豆粕中粗蛋白含量測定的不確定度評定

張美玲

摘要按照《飼料中粗蛋白測定方法》GB/T 6432—1994標準測定豆粕中粗蛋白的含量，通過計算測量過程中的系統(tǒng)因素和隨機因素導致的不確定度，最終來評定豆粕中粗蛋白測定的不確定度。

關鍵詞豆粕；粗蛋白；不確定度

中圖分類號S816文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）26-0109-04

Evaluation of Uncertainty in Determination of Crude Protein in Soybean Meal

ZHANG Meiling

（China Certification & Inspection Group Shandong Test Co.，Ltd.， Qingdao，Shandong 266032）

AbstractThe content of crude protein in soybean meal was determined according to Determination Method of Crude Protein in Forage GB/T 6432—1994， and the uncertainty caused by random factors and system factors in the process of measurement was calculated，and the uncertainty of crude protein in soybean meal was finally evaluated.

Key wordsSoybean meal；Protein；Uncertainty

豆粕是食用油生產(chǎn)鏈下游產(chǎn)品，常被用于生產(chǎn)飼料，是一種營養(yǎng)價值全面的原料。豆粕品質(zhì)評價指標有很多，其中最重要的就是粗蛋白含量。對豆粕中所含蛋白含量的檢測結果進行不確定度評定，既可以滿足實驗室對檢測結果進行不確定度評定[1]的能力要求，又可以在不確定度影響到對限度符合性判斷時進行檢測結果的不確定度判定。尤其是當檢測值處于標準的臨界值時，計算不確定度一方面能檢查檢測工作是否存在差錯，另一方面也能減輕檢測人員和檢測機構的風險，更利于檢測結論的判定。

測定豆粕中的粗蛋白含量大多采用凱氏定氮法。凱氏定氮法的原理[2]如下：使用強酸硫酸破壞有機物，加入催化劑，樣品中的含氮物被轉化為硫酸銨，使用強堿蒸餾使氨氣逸出，硼酸來吸收氨氣，吸收液被酸滴定，測出樣品的含氮量，乘以換算系數(shù)6.25，計算出粗蛋白含量。筆者按照《飼料中粗蛋白測定方法》GB/T 6432—1994標準測定豆粕中粗蛋白含量，通過計算測定過程中的系統(tǒng)因素和隨機因素導致的不確定度，最終來評定豆粕中粗蛋白測定的不確定度。

1試劑與儀器設備

1.1試劑

硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、40%氫氧化鈉溶液、甲基紅、2%硼酸溶液、溴甲酚綠混合指示劑、鹽酸、蔗糖，均為分析純。

1.2儀器設備

樣品篩（0.5 mm）；多功能粉碎機；50 mL酸式滴定管；電子天平（感量0.000 1 g）；250 mL錐形瓶；消煮爐；300mL消化管；自動凱氏定氮儀。

2測定步驟與測定結果

2.1測定步驟

2.1.1消煮樣品。稱取0.5 g豆粕樣品（精確至0.000 2 g）放入消化管中；加入混合催化劑（0.4 g硫酸銅、6 g硫酸鉀），加入硫酸12 mL，將消化管放到消化爐上消煮。先慢火，樣品小火焦化后，泡沫開始消失，再調(diào)高爐子溫度，分2個梯度升高到420 ℃，在420 ℃下消化1 h以上，直到消化液的顏色呈現(xiàn)透明的藍綠色，取出消化管，放在架子上冷卻，再加入30 mL蒸餾水。

2.1.2蒸餾氨。自動定氮儀按照作業(yè)程序操作，將消化好的消化管放到蒸餾裝置上，錐形瓶中加入25 mL硼酸作為吸收液，加入混合指示劑2滴，向消煮管中加入50 mL氫氧化鈉溶液，蒸餾5 min，吸收液體積在120 mL左右，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，收集沖洗液，卸下錐形瓶。

2.1.3滴定。將吸收液用0.1 mol/L的鹽酸溶液滴定，滴定終點是藍綠色的試液變成灰紅色。

2.1.4測定空白。不稱量樣品，只稱量蔗糖0.5 g，其他步驟同豆粕樣品的操作步驟一致，消耗約0.2 mL 0.1 mol/L鹽酸標準溶液，否則，查找原因，重新補測。

2.2測定結果

取待測樣品豆粕，分別獨立操作8次，檢測結果見表1。

3數(shù)學模型建立及不確定度來源分析

3.1數(shù)學模型建立

w（%）=（V-V0）×C×0.014 0×6.25×100/m（1）

式中，w為測得的粗蛋白含量（%）；

V為滴定試樣時所需標準酸溶液體積（mL）；

V0為滴定空白時所需標準酸溶液體積（mL）；

C為鹽酸標準溶液濃度（mol/L）；

m為試樣質(zhì)量（g）；

0.014 0為每毫克當量氮的克數(shù)；

6.25為氮與蛋白質(zhì)換算的平均系數(shù)。

3.2不確定度分析來源

①鹽酸標準溶液的濃度；

②樣品的制備過程；

③樣品中粗蛋白含量的測定；

④A類不確定度——重復性測量帶來的不確定度。

4不確定度分量計算

4.1鹽酸標準溶液濃度的不確定度

4.1.1數(shù)學模型的建立。

按照實驗室標準溶液程序配制鹽酸標準溶液，2個人對其濃度進行標定，列出數(shù)學公式：

c（HCl）=m×w0×2×1 000/（V1-V2）×M（2）

式中，c（HCl）表示標準鹽酸溶液的濃度（mol/L）；

m表示基準物質(zhì)無水碳酸鈉的質(zhì)量（g）；

V1表示鹽酸標準溶液滴定量（mL）；

V2表示空白消耗鹽酸標準溶液的量（mL）；

w0表示基準物質(zhì)無水碳酸鈉純度（g/g）；

1 000為換算系數(shù)，由mL轉化為L；

2為Na+參加反應的個數(shù)；M表示基準物質(zhì)無水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量，為105.988 g/mol。

4.1.2不確定度的來源分析。

鹽酸標準溶液的濃度主要有5個不確定度來源[3]，包括重復性測量、無水碳酸鈉的稱重、碳酸鈉的摩爾質(zhì)量、滴定體積、最終濃度的數(shù)值修約。

4.1.3計算不確定度。

4.1.3.12人重復性標定鹽酸產(chǎn)生的標準不確定度。

用精密天平稱量0.2 g無水碳酸鈉，置于270～300 ℃高溫爐中灼燒2 h，加入50 mL水溶解，加入甲基紅-溴甲酚綠指示劑5滴，用配制的鹽酸溶液滴定碳酸鈉，溶液由綠色變?yōu)榘导t色，即為滴定終點，2 min內(nèi)煮沸，用涼水立即冷卻，繼續(xù)滴定至溶液再度呈現(xiàn)暗紅色。同時，測定2個空白。2人標定鹽酸標準溶液的結果見表2。

表2中的計算結果屬于A類重復性測量不確定度[4]。計算單次測量的標準差采用貝塞爾公式計算（n=8），

則：u（x）=Sx=sn=9.91×10-5（mol/L），μ（x）=n-1=7。

4.1.3.2基準物質(zhì)無水碳酸鈉帶入的標準不確定度。

4.1.3.2.1試劑純度引入的標準不確定度u（p）。

基準碳物質(zhì)酸鈉的純度為（100.00±0.05）%，可認同為矩形分布（K=3），μ=∞。

u（p）=0.000 5/K=0.000 5/=0.000 288 7（g），μ（p）=∞

相對標準不確定度（%）=u（p）p=u（p）100%=0.000 288 7

4.1.3.2.2稱量帶入的標準不確定度u（m）[5]。

干燥器與天平稱量倉內(nèi)均放置同質(zhì)硅膠，可認為濕度相同，稱量時不會吸潮。天平稱量允差為±0.1 mg（查閱電子天平檢定證書）；視為矩形分布（K=3），μ=∞。

u（m）=0.000 1/K=5.77×10-5（g），μ（m）=∞

相對標準不確定度（%）=u（m）m=u（m）0.199 8=2.89×10-4

4.1.3.2.3基準物質(zhì)無水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量帶入的標準不確定度。

基準無水碳酸鈉摩爾質(zhì)量產(chǎn)生的標準不確定度不大，可以忽略。

4.1.3.2.4滴定體積帶入的標準不確定度u（v）。

（1）滴定管校準帶入的標準不確定度。

50 mL酸式滴定管（A級），相對允許誤差為±0.05 mL（查閱校準證書），按照矩形分布（K=3），μ=∞。

u（V1）= u1（V2）=0.05/K=0.028 9 mL，μ（v）=∞

（2）溫度變化引入的標準不確定度u（v1）。

試驗在控溫設備條件下進行，設室溫變化范圍為（20±3）℃。滴定管的體積變化小于液體體積變化，V1=37.64 mL，V2=0.02 mL，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃，依照矩形分布（K=3），μ=∞。

u2（V1）=3×2.1×10-4×V/K=3×2.1×10-4×37.64/3=0.013 7（mL），μ（v1）=∞

u2（V2）=3×2.1×10-4×V/K=3×2.1×10-4×0.02/3=7.27×10-5（mL），μ（v2）=∞

（3）滴定體積合成不確定度分量。

u（V1）2=u1（V1）2+u2（V1）2，u（V1）=0.028 92+0.013 72=3.20×10-2（mL）

u（V2）2=u1（V2）2+u2（V2）2，u（V2）=0.028 92+0.000 007 272=2.90×10-2（mL）

u（V1-V2）=0.0322+0.0292=4.32×10-2（mL）

相對標準不確定度（%）=u（v1-v2）v1-v2=u（v1-v2）37.64-0.02= 1.15×10-3

4.1.3.3鹽酸標準溶液濃度的數(shù)值修帶入的標準不確定度。

2人進行試驗，每人做4個平行，測定的鹽酸標準溶液的平均濃度值為0.100 2 mol/L，按照均勻分布處理，K=3，屬于 B類評定，因此其標準溶液濃度的修約的標準不確定度 u（r）為：

u（r）=aK=0.000 1/23=2.89×10-5 （mol/L）

相對標準不確定度（%）=u（r）c=2.88×10-4

4.1.3.4鹽酸標準溶液的不確定度。

鹽酸標準溶液的不確定度分量分析結果見表3。

4.1.3.5鹽酸標準溶液濃度平均值的B類相對合成標準不確定度的計算。

標定體積、測量的重復性、基準試劑無水碳酸鈉質(zhì)量等不確定度相互獨立，故應將上述數(shù)據(jù)合成，得到鹽酸的相對合成標準不確定度：

UB（c）=[u（m）m]2+[u（p）p]2+[u（v1-v2）v1-v2]2+[u（r）r]2=

1.25×10-3

4.1.3.6鹽酸標準溶液濃度平均值的不確定度U（c）（A類+B類）。

鹽酸標準溶液濃度平均值的不確定度U（c）為：

U（c）= uA（c）2+uB（c）2=

0.000 9912×0.100 22+0.001 252×0.100 2=

0.000 159 8（mol/L）

鹽酸標準溶液濃度的相對不確定度為：

U（c）rep=0.000 159 8/0.100 2=0.001 6

4.2樣品制備不確定度的評定

試驗采用的樣品經(jīng)粉碎機粉碎后，過0.5 mm的篩網(wǎng)，再次混合均勻，取樣。因此，樣品不均勻產(chǎn)生的不確定度，可以忽略。

4.3樣品中粗蛋白含量測定不確定度的評定

4.3.1樣品稱量的不確定度。

稱量所用精密天平（萬分之一），型號為AB-204N；

電子天平檢定證書中天平稱量允許誤差為±0.1 mg；視為矩形分布（k=3），進行B類不確定度評定，其標準不確定度為：

u（mr）=0.000 13=5.774×10-5

則稱量的相對不確定度為：

ur（mr）= u（mr）/0.503 2=0.000 114 7

4.3.2滴定的不確定度評定。

4.3.2.1

50 mL酸式滴定管帶入的不確定度。

50 mL酸式滴定管，按照矩形分布（k=3），按照檢定規(guī)程，相對允許誤差為±0.05 mL，對其進行B類不確定度的評定，其標準不確定度：

u（Vr）=0.053=0.028 87

則消耗鹽酸體積的相對標準不確定度為：

ur（Vr）= u（Vr）/27.22=0.001 061

4.3.2.2溫度對滴定結果的不確定度影響。

滴定室實際測定溫度為（20±3）℃，滴定管的體積變化小于液體體積變化，Va=27.22 mL，Va0=0.10 mL，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃，單位體積產(chǎn)生的變化為±（1×2.1×10-4×3）mL=6.3×10-4 mL。

u（V）=27.22×6.3×10-4 mL/3=0.009 901 mL

u0（V0）=0.10×6.3×10-4mL/3=0.000 036 37 mL

合成滴定體積的不確定度分量：

u（V）2= u（Vr）2+ u（V）2

u（V）=0.030 5（mL）

u（V0）2= u（Vr）2+ u0（V0）2

u（V0）=0.028 9（mL）

溫度對滴定結果產(chǎn)生的標準不確定度為：

u（V-V0）2=u（V）2+u（V0）2

u（V-V0）= 0.042 0（mL）

則相對標準不確定度=0.042 027.22-0.10=0.001 549

4.3.2.3滴定終點對滴定結果的不確定度影響。

該試驗中判斷終點的指示劑是甲基紅-溴甲酚綠。在滴定過程中，滴定終點為灰紅色，pH為4.2～6.3。研究表明，實際滴定時會多消耗一定量的標準滴定液，其不確定度為0.004 mL，肉眼判斷終點滯后，不確定度為0.03 mL。此次滴定平均消耗鹽酸標準溶液27.22 mL。

合成不確定度為：

u（Dr）=0.0042+0.032=0.030 27（mL）

相對合成不確定度為：

ur（Dr）= u（Dr）/27.22=0.001 112

4.3.2.4滴定的合成標準不確定度[6]。

u=u（Vr）2+u（V-V0）2+u（Dr）2=

0.028 872+0.042 02+0.030 272=0.059 28 mL

4.3.2.5滴定的相對合成標準不確定度。

u3=u/27.22=0.002 178

4.4重復性檢測結果帶來的不確定度評定

在一致條件下，測定了8次豆粕中的粗蛋白含量，結果見表1，粗蛋白含量測定結果為47.25%。

測定結果的標準不確定度為：

s=ni=1（wi-）2n-1=0.183 7

u（xi）=sn=0.064 95

測定結果的的相對標準不確定度為：

u（x）= u（xi）/47.25=0.001 375

4.5不確定度分量計算

不確定度分量計算結果見表4。

5結語

建立數(shù)學等式，計算系統(tǒng)因素和隨機因素和帶入的測量不確定度分量，找出豆粕粗蛋白測定的不確定度分量主要來源于4個分量：包括重復性測量的A類評定、天平稱重、消耗標準溶液的體積和標準溶液濃度的B類評定，通過數(shù)值大小比較得出標準溶液濃度影響最大，分量滴定標準溶液體積次之。因此，在標定鹽酸標準溶液時，稱量基準工作試劑的質(zhì)量小于等于0.5 g時，要用十萬分之一分析天平，需2人進行試驗，每人分別做4個平行，其標定結果的相對極差不得大于相對重復性臨界極差，8個平行標定結果的相對極差不得大于相對重復性臨界極差。鹽酸標準滴定溶液的溫度不是20 ℃時，應對標準滴定溶液體積進行補正。在實際工作中，要注意以上關鍵操作點，降低檢測過程中產(chǎn)生的不確定度值。

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