細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1在氣道瘢痕狹窄病變中的表達(dá)及意義

饒珊珊+邵松軍+張程+葉賢偉+林潔如+曾令萍+張湘燕

摘要：目的 觀察細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1（ECM1）在氣道狹窄患者的氣道瘢痕組織中的表達(dá)，探討其意義。方法 收集氣道瘢痕增生致氣道狹窄患者的瘢痕組織和同時期正常人氣道粘膜組織，運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR檢測ECM1基因表達(dá)，Western blot檢測ECM1、表皮生長因子受體（EGFR）、磷酸化表皮生長因子受體（p-EGFR）蛋白水平。結(jié)果 與正常人比較，氣道瘢痕增生患者瘢痕組織的ECM1基因表達(dá)及蛋白水平均明顯升高（P<0.01），p-EGFR蛋白水平明顯上升（P<0.01）。結(jié)論 ECM1與氣道瘢痕增生關(guān)系密切，表達(dá)增多，并激活EGFR。

關(guān)鍵詞：氣道狹窄；瘢痕增生；細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1

近年來，氣道瘢痕狹窄病例日益增多，嚴(yán)重者影響肺通氣功能，甚至出現(xiàn)窒息性呼吸困難。氣道瘢痕與皮膚瘢痕疙瘩的病理改變有相似性。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1（extracellular matrix protein 1，ECM1）在瘢痕疙瘩中表達(dá)明顯升高[1]。但在氣道瘢痕中尚無研究報道。為觀察ECM1與氣道瘢痕增生的關(guān)系，探討氣道瘢痕的病理生理改變，我們收集了2012年～2014年在貴州省人民醫(yī)院就診的氣道瘢痕狹窄患者的瘢痕組織和同時期正常人氣道粘膜組織，運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot方法從基因和蛋白兩個水平來探討ECM1在氣道瘢痕組織中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 ①瘢痕組：選擇2012年8月～2014年10月在我院就診的氣道瘢痕狹窄患者10例，男6例，女4例，年齡18～56歲，經(jīng)纖維支氣管鏡活檢鉗取材或胸外科手術(shù)取材取得氣道瘢痕組織；②正常組：選擇同時期在我院行纖維支氣管鏡檢查的正常人10例，男5例，女5例，年齡20～60歲，經(jīng)纖支鏡活檢取得氣道粘膜組織。兩組人員均排除惡性腫瘤及慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化等慢性呼吸系統(tǒng)疾病，年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。該研究方案通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，入選者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 qRT-PCR檢測ECM1基因表達(dá)水平 Trizol（Invitrogen）一步法提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。ECM1、β-actin的mRNA引物由上海生工公司合成。ECM1上游引物5′-GACCTGCCATTTCCA GAACAG-3′，下游引物5′-GGGACCACACAGATCATTGATG-3′；β-actin上游引物5′-ACCACCATGTACCCAGGCAT-3′，下游引物′-CCGGACTCATCGTACTCCTG-3′。PCR擴(kuò)增用iQTM SYBR○R GREEN Supermix完成，Bio-Rad CFX 96TM熒光定量PCR分析系統(tǒng)行Realtime PCR。

1.2.2 Western blot檢測ECM1、表皮生長因子受體（EGFR）、磷酸化表皮生長因子受體（p-EGFR）蛋白水平 SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉1 h，一抗β-actin（博奧森，1∶400）、ECM1（abcam，1∶1000）、EGFR（abcam，1∶1000）、p-EGFR（CST，1∶1000）孵育過夜（4℃），二抗孵育2 h（室溫），ECL發(fā)光顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片，Quantity one 軟件分析各目標(biāo)條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白表達(dá)水平以目標(biāo)蛋白/β-actin比值表示。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測ECM1基因表達(dá)水平 結(jié)果顯示，瘢痕組ECM1基因表達(dá)較正常組明顯增多（P<0.01），見圖1。

2.2 Western blot檢測ECM1、EGFR、p-EGFR蛋白水平情況 結(jié)果顯示，瘢痕組ECM1、p-EGFR蛋白水平較正常組明顯升高（P<0.01），EGFR蛋白水平在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖2。

3 討論

近年來，氣管狹窄的患病率不斷上升，究其原因，主要是由于氣管插管、氣管切開術(shù)后氣道纖維瘢痕組織增生或者支氣管內(nèi)膜結(jié)核等疾病氣道粘膜修復(fù)過度導(dǎo)致的氣道瘢痕增生所致。氣道瘢痕組織增生及攣縮不僅會導(dǎo)致氣管或支氣管狹窄，還可引起阻塞性肺炎、肺不張和呼吸困難，嚴(yán)重者可發(fā)生窒息。目前對于氣道瘢痕增生的發(fā)病機(jī)制及病理過程認(rèn)識并不清楚，缺乏有效的治療藥物，雖然可以通過纖支鏡介入技術(shù)進(jìn)行緩解性治療，但存在復(fù)發(fā)率高、復(fù)診率高的問題，需要尋找新的治療手段。

ECM1是從鼠的成骨基質(zhì)細(xì)胞系MN7中分離出來的一種分泌性糖蛋白[2]，分子量為85kDa。重組ECM1能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成[3]。大量研究已表明，ECM1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等方面有重要作用，尤其是能夠影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移[4]。ECM1通過激活EGFR信號通路調(diào)控癌細(xì)胞的增殖，在此過程中，ECM1可與基底膜聚糖結(jié)合，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF2）等細(xì)胞因子增多而促進(jìn)腫瘤的生長、進(jìn)展[5-7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，氣道狹窄患者的局部氣道組織中，ECM1的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平均明顯上升，提示ECM1與氣道瘢痕增生關(guān)系密切，為探索氣道瘢痕增生的發(fā)病機(jī)制提供了新的有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)在氣道纖維瘢痕組織中，EGFR磷酸化的水平明顯升高，可能因此激活EGFR信號通路，導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)纖維瘢痕組織的形成和發(fā)展，有待于進(jìn)一步研究探索明確。有研究發(fā)現(xiàn)敲低ECM1或用抗ECM1的抗體處理腫瘤細(xì)胞后，EGFR通路受到抑制，由此能夠遏制細(xì)胞增殖[5，8]。提示在氣道瘢痕增生疾病中，可以以ECM1為靶點(diǎn)進(jìn)行深入探索研究，觀察對瘢痕增生的影響，以期發(fā)現(xiàn)新的治療手段。

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