RvD1對大鼠2型糖尿病神經(jīng)病理性痛的作用及機制研究*

馬益梅， 李傳達， 朱雅冰， 徐 霞， 李 軍， 曹 紅

(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院麻醉科， 浙江溫州 325027)

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RvD1對大鼠2型糖尿病神經(jīng)病理性痛的作用及機制研究*

馬益梅， 李傳達， 朱雅冰， 徐 霞， 李 軍， 曹 紅△

(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院麻醉科， 浙江溫州 325027)

目的：采用2型糖尿病神經(jīng)病理性痛大鼠，探討其脊髓背角小膠質細胞極化情況以及消退素D1(RvD1)緩解大鼠2型糖尿病神經(jīng)病理性痛的機制。方法：雄性SD大鼠高糖高脂飼養(yǎng)，腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，制備大鼠2型糖尿病神經(jīng)病理性痛模型。將2型糖尿病神經(jīng)病理性痛大鼠隨機分為3組(n=36)：2型糖尿病神經(jīng)病理性痛組(D組)、2型糖尿病神經(jīng)病理性痛注射RvD1組(R組)和溶劑對照組(S組)。R、S組分別于注射STZ 14 d后蛛網(wǎng)膜下腔置管，3 d后R、S組分別給予RvD1 10 μl(10 ng/μl)和100%乙醇10 μl，每天1次，連續(xù)14 d，D組不做任何處理。另取36只正常大鼠為正常對照組(N組)，普通飼料喂養(yǎng)。鞘內(nèi)給藥后第1、3、7、14 天時測定機械縮足閾值(MWT)和熱縮足潛伏期(TWL)，各組隨機取9只大鼠處死，取L4-6脊髓膨大，采用Western blot法檢測小膠質細胞M1、M2型極化標記物，即誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg1)的表達。結果：與N組比較，D、S組第1、3、7、14 天時MWT降低、TWL縮短，脊髓背角Arg1表達減少，iNOS表達增多(P<0.05)；與D組比較，R組第7、14 天時MWT升高、TWL延長，脊髓背角Arg1表達增多，iNOS表達減少(P<0.05)；D組與S組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義。結論：RvD1促進小膠質細胞M2型極化并緩解大鼠2型糖尿病神經(jīng)病理性痛。

大鼠；2型糖尿病；脊髓；小膠質細胞極化；RvD1；Arg1；iNOS；

隨著生活水平不斷的提高，糖尿病患者也逐漸增多，2011年全世界2型糖尿病患者約為3.66億，預計2030年將達到5.53億[1，2]。糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是2型糖尿病患者周圍神經(jīng)病變引起的神經(jīng)病理性疼痛，發(fā)病率高達50%[4]，其臨床特征為自發(fā)痛、誘發(fā)痛、痛覺過敏、痛覺超敏以及異常疼痛。目前對DNP的治療藥物主要是抗驚厥藥、抗抑郁藥、非甾體類抗炎藥、阿片類鎮(zhèn)痛藥。然而，只有少數(shù)患者的疼痛能得到有效緩解，且耐受性較差，嚴重影響糖尿病患者的生活水平。因此，探討DNP的發(fā)病機制，對于尋找新的治療方法具有重要意義。消退素 (Resolvin D1，RvD1)是一種內(nèi)源性促炎癥消退介質，有研究證明其對多種疼痛模型具有鎮(zhèn)痛作用[4, 5]，并參與影響小膠質細胞極化狀態(tài)，促進其M2型極化，而小膠質細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)的免疫活性細胞，其極化狀態(tài)對CNS的免疫環(huán)境有重要影響，與慢性神經(jīng)炎性疾病密切相關[6]。然而對于RvD1是否可通過影響小膠質細胞極化緩解2型糖尿病大鼠DNP的研究仍較缺乏。因此本實驗在2型糖尿病大鼠模型在給予RvD1治療后，檢測2型糖尿病大鼠機械和熱痛閾的變化，以及小膠質細胞極化的表達情況，探討RvD1是否可通過影響脊髓背角小膠質細胞極化來緩解2型糖尿病大鼠DNP，為DNP的發(fā)病機制及治療方法提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)、無水乙醇均購自Sigma公司；RvD1、Iba1、精氨酸酶1(arginine1，Arg1)抗體和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體分別購自Cayman、Wako、Santa cruz和Abcam公司。STZ用pH 4.3的檸檬酸液配成1%貯存液，于4℃冰箱保存；2390型Electronic von Fery 觸覺測痛儀、336型甩尾足底測試儀購自美國2TC公司；Bio-Rad電泳轉膜儀購自美國Bio-Rad公司，PE-10導管(OD：0.5mm，ID：0.25 mm)購自寧波市科技園區(qū)安來軟件科技有限司。

1.2 動物模型制備及分組

清潔級SD大鼠，雄性，體重120～160 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(浙)2005-0019。大鼠飼養(yǎng)于20℃～25℃環(huán)境中，攝食攝水，適應環(huán)境72 h。給予高糖高脂飼料(67%普通飼料+10%豬油+20%蔗糖+2%膽固醇+1%膽酸鈉)并飲水，于實驗開始及飼養(yǎng)第8 周(8w)測體重，并于第8周測空腹血糖、取尾靜脈血測血清胰島素以評估胰島素敏感性。飼養(yǎng)8周大鼠空腹胰島素濃度升高，胰島素敏感性指數(shù)明顯下降，即出現(xiàn)胰島素抵抗后，禁食不禁飲12 h，以35 mg/kg腹腔注射1% STZ溶液。3 d后測定大鼠尾靜脈血糖，血糖穩(wěn)定且≥16.7 mmol/L入選2型糖尿病大鼠組，14 d后測大鼠機械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)，降低至基礎值80%以下為2型糖尿病神經(jīng)病理性痛大鼠[7]。采用隨機數(shù)字表法，將其分為3組(n=36)：2型糖尿病神經(jīng)病理性痛組(D組)、2型糖尿病神經(jīng)病理性痛復合RvD1組(R組)和溶劑對照組(S組)。R、S組經(jīng)L4-5椎間隙，于蛛網(wǎng)膜下腔向頭端置入PE10導管1 cm，置管3 d后恢復正常。R、S組分別給予RvD1 10 μl(10 ng/μl)、100%乙醇 10 μl, 1次/天，連續(xù)14 d，D組不做任何處理。另取36只正常大鼠為正常對照組(N組)，給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.3 胰島素測定

大鼠禁食不禁水12 h后，尾靜脈采血約1 ml，室溫靜止約30 min，4℃恒溫離心后取上清液，采用雙抗體夾心ELISA法測定胰島素濃度，作標準曲線，計算待測標本血清胰島素濃度。

1.4 行為學測試

所有測定均在上午(8: 00～11: 00)、安靜的環(huán)境下進行，室溫維持在(25.0±0.5)℃。(1) MWT測定：將大鼠置于底為金屬篩網(wǎng)的透明玻璃箱中，玻璃箱放置于實驗臺面上方50 cm左右。待大鼠在箱中適應環(huán)境、安靜后，用2TC-2390 型Electronic Von Fery觸覺測痛儀垂直刺激大鼠足底中部皮膚，均勻緩慢加大刺激力度，直至大鼠出現(xiàn)快速縮足、舔足、抬腿等陽性反應，取此時的刺激強度值，單次刺激時間≤1 s，刺激間隔>10 s。左右后爪各測5次，取其平均值即為其MWT。(2) 熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)測定：將大鼠置于底為3 mm厚玻璃板的透明玻璃箱中，待大鼠適應環(huán)境、安靜后，使用2TC336甩尾足底測試儀的熱輻射光源照射大鼠后趾，記錄大鼠從照射到縮爪回避的時間，每只大鼠雙足各測5次，每次間隔5 min，取后3次的平均值即為其TWL。

1.5 計算胰島素敏感性指數(shù)及2型糖尿病神經(jīng)病理性痛的判斷

胰島素敏感性指數(shù)=1/(空腹血糖×空腹胰島素濃度)，此值為非正態(tài)分布，計算時取其自然對數(shù)[8]。空腹血糖≥16.7 mmol/L，胰島素敏感性下調(diào)、痛閾降低至基礎值80%以下為2型糖尿病神經(jīng)病理性痛大鼠。

1.6 蛛網(wǎng)膜下腔置管

2型糖尿病神經(jīng)病理性痛大鼠在5%水合氯醛手術麻醉狀態(tài)下，經(jīng)L4-5腰椎間隙，于蛛網(wǎng)膜下腔輕柔向頭端置入PE-10導管1 cm，置管過程中見大鼠甩尾、清亮腦脊液流入導管，固定導管；3 d后，經(jīng)留置導管給予2%利多卡因10 μl，大鼠后肢癱瘓，蛛網(wǎng)膜下腔置管成功[9]。

1.7 脊髓背角Arg1、iNOS檢測

于蛛網(wǎng)膜下腔給藥后第1、3、7、14天，測定MWT和TWL，各組隨機取9只大鼠腹腔注射5%水合氯醛，手術麻醉狀態(tài)下取L4-6節(jié)段脊髓，液氮速凍，-80℃低溫保存，取出新鮮組織標本，按重量體積比1∶10加入裂解液，充分研磨，超聲5 min×3次后靜置30 min，4℃恒溫離心后取上清液。BCA方法測定蛋白濃度，按照50 μg、10 μl加樣變性蛋白，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移到孔徑0.45 μm PVDF膜上，用含5% BSA的TBST溶液常溫封閉2 h或4℃搖床封閉過夜，加入Arg1、iNOS單克隆抗體，4℃過夜，室溫TBST洗10 min×3次，加入堿性磷酸酶標記的IgG抗體，室溫孵育2 h，TBST洗10 min×3次。加ECL發(fā)光液后用DNRMIROCHEMI化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光、拍照，AlphaEaseFC軟件分析條帶光密度值，內(nèi)參β-actin，以光密度比值反映Arg1、iNOS的表達水平。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 血糖、胰島素敏感指數(shù)情況

與N組比較，D組大鼠飼養(yǎng)8周后血糖升高，但沒有達到糖尿病診斷標準(≥16.7mmlo/L)，而空腹胰島素濃度升高，胰島素敏感性指數(shù)下降。在注射STZ 3 d后，血糖明顯升高(表1)。

2.2 痛閾變化

腹腔注射STZ前，各組大鼠MWT、TWL差異無統(tǒng)計學意義。造模成功后，與N組比較，D組和S組第1、3、7、14天時MWT降低、TWL縮短，與D組比較，R組第1、3天時MWT、TWL沒有明顯變化，第7、14 天時MWT升高、TWL延長(表2、表3)。

Tab. 1 Comparison of blood glucose, insulin, and insulin sensitivity index between group N and group ±s, n=9)

N: Normal group; D: Type 2 DNP group; STZ: Streptozotocin

*P<0.05vsN group

Tab.

MWT： Mechanical withdrawal threshold; N: Normal group; D: Type 2 DNP group; S: Solvent control group; R: Type 2 DNP and RvD1 group

*P<0.05vsN group；#P<0.05vsD group

Tab.

TWL： Thermal withdrawal latency; N: Normal group; D: Type 2 DNP group; S: Solvent control group; R: Type 2 DNP and RvD1 group

*P<0.05vsN group；#P<0.05vsD group

2.3 脊髓背角Arg1、iNOS表達

與N組比較，D組和S組第1、3、7、14天時脊髓背角Arg1表達相對值減少，iNOS表達相對值增加；與D組比較，R組第7、14天時脊髓背角Arg1表達相對值增加，iNOS表達相對值減少(P<0.05)。D組與S組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義(圖1、圖2，表4、表5)。

Fig. 1 Detecction the expression of iNOS by Western blot N: Normal group; D: Type 2 DNP group; S: Solvent control group; R: Type 2 DNP and RvD1 group

Group1std3rdd7thd14thdN1.0±0.11.0±0.20.9±0.10.9±0.1D1.1±0.2*1.2±0.3*1.1±0.2*1.1±0.2*S1.1±0.1*1.2±0.2*1.1±0.2*1.1±0.2*R1.0±0.21.0±0.21.0±0.2#1.0±0.2#

N: Normal group; D: Type2 DNP group; S: Solvent control group; R: Type 2 DNP and RvD1 group; iNOS: Inducible nitric oxide synthase

*P<0.05vsN group；#P<0.05vsD group

Fig. 2 Detecction the expression of Arg1 by Western blot N: Normal group; D: Type 2 DNP group; S: Solvent control group; R: Type 2 DNP and RvD1 group; Arg1: Arginine 1

Group1std3rdd7thd14thdN1.2±0.31.1±0.11.2±0.31.1±0.2D1.0±0.1*1.0±0.1*0.9±0.1*1.0±0.1*S0.9±0.1*1.0±0.1*0.9±0.1*0.9±0.1*R1.0±0.21.1±0.21.1±0.2#1.1±0.1#

N: Normal group; D: Type 2 DNP group; S: Solvent control group; R: Type 2 DNP and RvD1 group

*P<0.05vsN group；#P<0.05vsD group

3 討論

本研究采用高糖高脂飼養(yǎng)復合單次小劑量注射STZ的方法制備大鼠2型糖尿病神經(jīng)病理性痛模型[7]，結果表明，D組較N組不同時間點MWT降低、TWL縮短，表明神經(jīng)病理性疼痛模型制備成功。

本實驗參照文獻[7]的方法制備大鼠2型糖尿病神經(jīng)病理性痛模型，之后給予相應藥物進行處理，本研究中神經(jīng)病理性疼痛組與溶劑對照組各指標比較無統(tǒng)計學差異，排除了溶劑及手術操作對實驗結果的影響。與D組比較，R組第7、14 天時MWT升高、TWL延長，髓背角Arg1表達增加，iNOS表達減少，說明鞘內(nèi)給予RvD1可緩解神經(jīng)病理性疼痛, 促進小膠質細胞M2型極化。

Kristina等在脊髓損傷(SCI)模型中發(fā)現(xiàn)，小膠質細胞在不同的微環(huán)境中，可激活細胞內(nèi)不同的信號通路，引起相應的激活狀態(tài)，產(chǎn)生M1和M2型極化，表現(xiàn)出截然不同的神經(jīng)毒性作用或保護修復作用。SCI早期階段釋放大量的促炎因子，如TNF-α、IFN-γ和IL-1β等[10]，使大部分小膠質細胞呈M1型極化，少量的小膠質細胞呈現(xiàn)為M2型極化。M1型小膠質細胞產(chǎn)生更多的TNF-α、IFN-γ等炎癥因子以及氧化應激產(chǎn)物，其造成的炎癥環(huán)境在維持自身M1型極化的同時，對神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。SCI中晚期階段，由于損傷本身以及M1型小膠質細胞產(chǎn)生炎癥因子的積累，使更多的小膠質細胞呈M1型極化[11]，而抑制M2極化的產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)。而SCI后期，隨著炎癥消退，有利于小膠質細胞向M2極化，小膠質細胞M2型極化增多，M1型極化減少，其可以釋放大量具有神經(jīng)保護及促進軸突再生作用的營養(yǎng)因子BDNF、NGF及抗炎因子IL-4、IL-10和TGF-β[12]，使神經(jīng)損傷逐漸修復。

本實驗采用的2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型作為一種慢性炎癥模型，免疫印跡實驗結果表明，糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠較正常大鼠脊髓背角iNOS表達上調(diào)，Arg1表達下調(diào)，即小膠質細胞M1型極化增多，M2型極化減少，糖尿病大鼠MWT、TWL明顯下降。蛛網(wǎng)膜下腔注射RvD1后第1、3天，大鼠的痛閾并沒有明顯改善，小膠質細胞M1、M2型極化也沒有明顯變化。RvD1是Serhan等發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性的促炎癥消退介質[13]，它具有強效的抗炎促消退作用。近來有研究發(fā)現(xiàn)，RvD1可明顯促進IL-4誘導的小膠質細胞M2型極化[14], 并且能抑制角叉萊膠誘發(fā)的熱痛覺過敏和機械痛覺過敏[15]。蛛網(wǎng)膜下腔注射RvD1后第7、14天，給予RvD1大鼠的痛閾明顯提高，iNOS表達下調(diào)，Arg1表達上調(diào)，即小膠質細胞M1型極化減少，M2型極化增多。這就表明，在2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中由于慢性炎癥的存在，導致脊髓背角小膠質細胞更趨向于M1型極化，而M2型極化受到抑制，M1型小膠質細胞又會產(chǎn)生更多的炎癥因子，炎癥因子的積累，使更多的小膠質細胞呈M1型極化[11]。而RvD1的應用，可促進小膠質細胞M2型極化，使M1型極化減少，改善大鼠脊髓背角的微環(huán)境，從而提高糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的痛閾。

綜上所述，RvD1可以通過促進脊髓背角小膠質細胞M2型極化緩解2型糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛。

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關于圖、表的要求

圖應具有自明性，其內(nèi)容不可與文字、表格重復。圖中的量、單位、符號、縮寫詞和文字等須與正文一致。圖片應圖像清晰，反差明顯，精度600 dpi。顯微照片圖應附比例標尺(如Scale bar=50 μm)。染色后拍攝的顯微照片還應注明染色法。表一般采用三線式，須置于文中相應處，圖可附另頁。圖表的題目、內(nèi)容和注釋須用英文。

本刊編輯部

The mechanism of RvD1 alleviates type 2 diabetic neuropathic pain by influencing microglia polarization in rats

MA Yi-mei, LI Chuan-da, ZHU Ya-bing, XU Xia, LI Jun, CAO Hong△

(Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027, China)

Objective: To study the relationship between microglia polarization in the spinal dorsal horn and type 2 diabetic neuropathic pain (DNP). And explore the mechanism of RvD1 alleviating type 2 diabetic neuropathic pain. Methods: Type 2 diabetes mellitus (T2DM) rats came from the male SD rats which were fed by high-fat and high-sucrose diet and given intraperitoneal streptozotocin(STZ), then detected fasting blood glucose level, the mechanical withdrawal threshold (MWT) and thermal withdrawal latency ( TWL), which was to prepare the type 2 DNP model rats . And they were randomly divided into 3 groups : type 2 DNP group (group D), type 2 DNP and RvD1 group (group R), type 2 DNP and solvent control group (group S), 36 rats in each group. After being given STZ 14 days, the rats of group D, R, S were placed a catheter in subarachnoid cavity. Three days later, the RvD1 10 μl (10 ng/μl) and 100% ethanol 10 μl were injected into subarachnoid cavity through the catheter once a day for 14 consecutive days. Another 36 normal rats were served as normal control group (group N) and were fed with common forage. MWT and TWL were measured at 1, 3, 7, 14 days after Subarachnoid injection, then the nine rats’ spinal cord of the lumbar segment 4～6 were removed to detect the expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS) and arginase 1(Arg1) by Western blot, the marker of microglia M1 and M2 polarization. Results: Compared with group N, MWT was decreased significantly and TWL was shortened, the expression of Arg1 was down-regulated and the expression of iNOS was up-regulated in spinal dorsal horn at the 1, 3, 7, 14 days in groups D and S (P<0.05). Compared with group D, MWT was significantly increased and TWL was prolonged, the expression of Arg1 was up-regulated and the expression of iNOS was down-regulated in spinal dorsal horn at the 7, 14 days in group R (P<0.05). There was no significant difference in the MWT, TWL and expression of Arg1 and iNOS between D and S groups. Conclusion: RvD1 promotes microglia toward M2 polarization and alleviates type 2 diabetic neuropathic pain in rats.

rats; T2DM; the spinal dorsal horn; microglia polarization; RvD1; Arg1; iNOS

國家自然科學基金(81073125)

2016-11-14

2017-02-20

R614

A

1000-6834(2017)03-277-05

10.12047/j.cjap.5521.2017.067

△【通訊作者】Tel： 13758497562； E-mail： caohongwz@163.com