七氟烷對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬神經元蛋白質損傷和聚集的影響

鄧茹云 劉 楠 樸美花 李紹臣 劉 明 馮春生

(吉林大學第一醫(yī)院麻醉科，吉林 長春 130021)

七氟烷對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬神經元蛋白質損傷和聚集的影響

鄧茹云1劉 楠 樸美花 李紹臣1劉 明2馮春生

(吉林大學第一醫(yī)院麻醉科，吉林 長春 130021)

目的 探討吸入麻醉藥七氟烷對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬組織神經元蛋白質損傷和聚集的影響。方法 12月齡APP/PS1雙轉基因小鼠隨機分為兩組各30只：對照組小鼠給予2 L/min氧氣吸入4 h；七氟烷組小鼠給予2%七氟烷吸入麻醉4 h。部分小鼠麻醉后6 h應用末端脫氧核苷酸轉移酶(TUNEL)法檢測海馬神經元凋亡情況，應用二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)檢測活性氧(ROS)水平；部分小鼠麻醉后24 h應用免疫組織化學法(IHC)和Western印跡法檢測海馬神經元內氧化損傷蛋白質(蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸蛋白和Aβ42)的表達，應用TEM觀察海馬神經元內蛋白質聚集物。結果 七氟烷組小鼠海馬神經元凋亡率、ROS水平、蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸蛋白和Aβ42的表達水平均高于對照組，蛋白質聚集物增多(P<0.05)。結論 12月齡APP/PS1雙轉基因小鼠給予2%七氟烷麻醉4 h，能夠加劇其海馬神經元氧化應激損傷，促進蛋白質損傷和聚集，誘導海馬神經元凋亡，加重阿爾茨海默病(AD)的神經病理損害。

七氟烷；蛋白質損傷；蛋白質聚集；細胞凋亡；神經毒性

蛋白質聚集是伴隨阿爾茨海默病(AD)神經元變性過程的主要病理特征之一，研究表明β淀粉樣蛋白(Aβ)、tau蛋白和氧化損傷蛋白等蛋白質毒性聚集能夠激活凋亡相關級聯(lián)信號通路，導致神經元凋亡，加重AD的神經病理損害〔1～4〕。研究發(fā)現(xiàn)全身麻醉與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關，麻醉藥七氟烷能夠誘導海馬神經元凋亡，引起認知功能損害，加重AD神經病理進程〔5,6〕，但其機制是否與誘導海馬神經元中異常蛋白質損傷和聚集相關還不清楚。本研究應用APP/PS1雙轉基因小鼠，探討吸入麻醉藥七氟烷對AD小鼠海馬組織神經元中蛋白質損傷和蛋白聚集的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 12月齡APP/PS1雙轉基因小鼠購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，雌雄各半，標準實驗室條件(白天/黑夜12 h∶12 h，溫度18℃～25℃,濕度60%，4～5只/籠)飼養(yǎng)。七氟烷購自中國上海雅培公司；末端脫氧核苷酸轉移酶(TUNEL)試劑盒購自瑞士Roche公司；二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)購自美國Sigma公司；小鼠β-actin、抗核抗體(DNP)、抗Nitrotyrosin抗體以及抗Aβ42抗體均購自美國Abcam公司。

1.2 分組 小鼠隨機分為兩組各30只，對照組小鼠置于持續(xù)通入2 L/min氧氣的麻醉箱中4 h；七氟烷組小鼠置于麻醉箱中給予2%的七氟烷麻醉4 h。麻醉箱中放置二氧化碳吸收劑、加溫毯和紅外線燈，麻醉過程中小鼠保持自主呼吸，監(jiān)測肛溫、血壓、心率和血氧飽和度。應用紅外線吸收裝置監(jiān)測麻醉箱流出氣體中七氟烷、氧氣和二氧化碳的濃度。麻醉后吸入純氧3 L/min，小鼠翻正反射恢復20 min后提示蘇醒，將所有小鼠放回其各自籠中。

1.3 海馬神經元凋亡檢測 麻醉后6 h，兩組分別隨機抽取6只小鼠，腹腔注射麻醉藥后暴露心臟，冰冷磷酸鹽緩沖液(PBS)穿心灌注直至肝臟顏色變白，迅速取鼠腦，沿中線將其分為左右兩部分。左半腦組織先于干冰中冷凍5 min，-80℃儲存。右半腦組織經4%多聚甲醛固定后行石蠟包埋、切片(4 μm)。切片于室溫下經過常規(guī)脫蠟水合后依照TUNEL試劑盒說明書，應用TUNEL試劑盒依次操作。應用光學顯微鏡觀察海馬組織切片中神經元凋亡情況。

1.4 海馬神經元內活性氧(ROS)水平檢測 將小鼠左半海馬組織從-80℃冰箱中取出，加入勻漿緩沖液后離心，取上清液與10 μmol/L的DCFH-DA工作液混合，37℃孵育20 min，PBS沖洗3次以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA，最后經離心去上清后獲得目的細胞，檢測細胞內DCFH熒光強度。

1.5 免疫組織化學法(IHC)檢測海馬神經元內氧化損傷蛋白質蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸蛋白和Aβ42表達水平 麻醉后24 h，兩組分別隨機抽取6只小鼠，腹腔注射麻醉藥麻醉后暴露心臟，冰冷PBS穿心灌注直至肝臟顏色變白，迅速取鼠腦，沿中線將其分為左右兩部分。左半腦組織-80℃儲存，右半腦組織經4%多聚甲醛固定后行石蠟包埋、切片(4 μm)。切片經常規(guī)脫蠟、水化、抗原熱修復后再經PBS沖洗，滴加牛血清白蛋白，去除多余液體后分別滴加抗DNP抗體、抗Nitrotyrosin抗體和抗Aβ42抗體，4℃冰箱中孵育過夜，PBS沖洗后滴加二抗，37℃濕盒中孵育30 min，PBS沖洗后滴加錠霉卵白介素+辣根酶標記生物素(SABC)，37℃孵育30 min，PBS沖洗后滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，蒸餾水沖洗后蘇木素復染，脫水封片。應用光學顯微鏡觀察海馬神經元內蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸蛋白和Aβ42的表達。

1.6 檢測Western印跡法 海馬神經元內蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸蛋白和Aβ42表達水平 將小鼠左半海馬組織從-80℃冰箱中取出，加入細胞裂解液15 min后離心，取其上清液，應用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒分別測定各待檢蛋白質濃度，確定上樣量后依次進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳、轉膜、封閉1 h后Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，分別加入抗DNP抗體、抗Nitrotyrosin抗體和抗Aβ42抗體，孵育過夜，TBST洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h后TBST洗膜，最后聚偏氟乙烯(PVDF)膜經發(fā)光顯色處理并壓片成像。β-actin作為內參照，以樣本中目標條帶光密度與相應內參光密度的比值反映各蛋白質表達水平。

1.7 海馬神經元內蛋白質聚集物檢測(透射電鏡法) 麻醉后24 h，兩組各隨機抽取6只小鼠，殺鼠取其海馬組織，置于2.5%戊二醛低溫(4℃)固定過夜，經PBS充分漂洗后再置于1%鋨酸固定2 h，蒸餾水充分漂洗后再依次進行不同濃度的乙醇逐級脫水和包埋固化，最后應用超薄切片機切片，超薄切片(120 nm)經醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，應用透射電鏡觀察海馬神經元各蛋白質聚集物。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 兩組海馬神經元凋亡情況 對照組海馬神經元凋亡率(29.4%±4.5%)顯著低于七氟烷組(39.7%±5.5%，P<0.05)。見圖1。

2.2 兩組海馬神經元內ROS水平比較 與對照組(767.1±72.4)比較，七氟烷組小鼠海馬神經元中DCF熒光強度(1 050.5±104.8)明顯增加(P<0.05)，代表ROS水平增高。

2.3 IHC檢測兩組海馬神經元內蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白表達水平 七氟烷組海馬神經元內可見大量氧化損傷蛋白質表達，與對照組比較，蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白的表達水平顯著增高(P<0.01)。見圖2和圖3。

圖1 兩組海馬神經元凋亡情況(TUNEL法，×400)

圖2 兩組小鼠海馬組織蛋白羰基化合物表達水平(IHC，×40)

圖3 兩組小鼠海馬組織硝基化酪氨酸蛋白表達水平(IHC，×40)

2.4 Western印跡檢測兩組海馬神經元內蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白表達水平 對照組與七氟烷組小鼠海馬組織中蛋白羰基化合物的表達水平分別為(21.2%±4.8%)和(92.3%±11.4%)，硝基化酪氨酸蛋白的表達水平分別為(28.3%±5.5%)和(87.7%±10.6%)；與對照組比較，七氟烷組小鼠海馬組織中蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白的表達均顯著增高(P<0.01)。見圖4。

2.5 透射電鏡檢測兩組海馬神經元內蛋白質聚集物 透射電鏡下可見七氟烷組小鼠海馬組織切片中神經元內存在大量蛋白質聚集物，與對照組比較，七氟烷組小鼠海馬神經元中蛋白質聚集水平明顯增高(P<0.01)。見圖5。

2.6 兩組海馬神經元Aβ42表達水平比較 IHC和Western印跡檢測結果均顯示七氟烷組小鼠海馬CA1區(qū)Aβ42的表達(72.4±9.1)較對照組(22.3±4.75)明顯增高(P<0.01)。見圖6，圖7。

圖4 兩組小鼠海馬組織蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白表達水平(Western印跡)

圖5 兩組小鼠海馬神經元中蛋白質聚集電鏡檢測結果

圖6 兩組小鼠海馬CA1區(qū)Aβ42表達水平(IHC，×400)

圖7 兩組小鼠海馬CA1區(qū)Aβ42表達水平(Western印跡)

3 討 論

氧化應激損傷在AD發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，研究顯示氧化應激能夠引起ROS生成增加，ROS具有高度的氧化活性，AD腦內蛋白質能被ROS氧化，發(fā)生羰基化和硝基化修飾，生成蛋白質羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白〔7～9〕。氧化損傷時蛋白質經不可逆的羰基化修飾生成蛋白質羰基化合物，能夠導致羰-氨反應,使蛋白質發(fā)生分子內或分子間的交聯(lián)，影響其正常的結構和功能，導致蛋白質毒性聚集。研究發(fā)現(xiàn)AD時，海馬組織中神經元和神經膠質細胞中氧化蛋白羰基化合物含量增加，蛋白質羰基化在老年斑和神經原纖維纏結形成過程中發(fā)揮重要作用，與AD神經病理進程相關〔8〕。蛋白質硝基化修飾即氧化應激時特定蛋白質酪氨酸殘基發(fā)生硝基化反應，生成毒性代謝產物硝基化酪氨酸蛋白，改變了原蛋白質結構，影響其生理功能，導致凋亡相關的信號通路活化，誘導細胞凋亡〔9〕。蛋白質羰基化和酪氨酸硝基化是AD病理機制中上游分子病因。因此，蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白的檢測已成為判定AD神經病理進程中氧化應激損傷的主要指標。

蛋白質聚集是AD神經元變性過程的主要病理特征之一，大量異常蛋白(Aβ、Tau和氧化損傷蛋白等)的毒性聚集能夠活化凋亡相關級聯(lián)信號通路，介導AD 病理機制〔3〕。Aβ在AD的發(fā)病機制中發(fā)揮核心作用，由淀粉樣前體蛋白經β、γ等分泌酶裂解而形成，沉積于大腦皮層和海馬等腦區(qū)細胞外形成老年斑，其中Aβ42神經毒性更強、更容易聚集，對AD發(fā)病具有重要意義。AD時Aβ聚集能夠直接損傷線粒體，導致能量代謝障礙，釋放細胞色素C并激活caspase-3等凋亡因子，引起神經元凋亡。此外，Aβ聚集能夠引起氧化應激，ROS病理性增高致使氧化損傷蛋白質羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白表達異常增加，誘導Aβ等蛋白質過度聚集；同時，蛋白質聚集過程中產生ROS，進一步加重氧化應激，形成惡性循環(huán)，導致神經元變性和凋亡，加劇AD神經病理進程〔3,10,11〕。

吸入麻醉藥七氟烷是目前最常用全身麻醉藥物，研究顯示七氟烷暴露能夠導致海馬等腦區(qū)神經元凋亡，引起學習記憶損傷，加劇病情進展〔3,6〕。研究發(fā)現(xiàn)3%七氟烷麻醉6 h能夠增加AD腦內Aβ42等蛋白質聚集和tau蛋白磷酸化，激活caspase級聯(lián)凋亡信號通路，引起神經元凋亡〔12〕。本研究結果表明臨床相關濃度七氟烷麻醉能夠與神經變性相關蛋白質相互作用，促進Aβ42生成和聚集，誘導細胞凋亡。研究表明，七氟烷暴露能夠降低細胞存活率，活化caspase-3，增強bax表達，抑制bcl-2表達，增加Aβ表達水平，促進神經元凋亡〔12,13〕。動物研究顯示2%七氟烷麻醉5 h能夠誘導18月齡SD大鼠海馬內質網應激和神經元凋亡相關信號通路的活化，引起其認知功能損害〔3〕。本研究結果表明七氟烷具有AD相關神經毒性，七氟烷暴露能夠誘導AD小鼠海馬神經元中ROS生成增加，加劇氧化應激損傷，增加氧化損傷相關蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白生成，促進Aβ42毒性聚集，誘導神經細胞凋亡，促進AD神經病理損害。

1 Xie Z,Xu Z.General anesthetics and β-amyloid protein〔J〕.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2013;(47):140-6.

2 Wang JZ,Xia YY,Grundke-Iqbal I,etal.Abnormal hyperphosphorylation of tau:sites,regulation,and molecular mechanism of neurofibrillary degeneration〔J〕.J Alzheimers Dis,2013;33(1):S123-39.

3 Chen G,Gong M,Yan M,etal.Sevoflurane induces endoplasmic reticulum stress mediated apoptosis in hippocampal neurons of aging rats〔J〕.PLoS One,2013;8(2):e57870.

4 Jiang T,Sun Q,Chen S.Oxidative stress:a major pathogenesis and potential therapeutic target of antioxidative agents in Parkinson's disease and Alzheimer's disease〔J〕.Prog Neurobiol,2016;147(1):1-19.

5 Vanderweyde T,Bednar MM,Forman SA,etal.Iatrogenic risk factors for Alzheimer's disease:surgery and anesthesia〔J〕.J Alzheimers Dis,2010;22(3):91-104.

6 Jiang J，Jiang H.Effect of the inhaled anesthetics isoflurane,sevoflurane and desflurane on the neuropathogenesis of Alzheimer's disease(review)〔J〕.Mol Med Rep,2015;12(1):3-12.

7 Borza LR.A review on the cause-effect relationship between oxidative stress and toxic proteins in the pathogenesis of neurodegenerative diseases〔J〕.Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi,2014;118(1)：19-27.

8 Li F,Yang Z,Lu Y,etal.Malondialdehyde suppresses cerebral function by breaking homeostasis between excitation and inhibition in turtle Trachemys scripta〔J〕.PLoS One,2010;5(12):e15325.

9 Guix FX,Ill-Raga G,Bravo R,etal.Amyloid dependent triosephosphate isomerase nitrotyrosination induces glycation and tau fibrillation〔J〕.Brain,2009;132(5):1335-45.

10 Zuo L,Hemmelgarn BT,Chuang CC,etal.The role of oxidative stress induced epigenetic alterations in amyloid-β production in Alzheimer's disease〔J〕.Oxid Med Cell Longev,2015;2015:604658.

11 Szarka A.The role of β-amyloid and mitochondrial dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease〔J〕.Ideggyogy Sz,2015;68(7-8):222-8.

12 Dong Y,Zhang G,Zhang B,etal.The common inhalational anesthetic sevoflurane induces apoptosis and increases beta-amyloid protein levels〔J〕.Arch Neurol,2009;66(5):620-31.

13 Qiu JL,Shi PC,Mao WD,etal.Effect of apoptosis in neural stem cells treated with sevoflurane〔J〕.BMC Anesthesiol,2015;15(1):25.

〔2016-11-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

Effects of the neuronal protein damage and aggregation induced by inhaled anesthetic sevoflurane in the APP/PS1 transgenic mouse hippocampus

DENG Ru-Yun,LIU Nan,PIAO Mei-Hua,etal.

Department of Anesthesiology,First Hospital of Jilin University,Changchun 130021,Jilin,China

Objective To investigate the effects of the neuronal protein damage and aggregation induced by inhaled anesthetic sevoflurane in the APP/PS1 transgenic mice hippocampus.Methods 60 APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into control and sevoflurane groups. TUNEL and DCFH-DA were applied to detect the hippocampal neuronal apoptosis and ROS level respectively,immunohistochemical method and Western blot were applied to detect Aβ42 level,carbonyl compounds and nitrotyrosine,TEM was applied to observe the protein aggregation.Results Compared with those of control group,the neuronal apoptosis rate,expression levels of ROS,Aβ42,oxidative protein carbonyl compounds and nitrotyrosine were significantly increased in sevoflurane group(P<0.05).Conclusions 2% sevoflurane exposure for 4 hours significantly aggravates the oxidative-stress injury of hippocampal neuron,hippocampal protein damage and aggregation,guides neuronal apoptosis,exacerbates neuropathology injury.

Sevoflurane;Protein damage;Protein aggregation;Apoptosis;Neurotoxicity

國家自然科學基金資助課題(No.81271215,81141065)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(No.20150101170JC)；中國博士后科學基金項目(No.2016M591489)

馮春生(1971-)，男，教授，碩士生導師，主要從事麻醉對腦功能和腦疾病的影響及相關機制研究。

鄧茹云(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事全身麻醉藥物對阿爾茨海默病發(fā)病機制的研究。

R614.21

A

1005-9202(2017)10-2344-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.002

1 大慶油田總醫(yī)院麻醉科 2 吉林省前衛(wèi)醫(yī)院