粽葉中多糖的提取分離和光譜分析

申湘忠

（湖南人文科技學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)系，湖南 婁底 417000）

粽葉分兩種，一種葦葉，另一種箬葉，主要分布于長江以南各省丘陵地區(qū)。在我國南方大部分地區(qū)一直用箬葉包粽子，就是利用其特殊的竹香味和防腐作用。它含有大量對人體有益的葉綠素和多種氨基酸等成份，可提取天然香精香料和食品添加劑，還可用于包裝其他的食品及作餐桌上的裝飾和食物的陪襯。

多糖是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞壁中，是生物體內(nèi)除核酸和蛋白質(zhì)以外的又一類重要的生物分子?？茖W(xué)研究已經(jīng)確認(rèn)糖類物質(zhì)具有許多生物活性，包括抗腫瘤、免疫、降血糖和抗病毒等。中藥多糖因具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及抗腫瘤降血糖等藥理作用，而且?guī)缀鯖]有毒性與副作用，因此引起國內(nèi)外藥理學(xué)家、生物學(xué)家和化學(xué)家們的關(guān)注[1-14]。研究以粽葉為原料，通過提取和分離其中的多糖，并對產(chǎn)品進(jìn)行定性分析和光譜分析，為實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)儀器和試劑

試驗(yàn)儀器包括FT-IR360紅外光譜儀（美國尼高力公司）；UV-2501分光光度計(jì)（日本島津）；7200分光光度計(jì)；RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；HH-2電熱恒溫水浴鍋；101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱；HB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵；FA2104（N）系列電子天平；QE-04A大功率粉碎機(jī)。

試驗(yàn)試劑包括石油醚（AR）；無水乙醇（AR）；濃硫酸（AR）；苯酚溶液（6%）；標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖（AR）；SephadexG-100葡聚糖（AR）。試驗(yàn)材料為粽葉，采集于婁底農(nóng)村。

1.2 提取純化工藝流程

新鮮粽葉→洗凈晾干→50℃烘干→粉碎→用石油醚回流脫脂→用80%乙醇回流除去單糖和低聚糖等干擾性成分→微波加熱提取→減壓濃縮→sevag法去蛋白→透析→醇析→離心處理→無水乙醇、丙酮、無水乙醚除雜、脫水→sephadexG-100柱層析純化→真空干燥→粽葉多糖純品。

1.3 試驗(yàn)材料的預(yù)處理

從婁底采集新鮮粽葉若干，洗凈晾干之后放入電熱鼓風(fēng)干燥箱50℃的條件下烘干，烘干之后用手輕輕碾碎然后轉(zhuǎn)入粉碎機(jī)中打成粉末狀，之后過篩取55目粽葉粉保存于干燥的棕色試劑瓶中待用。

1.4 樣品的制備

取粽葉粉末50 g，加入一定體積的石油醚脫脂，殘?jiān)L(fēng)干。殘?jiān)僖?0倍體積的95%乙醇水浴回流2次，每次3 h，溫度為90℃?；厥找掖迹〕鰵?jiān)?，使溶劑于空氣中自然揮發(fā)。在殘?jiān)屑尤?00 mL蒸餾水，于90℃水浴中回流提取，重復(fù)3次，各次提取時(shí)間分別為2.5、2、1.5 h。每次提取后均趁熱過濾，合并3次濾液為粗提液（約500 mL），取1.0 mL測吸光度，計(jì)算多糖含量。將粗提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮。

1.5 粗多糖的處理

sevage法去蛋白：根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)，按多糖溶液∶氯仿∶正丁醇＝1∶0.2∶0.04的比例混勻，劇烈振搖20～30 min，蛋白質(zhì)與氯仿－正丁醇生成凝膠物而分離，離心，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)，反復(fù)多次，直至沒有凝膠物生成為止。收集上層溶液。脫蛋白后的濃縮液用流動(dòng)自來水透析72 h，蒸餾水透析24 h。醇析所得的沉淀物，加無水乙醇混勻，離心處理重復(fù)3次，再分別用丙酮、乙醚洗滌2遍。50℃真空干燥[4]。計(jì)算得率。

1.6 多糖的純化

稱取0.3 g粽葉多糖配成10 mL溶液，經(jīng)SephadexG-100柱層析（4.5 cm×80 cm），用 0.1～1.0 mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.7 mL/min，用收集洗脫液[1]，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮至30 mL，加乙醇沉淀，4℃放置過夜，離心分離出沉淀物。40℃真空干燥得純化后的多糖純品。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取干燥至恒重的無水葡萄糖10.00 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解后定容至刻度制成貯備液，分別取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 于 8 支比色管中，加水定容至2 mL，再分別加入6%的苯酚溶液及5 mL的濃H2SO4，靜置10 min之后搖勻，再靜置冷卻至室溫。以蒸餾水為空白，在488 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 換算因子的測定

精確稱取干燥至恒重的粽葉多糖白色無定形粉末0.025 g，置于250 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻得到精制多糖樣品溶液，濃度為0.1 mg/mL，測定吸光度，由回歸方程計(jì)算出供試液中的葡萄糖含量，按下式計(jì)算換算因子。

換算因子f=W/（C×D）

式中：W為稱取多糖的重量（mg），C為多糖液中葡萄糖的含量（mg/mL），D為多糖的稀釋倍數(shù)。

1.9 樣品溶液中粽葉多糖的含量分?jǐn)?shù)測定

精確吸取樣品溶液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，取1.0 mL于比色管中，測定吸光度，由回歸方程計(jì)算出供試液中葡萄糖含量，按下式計(jì)算各樣品中多糖的含量分?jǐn)?shù)。

多糖的含量分?jǐn)?shù)（%）=C×D×f/（W×1 000）

式中：C為樣品溶液中葡萄糖的含量（mg/mL），D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)，f為分別加入水、乙醇、甲苯、氯仿、丙酮等溶劑中，觀察粽葉多糖在這些溶劑中的溶解換算因子，W為樣品重量（g）。

1.10 多糖定性分析試驗(yàn)

溶解試驗(yàn)：取少量粽葉多糖分別加入水、乙醇、甲苯、氯仿、丙酮等溶劑中，觀察其在這些溶劑中的溶解情況。

Molish反應(yīng)：取1 mL濃度為1 mg/mL的粽葉多糖溶液加入2滴Molish試劑，搖勻，將試管傾斜，沿試管壁慢慢加入1.0 mL濃硫酸，豎直試管，觀察濃硫酸和糖溶液交界面顏色的變化。糖在濃硫酸的作用下脫水形成糠醛及其衍生物與α-萘酚作用形成紫紅色復(fù)合物，在糖液和濃硫酸的液面間形成紫環(huán)，因此又稱紫環(huán)反應(yīng)。

茚三酮反應(yīng)：取1 mL濃度為1 mg/mL的粽葉多糖溶液，加入0.5 mL的2.5%茚三酮乙醇溶液，混勻，煮沸2 min，冷卻，觀察顏色變化。以蒸餾水作陰性對照，0.5%甘氨酸溶液作陽性對照。

1.11 多糖的光譜分析

紫外光譜：稱取干粽葉多糖樣品6.0 mg，加20 mL雙蒸水溶解配成0.3 mg/mL的多糖溶液，在200～400 nm區(qū)間進(jìn)行掃描。

紅外光譜：稱取干粽葉多糖樣品2 mg，加入200 mg干燥的KBr晶體，在紅外燈照射下于研缽中輕輕研磨至極細(xì)，用壓光機(jī)壓片，經(jīng)紅外分光光度計(jì)400～4 000 cm-1中紅外區(qū)掃描，測定透光率曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在489 nm下測定其吸光度與葡萄糖含量的關(guān)系曲線，如圖1。

圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

用最小二乘法線性回歸[10]，得多糖濃度與吸光度A的關(guān)系：

C=0.001 155+30.8 A

式中C為由計(jì)算的多糖濃度（mg/mL），A為測得的吸光度值。

2.2 多糖定性分析結(jié)果

粽葉多糖呈灰白色粉末狀，溶于水，不溶于乙醇、甲苯、氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑，粽葉多糖在Molish反應(yīng)中產(chǎn)生紫色環(huán)，說明樣品溶液中含糖。茚三酮反應(yīng)弱陽性，說明粽葉多糖樣品中存在少量的氨基酸或多肽類物質(zhì)。

2.3 粽葉多糖測定結(jié)果

脫蛋白質(zhì)后真空干燥得1.76 g；得率為2.52%。換算因子為：2.50；測得粽葉提取液中多糖的含量為3.99%。

2.4 粽葉多糖紫外分析結(jié)果

掃描結(jié)果見圖2～4。圖2為多糖提取液的紫外光譜圖。260 nm～280 nm處有明顯的吸收峰，說明含有一定量的蛋白質(zhì)和氨基酸分子。圖3為使用Sevag法去蛋白之后的紫外光譜圖。掃描結(jié)果顯示0.3 g/L的粽葉多糖水溶液在波長260 nm處有一個(gè)小的吸收峰圖。分析原因可能為氯仿聯(lián)合正丁醇已經(jīng)去掉了部分蛋白。圖4為粽葉多糖用透析聯(lián)合Sevag法去蛋白之后的紫外光譜掃描結(jié)果，顯示0.3 g/L的粽葉多糖水溶液在波長260 nm～280 nm處幾乎沒有吸收峰，由此可見透析聯(lián)合Sevag法去蛋白的效果明顯。

圖2 未去蛋白粽葉多糖水溶液紫外光譜圖

圖3 Sevag法去蛋白后的紫外光譜圖

圖4 透析聯(lián)合Sevag法去蛋白的紫外光譜圖

由紫外光譜圖譜對照可知，在260 nm～280 nm處的吸收峰逐漸變小，說明蛋白質(zhì)和氨基酸分子含量很少。

2.5 粽葉多糖紅外光譜分析

粽葉多糖紅外光譜分析結(jié)果見圖5～7。

從以上紅外光譜可知，粽葉多糖組分在3 600～3 200 cm-1、3 200～2 800 cm-1、1 400～1 200 cm-1、和1 200～1 000 cm-1這個(gè)譜段內(nèi)都出現(xiàn)了典型多糖物質(zhì)的吸收峰。粽葉多糖的紅光譜掃描結(jié)果顯示：在3 470 cm-1處出現(xiàn)一寬峰，為O-H的伸縮振動(dòng)；2 940 cm-1的吸收峰較弱，是C-H伸縮振動(dòng)；1 620 cm-1處的吸收峰為-CHO的C=O伸縮振動(dòng)；1 320 cm-1和1 260 cm-1處為C-H的變角振動(dòng)吸收峰；1 040 cm-1和960 cm-1處為吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的C-O和羥基的吸收峰；890 cm-1吸收峰是β2型C-H變角振動(dòng)的特征吸收峰；820 cm-1是α-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰。

圖5 醇析多糖紅外光譜圖

圖6 醇析－透析多糖紅外光譜圖

圖7 粗多糖紅外光譜圖

[1]陳 群，楊桂文，安利國.銀杏白果多糖的提取、純化和分析[J].中國藥學(xué)雜志，2002，37（5）：331-333.

[2]申明月，聶少平，謝明勇.茶葉多糖的純化及其光譜特性研究[J].食品科學(xué)，2007，28（11）：39-43.

[3]石寶霞，車會(huì)蓮，趙利霞，等.碎米薺硒多糖的分離純化及光譜分析[J].食品科學(xué)，2007，28（6）：298-302.

[4]張劍韻，包立軍，梁 進(jìn)，等.桑葉多糖的分離及紅外光譜和氣相色譜分析[J].蠶業(yè)科學(xué)，2007，33（4）：549-552.

[5]馬 莉，唐健元，李祖?zhèn)?，?板藍(lán)根多糖分離純化及其性質(zhì)的研究[J].中草藥，2007，38（8）：1144-1146.

[6]宋云端，孟慶勇，徐美奕.半葉馬尾藻多糖的分離純化與光譜分析[J].中藥材，2007，30（8）951-954.

[7]呂俊梅，朱建飛，李 宏，等.微波法提取牛蒡多糖的工藝研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（7）：117-118，122.

[8]賈淑珍，王成忠，于功明.香菇多糖脫蛋白工藝的研究[J].中國釀造，2008，（3）：24-26.

[9]謝 彥，張 杰，曹允潔，等.馬齒莧多糖提取方法及藥理活性研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，37（7）：127-130.

[10]劉 悅，徐東升，臧其威.茶多糖提取方法及影響因子優(yōu)化研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（16）：8650-8652.

[11]周廣生，張步彩，王 濤.紅芪多糖注射液雞胚接種抗雞新城疫病毒研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22（7）：95-96，99.

[12]張琳華，高瑞昶，許明麗.桑葉中多糖提取分離工藝的研究[J].中草藥，2005，36（4）：534-537.

[13]王菊鳳，李鵠鳴.蛹蟲草多糖對果蠅種群期望壽命的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（5）：133-135，139.

[14]田春華，竹 磊，朱海華，等.啤酒酵母泥中酵母多糖提取工藝研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22（7）：103-104，110.