長期施肥對棕壤氨氧化細菌和古菌豐度的影響

羅培宇，樊耀,3，楊勁峰，葛銀鳳，蔡芳芳，韓曉日*

長期施肥對棕壤氨氧化細菌和古菌豐度的影響

羅培宇1,2，樊耀1,2,3，楊勁峰1,2，葛銀鳳1,2，蔡芳芳1,2，韓曉日1,2*

（1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2 土壤肥料資源高效利用國家工程實驗室，遼寧沈陽 110866；3 金正大生態(tài)工程集團股份有限公司，山東臨沂 276700）

【目的】氨氧化是氮轉(zhuǎn)化過程的限速步驟，其由氨氧化微生物所驅(qū)動。本研究旨在探明 37 年玉米–大豆輪作施肥條件下影響棕壤氨氧化微生物豐度的主要影響因子及變化規(guī)律。【方法】以沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)棕壤肥料長期定位試驗耕層土壤 (0—20 cm) 為材料，選取其中 9 個施肥處理進行取樣分析：不施肥 (CK)、低量氮肥 (N1)、高量氮肥 (N2)、氮磷肥 (N1P)、氮磷鉀肥 (N1PK)、高量有機肥 (M2)、高量有機肥 + 低量氮肥 (M2N1)、高量有機肥 +氮磷肥 (M2N1P)、高量有機肥 + 氮磷鉀肥 (M2N1PK)。采用實時熒光定量 PCR 技術(shù)測定其氨氧化微生物豐度，通過對土壤基本化學(xué)性質(zhì)和氨氧化微生物豐度的冗余分析找出影響氨氧化微生物豐度的主要因素?！窘Y(jié)果】施用有機肥處理的土壤 pH、有機質(zhì)、全氮、堿解氮、速效鉀、速效磷、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量明顯高于不施肥和單施化肥處理。各施肥處理土壤有機質(zhì)、全氮、堿解氮、速效鉀、速效磷的含量總體呈現(xiàn)有機肥處理 > 化肥處理 > CK；與不施肥處理 (CK) 相比，單施化肥處理顯著降低了土壤 pH 值，施用有機肥處理顯著提高了土壤 pH 值，其中 N2處理的土壤 pH 最低，M2處理的土壤 pH 最高。不同施肥處理氨氧化細菌 (AOB) 的豐度為 0.94 × 106～5.77 × 106copies/g 干土，氨氧化古菌 (AOA) 的豐度為 3.56 × 106～1.22 × 107copies/g 干土；施用有機肥處理AOB 和 AOA 豐度顯著高于不施肥和單施化肥處理，其中 M2處理的 AOB 和 AOA 豐度最高，單施氮肥處理的AOB 和 AOA 豐度最低。冗余分析 (RDA) 表明，影響棕壤 AOB 和 AOA 豐度的主要環(huán)境因子有土壤 pH、有機質(zhì)、全氮、堿解氮、速效磷、速效鉀，且與 AOB 和 AOA 豐度呈正相關(guān)關(guān)系?！窘Y(jié)論】長期輪作施肥顯著改變了棕壤的化學(xué)性質(zhì)，從而對氨氧化微生物的豐度產(chǎn)生了顯著影響。長期施用有機肥顯著提高了土壤養(yǎng)分含量及AOB 和 AOA 的豐度，對維持土壤氨氧化微生物的數(shù)量起到十分重要的作用；同時試驗結(jié)果也為今后通過改變土壤 pH、有機質(zhì)、全氮、堿解氮、速效磷、速效鉀等性質(zhì)對 AOB 和 AOA 進行調(diào)節(jié)提供了依據(jù)。

棕壤；定位試驗；長期施肥；氨氧化微生物；豐度

土壤微生物作為農(nóng)田土壤的重要組成部分，在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、元素循環(huán)以及有機質(zhì)的分解過程中起著重要作用。作為評價土壤質(zhì)量、維持土壤肥力的重要指標(biāo)，土壤微生物一直倍受關(guān)注[1]。氨氧化微生物是硝化作用的關(guān)鍵微生物，在全球氮循環(huán)過程中起著至關(guān)重要的作用[2–3]。作為理想的模式微生物，氨氧化微生物的豐度和群落多樣性已經(jīng)成為衡量土壤環(huán)境變化的重要指標(biāo)之一[1]。長期施用肥料能改變土壤微生物活性及豐度[4]，研究長期施肥對土壤氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性和豐度的影響已有眾多報道，如 He 等[5]研究了長期施肥對旱地紅壤氨氧化微生物群落組成和豐度的影響；辛亮等[6]研究了長期施肥對旱地土壤中氨氧化微生物豐度和分布的影響。然而不同土地利用方式[7–10]、不同作物種類[11]、不同施肥方式[12–15]均會對土壤氨氧化微生物群落多樣性和豐度產(chǎn)生顯著影響，進而使得 AOA 和 AOB 對土壤硝化作用的響應(yīng)及其在群落生態(tài)功能中的相對貢獻不同[16]。采用分子生物學(xué)技術(shù)對環(huán)境微生物的深入研究，促進了環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展[17]，實時熒光定量 PCR 技術(shù)以其高靈敏性、高特異性、高精確度、實時性、污染少等優(yōu)點，在微生物生態(tài)學(xué)的研究中逐漸得到眾多學(xué)者的認可[18]。雖然有關(guān)氨氧化微生物多樣性和豐度的研究相對較多，不同的土壤類型氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)和豐度均有相似的結(jié)論，但是由于氨氧化微生物對不同施肥條件及不同耕作模式響應(yīng)有所差別，因此，本研究在棕壤長達 37 年玉米–大豆長期輪作施肥的基礎(chǔ)上，采用Real-time PCR 技術(shù)研究長期有機肥配施化肥和單施化肥處理對棕壤氨氧化微生物豐度的影響，以期探討不同施肥處理棕壤氨氧化微生物豐度的變化，及影響氨氧化微生物豐度的主要影響因子，從而為進一步研究硝化抑制劑、調(diào)控土壤硝化作用以及氮素轉(zhuǎn)化機理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及試驗設(shè)計

供試土壤樣品采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)棕壤肥料長期定位試驗地 (北緯 40°48′，東經(jīng) 123°33′)。該試驗地始于 1979 年，到 2015 年已有 37 年歷史，采用玉米–玉米–大豆輪作，2015 年種植玉米。土壤為發(fā)育于第四紀黃土性母質(zhì)上的簡育濕潤淋溶土 (耕作棕壤)。該地處于松遼平原南部中心地帶，屬溫帶濕潤–半濕潤季風(fēng)氣候，年降雨量為 574～684 mm，年蒸發(fā)量為 1435.6 mm，平均氣溫為 7.0～8.1℃，無霜期為140～180 d，降雨多集中在 7～8 月份。1979 年原始土壤理化性質(zhì)為 pH 6.50、堿解氮 105.5 mg/kg、速效磷 6.50 mg/kg、速效鉀 97.9 mg/kg、有機質(zhì) 15.90 g/kg、全氮 0.80 g/kg、全磷 0.38 g/kg 及全鉀 21.10 g/kg。

試驗地設(shè)化肥區(qū)、低量有機肥區(qū)和高量有機肥區(qū) 3 區(qū)組，共計 15 個處理。本試驗選取其中 9 個處理：不施肥 (CK)、低量氮肥 (N1)、高量氮肥 (N2)、氮磷肥 (N1P)、氮磷鉀肥 (N1PK)、高量有機肥 (M2)、高量有機肥 + 低量氮肥 (M2N1)、高量有機肥 + 氮磷肥 (M2N1P)、高量有機肥 + 氮磷鉀肥 (M2N1PK)。所有肥料作為基肥在播種前一次性施入土壤。有機肥為豬廄肥，平均含有機質(zhì) 119.6 g/kg，全 N5.6 g/kg，P2O58.3 g/kg，K2O 10.9 g/kg。各處理施肥量如表 1所示。

1.2 土壤樣品采集及前處理

土壤樣品在 2015 年播種前 (4 月 21 日) 進行采集，各處理隨機選取 5 個點，采樣深度為 0—20 cm，充分混勻，剔除礫石、植物根系等雜物，過 1 mm 篩，一部分測定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮及提取土壤總DNA 并采用實時熒光定量 PCR 技術(shù)測定其氨氧化微生物豐度；另一部分風(fēng)干后測定土壤 pH、有機質(zhì)、全氮、堿解氮、速效鉀、速效磷。另外分別在苗期(5 月 31 日)、拔節(jié)期 (6 月 28 日)、抽雄期 (7 月 27日)和收獲期 (9 月 20 日)采取土樣測定氨氧化微生物的豐度。

表1 各施肥處理玉米/大豆季肥料施用量Table1 Application rates of fertilizer in maize/soybean season of the treatments

1.3 測定方法

土壤總 DNA 提?。翰捎?PowerSoilTMDNA 提取試劑盒 (MobioLaboratories, Inc., USA) 提取，DNA 樣品于–20℃ 冰箱中保存待用。土壤基本化學(xué)性質(zhì)分析采用常規(guī)分析法[19]。

氨氧化細菌和氨氧化古菌豐度分析：以氨氧化細菌 amoA 基因和氨氧化古菌 arch-amoA 基因的拷貝數(shù)分別表示氨氧化細菌和氨氧化古菌的豐度。利用實時熒光定量 PCR (Real-time PCR) 技術(shù)檢測amoA 和 arch-amoA 基因拷貝數(shù)。每個樣品重復(fù) 3次，PCR 引物和擴增條件如李景云等所述[20]。Realtime PCR 反應(yīng)體系為 20 μL，其中 DNA 模板 2 μL，18 μL 為反應(yīng)液，反應(yīng)液包括 10 μL SYBR、上下游引物各 0.8 μL、超純水 6.4 μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

圖表制作采用 Microsoft Office Excel 2007，方差分析采用 SPSS 19.00，采用最小顯著差數(shù)法 (α = 0.05，LSD) 進行單因素方差分析，冗余分析采用CANOCO 4.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對土壤理化性質(zhì)的影響

不同施肥處理土壤的部分化學(xué)性質(zhì)見表 2，各施肥處理間差異性顯著。施用有機肥處理土壤pH、有機質(zhì)、全氮、堿解氮、速效磷、速效鉀顯著高于不施肥和單施化肥處理。其中，土壤有機質(zhì)、堿解氮、速效鉀、速效磷、全氮的各施肥處理總體趨勢為有機肥各處理 > 化肥處理 > CK。與不施肥處理(CK) 相比，單施化肥土壤 pH 值下降，施用有機肥處理土壤 pH 均有所提高，其中單施氮肥土壤 pH 最低，單施有機肥土壤 pH 最高。說明施用有機肥能顯著提高土壤 pH，同時也能提高土壤養(yǎng)分含量，而不平衡施肥則使土壤條件惡化。

2.2 不同施肥處理對土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的影響

如圖 1 所示，長期施用有機肥土壤銨態(tài)氮的含量高于不施肥和單施化肥處理，且變化幅度較小。與不施肥處理 CK (平均值為 12.4 mg/kg) 相比，只有N1、N1PK 處理土壤中銨態(tài)氮含量有所下降，分別為10.52 mg/kg 和 10.46 mg/kg，其余各施肥處理土壤銨態(tài)氮含量均有不同程度的增加。施用有機肥的 3 個處理 (M2N1P、M2N1PK、M2N1) 與 CK 相比，分別提高了 18.1%、14.8%、15.1%，且差異性顯著，這說明長期施用有機肥有利于提高土壤銨態(tài)氮的含量，為作物生長發(fā)育提供充足的氮源。

表2 供試土壤基本化學(xué)性質(zhì)Table2 Basic chemical properties of the tested soil

不同施肥處理土壤硝態(tài)氮含量差異性顯著 (圖 1)。各施肥處理間土壤硝態(tài)氮的含量趨勢為有機肥區(qū) >化肥區(qū) > CK。其中，施用有機肥的 4 個處理 (M2N1P、M2N1PK、M2N1、M2) 與 CK (平均值為 8.32 mg/kg) 相

圖1 不同施肥處理土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量Fig. 1 Contents of soil ammonium and nitrate nitrogen in different treatments[注（Note）：誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤差，大寫字母代表銨態(tài)氮的差異性，小寫字母代表硝態(tài)氮的差異性 Error bars indicate one standard error, capital letters represent differences of NH4+-N，and lower case letters represent differences of NO3–-N (α = 0.05).]

比差異較大，分別提高了 189.2%、136.8%、102.2%、103.0%，單施化肥土壤硝態(tài)氮含量也有不同程度的增加，說明長期施肥 (尤其施用有機肥) 能顯著提高土壤硝態(tài)氮的含量。這可能是由于有機肥處理土壤AOB 和 AOA 豐度較大，會促進土壤硝化作用增強，導(dǎo)致硝態(tài)氮含量顯著提高。這與袁穎紅等[21]的研究結(jié)果相似。

2.3 不同施肥處理氨氧化微生物的豐度

由圖 2 可以看出，各施肥處理土壤中氨氧化古菌的豐度明顯高于氨氧化細菌，且不同施肥處理間氨氧化微生物豐度差異性顯著。施用有機肥處理土

圖2 不同施肥處理 AOB 和 AOA 豐度Fig. 2 Abundances of ammonia oxidizing bacteria and ammonia oxidizing archaea in soils in different treatments [注（Note）：誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤差，大寫字母代表 AOB 的差異性，小寫字母代表 AOA 的差異性 Error bars indicate one standard error, capital letters represent differences of AOB，and lower case letters represent differences of AOA (α = 0.05).]

壤中氨氧化細菌的數(shù)量顯著高于不施肥和單施化肥處理，為 4.59 × 106～5.77 × 106copies/g 干土，其中單施有機肥 (M2) 處理氨氧化細菌數(shù)量最多。與 CK (平均值為 2.64 × 106copies/g) 相比，施用有機肥處理氨氧化細菌的數(shù)量提高了 73.9%～118.6%；而單施氮肥 (N1、N2) 處理氨氧化細菌的數(shù)量最低，分別為1.21 × 106copies/g、0.94 × 106copies/g 干土，與 CK相比分別降低了 54.2% 和 64.4%。

不同施肥處理氨氧化古菌豐度總體趨勢為有機肥區(qū) > CK > 化肥區(qū)。施用有機肥各處理土壤氨氧化古菌的豐度為 8.31 × 106～1.22 × 107copies/g干土，與CK 相比提高了 57.7%～131.9%，其中單施有機肥(M2) 處理的土壤中氨氧化古菌豐度最高。而單施氮肥 (N1、N2) 能顯著降低氨氧化古菌的豐度，較 CK分別降低了 29.8% 和 32.3%。

結(jié)果表明，長期施用有機肥可以顯著提高棕壤氨氧化微生物的豐度，而長期氮、磷、鉀肥配施(N1P、N1PK) 比單施氮肥 (N1、N2) 氨氧化微生物豐度也有明顯的增加。這可能是由于有機肥可以改善土壤理化性質(zhì)、提供大量的養(yǎng)分，從而為微生物的生長提供有利的生存環(huán)境[22–23]，而長期的單一施肥會導(dǎo)致土壤中有些養(yǎng)分長期的缺失或積累，改變土壤的pH值，進而影響土壤中微生物的活性和數(shù)量，這與賀紀正等[24]研究結(jié)果相近。

2.4 不同施肥處理土壤氨氧化微生物隨作物生育時期的變化

圖3 玉米各生育期土壤氨氧化細菌豐度的變化Fig. 3 Abundance of ammonia oxidizing bacteria in soils of different treatments during various maize growth stages

由圖 3 可以看出，施用有機肥處理，整個生育時期都能檢測到 amoA 基因，且 AOB 的豐度基本呈現(xiàn)從播前到苗期、拔節(jié)期先增加，抽雄期以后減少，最后收獲期達到平穩(wěn)的狀態(tài)。在苗期 (5 月 31 日) 和拔節(jié)期 (6 月 28 日) AOB 的豐度較高，為 1.68 × 107～ 3.17 × 107copies/g 干土。CK 和單施化肥處理，播前、苗期、拔節(jié)期均檢測到土壤中含有 amoA 基因，而抽雄期和收獲期土壤中 amoA 基因含量低于定量PCR 的檢出限，所以未給出具體數(shù)值。這可能是由于這兩個生育期 AOB 沒有適宜的生存環(huán)境所致，而有機肥能改善土壤的理化性質(zhì)，從而使得有機肥區(qū)還存有一定數(shù)量的 AOB。因此，抽雄期和收獲期有機肥區(qū)可檢測到含有 AOB，不施肥和單施化肥處理則標(biāo)記為未檢測到。

長期輪作施肥條件下，玉米各生育期土壤 AOA豐度變化如圖 4 所示。不同施肥處理之間 AOA 豐度：化肥區(qū) (N1P、N1PK、N1、N2) 土壤 AOA 的豐度在玉米生育期內(nèi)呈緩慢上升的趨勢；有機肥區(qū)和不施肥處理土壤 AOA 豐度從播前到拔節(jié)期緩慢增長，但抽雄期以后大幅升高，其中單施有機肥 (M2) 處理土壤中 AOA 的上升幅度最大，收獲期各施肥處理土壤中 AOA 豐度達到最大，為 1.14 × 107～1.95 × 108copies/g 干土。玉米生育期內(nèi)，施用有機肥處理土壤中 AOA 數(shù)量的變化趨勢明顯大于 CK 和單施化肥處理，這可能是因為施用的有機肥能帶入大量養(yǎng)分，具有保水保肥的能力，從而增強了土壤微生物的活性，促進了土壤中 AOA 數(shù)量的快速增長。結(jié)果表明玉米整個生育期內(nèi)，施用有機肥更有利于提高土壤氨氧化古菌的豐度。

2.5 土壤理化性質(zhì)對棕壤氨氧化微生物的影響

圖4 玉米各生育期土壤氨氧化古菌的豐度Fig. 4 Abundance of ammonia oxidizing archaea in soils in different treatments during various maize growth stages

表3 氨氧化微生物與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)系數(shù)Table3 Correlation coefficients among ammonia-oxidizing microorganisms and soil physicochemical properties

由表 3 可知，長期施肥條件下 AOB 的豐度與pH、土壤有機質(zhì) (SOM)、全氮 (TN)、堿解氮(AHN)、速效磷 (AP)、速效鉀 (AK) 的相關(guān)系數(shù)分別為 0.814、0.824、0.769、0.751、0.788、0.638，與土壤含水量 (MC) 相關(guān)系數(shù)僅為 0.178?？梢钥闯鐾寥纏H 和 SOM 與 AOB 豐度的相關(guān)性最大，其次為TN、AHN、AP 和 AK，且均呈顯著正相關(guān)；而 MC與 AOB 的豐度相關(guān)性不大。AOA 豐度與 pH、AHN、SOM、TN、AP、AK 的相關(guān)系數(shù)分別為0.942、0.898、0.933、0.900、0.572、0.836，可知土壤 pH、SOM 和 TN 與 AOA 豐度的關(guān)系最為密切，其次為堿解氮、速效磷、速效鉀，且均呈顯著正相關(guān)，而 MC 與 AOA 豐度則無顯著相關(guān)。

由冗余分析結(jié)果圖 5 可知，不同施肥處理棕壤AOA 和 AOB 豐度的主要影響因素有土壤 pH、土壤有機質(zhì) (SOM) 和全氮 (TN)、堿解氮 (AHN)、速效磷(AP)、速效鉀 (AK)，而土壤含水量則對 AOA 和AOB 的豐度無明顯影響力。

3 討論和結(jié)論

關(guān)于長期施肥對土壤氨氧化微生物群落多樣性和豐度影響的報道較多，不同施肥方式土壤氨氧化微生物的豐度存在明顯差異。本研究中，單施氮肥處理 (N1、N2) AOB 和 AOA 的豐度最低。對湖南祁陽旱地肥力及肥料效應(yīng)變化長期定位試驗點紅壤 (pH 3.7～5.8) 的研究結(jié)果顯示，AOB 和 AOA 的數(shù)量在只施氮肥的處理 (N) 中最低[24]，與本研究的結(jié)果一致。這可能是由于單施氮肥處理土壤 pH 值偏低，土壤養(yǎng)分含量單一，嚴重影響土壤微生物的生存環(huán)境而導(dǎo)致，而究竟由何種原因所引起，則需進一步設(shè)計試驗來驗證。施用有機肥處理 AOA 和 AOB 的數(shù)量顯著高于不施肥和單施化肥處理；這可能是由于施用有機肥能增加土壤微生物利用碳源的能力，改善微生物營養(yǎng)條件[23]，提高土壤生物的活性[24–26]，改善土壤的理化性狀[27]，提高土壤微生物的數(shù)量，因此施用有機肥處理的 AOA 和 AOB 豐度顯著高于單施化肥及不施肥處理，這與朱敏等[14]研究結(jié)果相似，即長期使用有機肥能增加土壤氨氧化微生物的數(shù)量。各處理中土壤 AOA 的數(shù)量明顯多于 AOB，這可能是由于氨氧化古菌對環(huán)境的適應(yīng)性高于氨氧化細菌，在土壤環(huán)境中相對穩(wěn)定。

圖5 棕壤氨氧化微生物與土壤理化性質(zhì)的冗余分析Fig. 5 Redundancy analysis depicting the relationship among soil physicochemical properties and ammonia-oxidizing microorganisms in brown soil[注（Note）：虛線箭頭代表 AOB、AOA 豐度，實線箭頭代表土壤理化性質(zhì)，實線和虛線夾角的余弦值決定它們之間的相關(guān)性 (通過蒙特卡羅檢驗，P < 0.05) The dashed arrows represent AOB and AOA abundances, the solid lines represent soil physical and chemical properties, and the cosine of included angles of the solid line and the dashed line determines the correlation among them (Monte Carlo test, P < 0.05).]

已有研究證明[8, 28]，土壤理化性質(zhì)與氨氧化微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)有一定的相關(guān)性，能影響土壤氨氧化微生物的數(shù)量。本研究結(jié)果表明，影響棕壤氨氧化微生物豐度的主要環(huán)境因子有土壤 pH、有機質(zhì)、全氮、堿解氮、速效磷、速效鉀。黃蓉等[29]對萬木林土壤研究得出氨氧化微生物豐度與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性均不強，僅 AOB 豐度與土壤速效磷呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果不一致。這可能是由于不同的土壤類型、耕作制度和土地利用方式等所導(dǎo)致的。

長期輪作施肥顯著改變了棕壤的化學(xué)性質(zhì)，從而對氨氧化微生物的豐度產(chǎn)生了顯著影響。長期施用有機肥顯著提高了土壤養(yǎng)分含量及 AOB 和 AOA的豐度，對維持土壤氨氧化微生物的數(shù)量起到十分重要的作用；影響氨氧化微生物豐度的主要環(huán)境因子包括土壤 pH、有機質(zhì)、全氮、堿解氮、速效磷以及速效鉀，這為調(diào)控土壤氨氧化微生物數(shù)量及其在氮素轉(zhuǎn)化中的作用提供了科學(xué)依據(jù)。而氨氧化微生物在玉米生育期內(nèi)變化也很明顯，具體受到哪些因素的影響則需要進一步研究。

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Influence of long-term fertilization on abundance of ammonia oxidizing bacteria and archaea in brown soil

LUO Pei-yu1,2, FAN Yao1,2,3, YANG Jin-feng1,2, GE Yin-feng1,2, CAI Fang-fang1,2, HAN Xiao-ri1,2*
( 1 College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2 National Engineering Laboratory of High Efficient Use on Soil and Fertilizer Resources, Shenyang 110866, China; 3 Kingenta Ecological Engineering Group Co., Ltd., Linyi, Shandong 276700, China )

【Objectives】Ammoxidation, driven by the ammonia-oxidizing microorganisms, is arate-limiting step of nitrogen transformation processes. The aim of this study was to explore the main factors which influenced abundance of ammonia-oxidizing microorganisms under acorn-soybean rotation system and along-term fertilization for 37 years in abrown soil.【Methods】Soil samples (0–20 cm) were collected from the nine treatments of the long-term fertilization trial: no fertilization (CK), low chemical Ninput (N1), high chemical N input (N2), chemical Nand Pinput (N1P), chemical N, P and Kinput (N1PK), pig manure (M2), pig manure and chemical N(M2N1), pig manure, chemical Nand P(M2N1P) and pig manure, chemical N, P and K(M2N1PK). Theabundance values of ammonia-oxidizing microorganisms were analyzed using qPCR methods. Main factors influencing the abundance of ammonia-oxidizing microorganisms were found out by the redundancy analysis (RDA) of soil chemical properties and the abundance of ammonia-oxidizing microorganisms.【Results】The pH, the soil contents of organic matter, total N, alkali-hydrolysable N, available K, available P, ammonium and nitrate in the organic fertilizer treatments were significantly higher than those in the CK and chemical fertilizer treatments. The soil organic matter, alkali-hydrolysable N, available K, available Pand total Nwas in order of manure treatments > chemical fertilizer treatments > CK. Compared with the CK, the pure chemical fertilization decreased soil pH, while the manure application increased soil pH. The pH values of soil were the lowest in one with the N2treatment and the highest in the M2treatment. The abundances of ammonia oxidizing bacteria (AOB) were 0.94 × 106– 5.77 × 107copies/g dry soil, and the abundances of ammonia oxidizing archaea (AOA) were 3.56 × 106– 1.22 × 107copies/g dry soil in different fertilization treated soils, respectively. The abundances of AOB and AOA in manure treatment soils were significantly higher than those in the CK and chemical fertilizer treatment soils. The abundances of AOB and AOA treated with the manure were the highest, while the abundances of AOB and AOA only treated with the chemical nitrogen were the lowest. The redundancy analysis showed that the main factors which affected the abundances of AOB and AOA were soil pH, organic matter, alkali-hydrolysable N, available Pand available K, and these factors had positive correlations with the abundances of AOB and AOA.【Conclusions】The long-term fertilization under arotation influenced the abundances of ammonia-oxidizing microorganisms most likely by significantly changing the chemical properties of brown soil. The long-term application of organic fertilizer improved soil nutrient contents and played an important role in maintaining the abundances of ammonia-oxidizing microorganisms in brown soil. Simultaneously, the results provide abasis for regulating abundances of AOA and AOB by changing the pH values, the contents of organic matter, total nitrogen, alkali-hydrolysable nitrogen, available phosphorus and available potassium in the future.

brown soil; located trial; long-term fertilization; ammonia oxidation microorganism; abundance

2016–08–29 接受日期：2016–10–10

國家自然科學(xué)基金（31471940，41501305）資助。

羅培宇（1982—），男，湖南邵陽人，博士，講師，主要從事土壤養(yǎng)分循環(huán)和土壤微生物方面的研究。E-mail：ibtyoufe@163.com。 *通信作者 E-mail：hanxr@163.com