ngb 和14-3-3γ的免疫組化表達

圖2 3組腦組織Ngb免疫組化(DAB，×200)

圖3 3組腦組織14-3-3γ免疫組化(DAB，×200)

組別Ngb14?3?3γ假手術組046±011035±016模型組068±0181)057±0211)依達拉奉預處理組094±0231)2)086±0241)2)

3 討 論

缺血性腦血管病病理生理機制復雜，其中腦缺血后再灌注損傷危害極大，腦缺血恢復血液再灌注后,其病理損傷反而進一步加重，而神經保護性蛋白能通過抑制凋亡等作用，從而防止或減輕缺血再灌注引起的腦損害，減少腦組織死亡和促進組織修復〔4〕。本研究結果說明依達拉奉對腦缺血再灌注大鼠具有神經保護作用，進一步研究發(fā)現，依達拉奉能促進腦缺血再灌注大鼠腦組織Ngb和14-3-3γ的生成。

14-3-3γ蛋白主要表達在中樞神經系統(tǒng)的星型膠質細胞和神經元中，研究發(fā)現，腦梗死患者梗死灶的14-3-3γ蛋白表達明顯升高，提示14-3-3γ蛋白在腦梗死灶發(fā)揮著重要作用〔5〕。在體外缺血模型中，14-3-3γ蛋白能抑制缺氧缺糖條件下神經元或星型膠質細胞的病理損傷及死亡〔6，7〕，本研究發(fā)現，依達拉奉能提高腦缺血灶的14-3-3γ蛋白表達，說明其腦保護作用機制之一是上調14-3-3γ的表達。Ngb是主要存在于神經系統(tǒng)內的一種攜氧球蛋白,類似于血紅蛋白、肌紅蛋白等，可以和氧氣、二氧化碳等多種氣體配體結合，但Ngb比血紅蛋白對氧具有更高的親和力〔8〕。通過人腦組織的免疫組化研究發(fā)現，腦卒中患者缺血半暗帶腦組織的Ngb表達較正常對照明顯增高〔9〕。Khan等〔10〕研究發(fā)現，過表達的Ngb能有效減少缺血再灌注小鼠的腦梗死面積，說明Ngb對缺血性腦卒中具有腦保護作用。本研究也說明其腦保護作用機制之一是促進Ngb的生成。

依達拉奉對Ngb和14-3-3γ的調節(jié)作用可能涉及以下機制：Ngb既是中樞神經系統(tǒng)的攜氧球蛋白，又是氧自由基的清除劑〔11〕；依達拉奉能清除缺血再灌注后的氧自由基，從而減少氧自由基對Ngb的消耗，促進Ngb的高表達。14-3-3γ蛋白在腦缺血再灌注中多作為一種信號傳導相關分子發(fā)揮作用〔3〕，Ye等〔12〕學者研究發(fā)現，沉默Ngb的表達會下調氧化損傷后神經細胞的14-3-3γ表達，說明Ngb對14-3-3γ的表達有促進作用。本研究中依達拉奉可上調腦缺血再灌注大鼠的腦組織14-3-3γ的表達，該作用機制可能與其上調Ngb表達進而促進14-3-3γ的生成有關。

通過本次研究發(fā)現，依達拉奉能上調腦缺血再灌注大鼠血清和大腦的Ngb和14-3-3γ蛋白表達，從而發(fā)揮神經保護作用。然而本研究主要是體內試驗，還需完善體外試驗進一步了解依達拉奉的調節(jié)機制，以期發(fā)現更多腦缺血的有效治療靶點和作用機制。

1 Kikuchi K,Tancharoen S,Takeshige N,etal.The efficacy of edaravone (radicut),a free radical scavenger,for cardiovascular disease〔J〕.Int J Mol Sci,2013;14(7):13909-30.

2 李呂力,韋俊杰,李曉峰,等.依達拉奉對腦缺血再灌注大鼠血管細胞黏附分子1的影響〔J〕.中華老年心腦血管病雜志,2015;17(5):519-21.

3 Dong Y,Zhao R,Chen XQ,etal.14-3-3gamma and neuroglobin are new intrinsic protective factors for cerebral ischemia〔J〕.Mol Neurobiol,2010;41(2-3):218-31.

4 Nour M,Scalzo F,Liebeskind DS.Ischemia-reperfusion injury in stroke〔J〕.Interv Neurol,2013;1(3-4):185-99.

5 Kawamoto Y,Akiguchi I,Tomimoto H,etal.Upregulated expression of 14-3-3 proteins in astrocytes from human cerebrovascular ischemic lesions〔J〕.Stroke,2006;37(3):830-5.

6 Lai XJ,Ye SQ,Zheng L,etal.Selective 14-3-3γ induction quenches p-β-catenin Ser37/Bax-enhanced cell death in cerebral cortical neurons during ischemia〔J〕.Cell Death Dis,2014;5(4):e1184.

7 Ying P,Chao RC,Kai G,etal.Ischemia preconditioning protects astrocytes from ischemic injury through 14-3-3γ〔J〕.J Neurosci Res,2015；93(10):1507-18.

8 Burmester T,Weich B,Reinhardt S,etal.A vertebrate globin expressed in the brain〔J〕.Nature,2000;407(6803):520-3.

9 Kunlin J,Ying M,Xiao M,etal.Neuroglobin expression in ischemic stroke〔J〕.Stroke,2010;41(3):557-9.

10 Khan AA,Wang Y,Sun Y,etal.Neuroglobin-overexpressing transgenic mice are resistant to cerebral and myocardial ischemia〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2006;103(47):17944-8.

11 Shang A,Yang Y,Wang H,etal.Upregulation of neuroglobin expression and changes in serum redox indices in a rat model of middle cerebral artery occlusion〔J〕.Mol Med Rep,2015;12(2):1693-8.

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〔2016-06-07修回〕

(編輯 郭 菁)

Effect of edaravone on neuroglobin and 14-3-3γ protein in rats with middle cerebral artery ischemia-reperfusion

WEI Jun-Jie,LI Lü-Li,LI Xiao-Feng,etal.

Department of Neurology,Guangxi Zhuang Autonomous Region People's Hospital,Nanning 530021,Guangxi,China

Objective To explore the effect of edaravone on neuroglobin(Ngb) and 14-3-3γ protein in rats with middle cerebral artery ischemia-reperfusion(I/R).Methods Rat model of I/R and reperfusion were established by the cerebral artery occlusion method. 48 male SD rats were randomly divided into sham operation,model and edaravone-pretreated groups. The expressions of Ngb and 14-3-3γ were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),immunohistochemistry and Western blot.Results The Ngb and 14-3-3γ levels of brain and serum in model group were higher than those of sham operation group (P<0.05),while Ngb and 14-3-3γ expressions were higher in edaravone-pretreated group compared to those of model group (P<0.05). Conclusions Edaravone has a protective effect against middle cerebral artery I/R by enhancing Ngb and 14-3-3γ.

Edaravone;Cerebral ischemia-reperfusion;Cerebral artery occlusion;Neuroglobin;14-3-3γ protein

國家自然科學基金(81460192);廣西自然科學基金項目(2011GXNSFA018185)

李呂力(1959-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事腦血管疾病研究。

韋俊杰(1987-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事腦血管疾病研究。

R743.3

A

1005-9202(2017)10-2394-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.004