GABRP基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病易感性的相關性

歐運超 宋繼權 裴 颯 彭瑋慧

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·論著·

GABRP基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病易感性的相關性

歐運超 宋繼權 裴 颯 彭瑋慧

目的： 明確γ氨基丁酸A受體π亞基(GABRP)基因單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)發(fā)病易感性之間的關系。方法： PCR擴增111例SLE患者和120名正常對照者外周血目的基因片段,通過二代測序對目的基因片段進行測序檢測rs929763位點和rs3805455位點的多態(tài)性。結果： GABRP rs929763TT、AT基因型頻率在SLE組與對照組中分別為99.1%、0.9%和95.8%、4.2%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。GABRP rs3805455AG、AA、GG基因型頻率在SLE組與對照組中分別為45.0%、9.9%、45.0%和45.8%、8.3%、45.0%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，A、G等位基因頻率在SLE組與對照組中分別為32.4%、67.5%和50.0%、50.0%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論： GABRP 基因SNP位點rs929763和rs3805455多態(tài)性可能與SLE的發(fā)病無關。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡； 單核苷酸基因多態(tài)性； γ氨基丁酸A受體π亞基

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)是一種多系統(tǒng)損害的結締組織病，發(fā)病機制尚不完全明確，目前研究表明，遺傳和環(huán)境在發(fā)病中都發(fā)揮了重要作用[1,2]。γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA) 是一種存在于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質，最近幾年，關于GABA及其受體在外周非神經(jīng)組織如腫瘤組織、淋巴組織等中表達，從而介導胞內信號傳導對細胞的調控成為研究熱點[3]。最近國外有研究報道，GABRP基因多態(tài)性與SLE發(fā)病具有相關性[4]。本文主要研究中國地區(qū)GABRP基因rs929763位點和rs3805455位點多態(tài)性與SLE的相關性，以探討GABRP基因在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機制中的作用。為其進一步研究提供參考依據(jù)。同時為中樞神經(jīng)遞質在結締組織疾病領域的研究提供新的視野。

1 材料和方法

1.1 研究對象 111例SLE女性患者資料均收集于2015年6月至2016年4月武漢大學中南醫(yī)院和武漢大學人民醫(yī)院門診和住院患者，平均年齡45.2歲，以1982年美國風濕病學會修訂的SLE分類標準為診斷標準。正常對照組120名女性，為武漢大學中南醫(yī)院體檢中心健康體檢者，平均年齡40.1歲，并排除SLE、干燥綜合征、類風濕關節(jié)炎、皮肌炎等自身免疫病，且一、二、三級親屬無SLE患者，研究對象間均無親緣關系。本研究已通過武漢大學中南醫(yī)院倫理委員會批準，并在實施過程中遵守赫爾辛基宣言，所有病例及對照均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 5424臺式離心機(Eppendorf公司)，S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國BIO-RAD公司)，DYY-6C 電泳儀(北京六一儀器廠)，Tanon 1600 凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；2xTsingKe Master Mix(北京擎科新業(yè)生物技術有限公司)，GABRP等位基因序列特異性引物由武漢達邦生物科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 取受檢者外周靜脈血5 mL，標本于4℃冰箱中貯存，3天內進行DNA提取。

1.3.2 提取DNA 采用苯酚-蛋白酶K法提取外周血基因組DNA，采用紫外分光光度計測定DNA含量及濃度，A260/A280>1.8。

1.3.3 特異性PCR擴增 參照文獻[4]方法擴增GABRP基因rs929763位點：上游引物5'-TCCAGGTGTCTGGAGAGAGG-3'，下游引物5' -CAGCAGGGGCTCTAATCTTG-3'，PCR擴增條件：94℃預變性3 min 后，94℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR擴增片段為236 bp；以及rs3805455位點：上游引物5' -GCTGGCCCTGAGTACTGAAC-3'，下游引物5' -CTCTGGCTGGATTTGGAGAG-3'， PCR擴增條件：94℃預變性3 min 后，94℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR擴增片段為272 bp。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳 PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含溴乙啶)電泳，經(jīng)紫外光透射在泳道中見明顯DNA條帶為陽性。

1.3.5 二代測序 將DNA樣本進行上機測序(此過程由武漢達邦生物科技有限公司完成)。

1.3.6 統(tǒng)計學方法 采用直接計數(shù)法分別對SLE組和正常組進行等位基因和基因型頻率進行統(tǒng)計，用SPSS 17.0軟包件進行χ2檢驗。SLE組及正常對照組間的等位基因頻率及基因型頻率進行卡方檢驗分析，當P<0.05即有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 rs929763位點和rs3805455位點PCR條帶瓊脂糖凝膠電泳圖 對GABRP基因的rs929763位點PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖，可見到明亮的、單一的236 bp的目的基因條帶，沒有非特異性擴增產(chǎn)物；對GABRP基因的rs3805455位點PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖，可見到明亮的、單一的272 bp的目的基因條帶，沒有非特異性擴增產(chǎn)物(圖1)。

圖1 rs929763位點(左側箭頭所示)和rs3805455位點(右側箭頭所示)PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖

2.2 rs929763位點和rs3805455位點的多態(tài)性與SLE的相關性分析

2.2.1 rs929763位點和rs3805455位點的Hardy-weinberg檢驗 根據(jù)Hardy-Weinberg定律算出各基因型的理論頻數(shù)，統(tǒng)計學分析，SLE組、對照組兩位點的P值均大于0.05，說明群體基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)來自同一孟德爾群體。

2.2.2 rs929763位點和rs3805455位點的基因型頻率及等位基因頻率 GABRP rs929763TT、AT基因型頻率在SLE組與對照組中分別為99.1%、0.9%和95.8%、4.2%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。GABRP rs3805455AG、AA基因型頻率在SLE組與對照組中分別為45.0%、9.9%和45.8%、8.3%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，A、G等位基因頻率在SLE組與對照組中分別為32.4%、67.5%和50.0%、50.0%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。具體見表1。

表1 GABRP基因多態(tài)性在SLE患者和對照組的分布

2.2.3 rs929763位點和rs3805455位點基因擴增產(chǎn)物測序圖 為進一步驗證二代測序結果的準確性，隨機選擇SLE組rs929763位點和rs3805455位點7個樣本進行一代測序(圖2、3)，測序結果提示兩位點基因突變(箭頭處)。

圖2 rs929763位點基因擴增產(chǎn)物測序圖

圖3 rs3805455位點基因擴增產(chǎn)物測序圖

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是由多種因素所致并累及全身多臟器的系統(tǒng)性自身免疫病，研究表明遺傳、環(huán)境、性激素代謝異常、免疫失衡在發(fā)病中起重要作用。其中遺傳因素在SLE的發(fā)病中扮演重要角色，近年來，隨著人類基因組計劃的完成，使得SLE這一基因病在尋找易感位點成為可能。SLE易感基因的定位研究受到遺傳異質性、臨床表現(xiàn)異質性、外顯率低和民族背景多樣性的影響。所以基因多態(tài)性與SLE的相關性之間形成了非常復雜的網(wǎng)絡。

γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA) 是一種存在于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要抑制性神經(jīng)遞質，其受體根據(jù)對激動劑及拮抗劑的敏感性分為三種類型：GABAA、GABAB、GABAC，其中GABAA受體是哺乳動物大腦中含量最高同時也是發(fā)揮作用最重要的受體，扮演著除神經(jīng)傳導功能及神經(jīng)調節(jié)功能外的多種角色。迄今為止，已在哺乳動物大腦中發(fā)現(xiàn)至少19個GABAA受體亞單位，分別由不同的基因對其編碼，不同亞基組成的受體產(chǎn)生不同的生理效應[5]。最近幾年，γ氨基丁酸在外周組織中的調節(jié)作用成為研究熱點，在腫瘤方面，美國Hildegard等[6]研究發(fā)現(xiàn)刺激性γ氨基丁酸B型受體信號作為異常的靶點，可以用于治療和預防胰腺癌。在免疫方面，Bhat和Soltani等[7,8]研究者報道了GABA可從老鼠巨噬細胞、T淋巴細胞中提取，Stuckey等[9]研究者報道了GABA可從人類外周血巨噬細胞中提取。GABA與自身免疫性疾也有一定的關聯(lián)，Tian等[10]在模擬類風濕性關節(jié)炎的老鼠中給予口服GABA，能夠減輕其關節(jié)炎癥反應，可能的機制是GABA抑制T細胞增殖，抑制抗原提成細胞的功能，減少血液中IgG2a抗體的產(chǎn)生，最終改善類風濕性關節(jié)炎患者的炎癥反應。Nigam等[11]研究者發(fā)現(xiàn)給銀屑病患者口服GABA類似物加巴噴丁和普瑞巴林可提高治療效果，其可能機制是GABA抑制巨噬細胞釋放TNF-α，從而減輕炎癥反應。

韓國Kim等[4]研究者通過觀察164例SLE患者和528名健康對照，選擇GABRP基因的六個SNP位點(rs929763、rs732157、rs2303134、rs1063310、rs3805455和rs3828619)，采用高分辨熔解曲線(high-resolution melt，HRM)對DNA樣本SNP位點進行分析，提示rs929763、rs732157、rs3805455和rs3828619四個位點的基因型頻率在SLE組與對照組具有顯著差異(P<0.0001)；rs929763、rs3805455和rs3828619三個位點的等位基因頻率在SLE組與對照組具有顯著差異(P=0.0005)，以上結果提示GABRP基因的上述SNP位點與SLE的發(fā)病具有相關性。作者為進一步驗證性別在SLE中是否為發(fā)病的重要因素，單獨統(tǒng)計了152例SLE女性患者的六個位點，結果提示rs929763、rs3805455和rs3828619三個位點的基因型頻率在女性SLE組與女性對照組具有顯著差異(P<0.0001)；采用卡方檢驗估算了rs929763、rs732157、rs2303134、rs1063310和rs3805455五個位點在SLE組和對照組中的單倍型頻率，結果提示單倍型(TCACC)在SLE組與對照組比較具有顯著差異(P=0.038)。

GABRP基因在腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面研究較多，但目前國內沒有關于SLE的相關性研究，為進一步證實該位點在中國漢族人群SLE發(fā)病的相關性，本實驗通過觀察111例SLE患者和120名健康對照，選擇兩個SNP位點(rs929763和rs3805455)，采用高通量基因分型對DNA樣本SNP位點進行分析，結果顯示GABRP rs929763TT、AT基因型頻率在SLE組與對照組中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。GABRP rs3805455AG、AA、GG基因型頻率在SLE組與對照組中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，A、G等位基因頻率在SLE組與對照組中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。故GABRP基因與SLE的發(fā)病無相關性，GABRP SNP位點rs929763和rs3805455基因多態(tài)性可能不是中國漢族人群SLE的易感基因。

本研究與已報道的檢測結果不一致分析原因可能與種族、地域、實驗方法等因素有關。同時本研究存在以下不足：實驗組和對照組樣本量選擇相對較少、位點選擇偏少、人種單一等。GABRP基因多態(tài)性與SLE的關系有待通過增加樣本量、選擇更多相關位點及擴大區(qū)域研究來綜合分析。

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(收稿：2016-11-06 修回：2016-12-21)

Association between GABRP gene polymorphisms and systemic lupus erythematosus

OUYunchao,SONGJiquan,PEISa,PENGWeihui.

DepartmentofDermatology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China

SONGJiquan,E-mail:songjiq@126.com

Objective: To determine the association between the polymorphisms of the GABRP gene and systemic lupus erythematosus (SLE). Methods: The aim gene fragment extracted from the peripheral blood DNA of 111 SLE patients and 120 healthy controls was amplified by PCR. The single nucleotide polymorphism (SNP) in the GABRP gene at rs929763 and rs3805455 was detected by next generation sequencing. Results: The genotype frequencies of rs929763 TT, AT and rs3805455 AG, AA and GG in the patients were 99.1%, 0.9% and 45.0%, 9.9% and 45.0%, those in controls were 95.8%, 4.2% and 45.8%, 8.3% and 45.0% respectively. The allele frequencies of A and G in the patients were 32.4% and 67.5% and those in controls were 50.0% and 50.0%. There were no significant differences of AG, AA and GG frequencies between the patients and controls (P>0.05). Conclusion: There was no association between polymorphism of rs929763 and rs3805455 in the GABRP gene with SLE.

systemic lupus erythematosus; single nucleotide polymorphism; gamma-aminobutyric acid

湖北省自然科學基金資助項目(編號：2013CFB263)

武漢大學中南醫(yī)院皮膚科，430071

宋繼權，E-mail: songjiq@126.com