夏枯草提取物清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究

李旎 鄭溢 陳魏 陳良華 林河通

摘 要 在體外模擬人體胃液條件下，采用分光光度法測(cè)定了夏枯草水提取物、醇提取物對(duì)亞硝酸鹽的清除率以及對(duì)亞硝胺合成的阻斷率，并與常用抗氧化劑維生素C進(jìn)行比較。結(jié)果表明：隨反應(yīng)質(zhì)量濃度的提高、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，夏枯草提取物對(duì)亞硝酸鈉的清除能力和阻斷亞硝胺合成能力有明顯提高。根據(jù)不同作用時(shí)間的清除效果及阻斷亞硝胺合成效果的對(duì)比，可以得知，120 min為較佳的作用時(shí)間。通過(guò)與維生素C比較分析得出，夏枯草提取物具有較強(qiáng)的亞硝酸鈉清除能力和阻斷亞硝胺合成的能力。

關(guān)鍵詞 夏枯草；提取物；亞硝酸鹽清除；亞硝胺合成阻斷

中圖分類號(hào) TS202.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The scavenging rate of nitrite and the blocking rate of nitrosamine synthesis by alcohol extract and water extract of Prunella vulgaris L. were measured by spectrophotometry in vitro and compared with the common antioxidant， vitamin C. The results showed that the nitrite scavenging ability and nitrosamine synthesis blocking ability of the extracts of P. vulgaris were significantly improved with the increase of concentration and time. According to the comparison of scavenging rate of nitrite and the blocking rate of nitrosamine synthesis with different time，the optimum reaction time was 120 min. Through the comparison and analysis with vitamin C， it was concluded that P. vulgaris extracts had a strong ability to scavenge nitrite and block nitrosamine synthesis.

Key words Prunella vulgaris L.； extracts； nitrite scavenging； blocking nitrosamine synthesis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.027

亞硝胺能夠促使人體內(nèi)多種器官產(chǎn)生惡性腫瘤，屬于較強(qiáng)致癌物，危害人體健康[1]。亞硝酸鹽作為亞硝胺的前體物質(zhì)，不僅廣泛存在于食物中，也可通過(guò)在人體胃內(nèi)酸性環(huán)境下發(fā)生亞硝化反應(yīng)形成[2]，從而增加人體罹患多種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。故利用食品中的活性成分清除亞硝胺類化合物，從而減輕其對(duì)人體的危害，已成為食品安全領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5]。

根據(jù)之前的研究顯示，黑麥中的多酚類物質(zhì)[6]、總黃酮[7]、精油類物質(zhì)[8-10]以及槲皮素[11]等天然活性成分，具有良好的亞硝酸鹽清除和阻斷亞硝胺合成的效果。夏枯草（Prunella vulgaris L.）是一種藥食同源的多年生草本植物，為唇形科（Lamiaceae）夏枯草屬夏枯草植物的干燥果穗?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，夏枯草具有抗病毒[12]、免疫抑制活性[13]、抗氧化和清除自由基[14]、抗腫瘤[15]等生物活性。鑒于夏枯草的較好的抗氧化效果，推測(cè)夏枯草可能具有亞硝酸鹽清除作用及亞硝胺合成阻斷作用，但目前尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。故本研究在體外模擬人體胃液體系中，研究夏枯草提取物清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的作用，為夏枯草產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用開(kāi)辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 夏枯草采購(gòu)自廈門市同仁堂藥店。對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、α-萘胺、二甲胺、二甲基亞砜等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。

1.1.2 儀器與設(shè)備 Cary50紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)瓦里安有限公司；UJ1434001型水浴鍋，英國(guó)Grant公司；Eyela N-1200BV-WD型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海東京理化器械公司。

1.2 方法

1.2.1 夏枯草醇提取物的制備 夏枯草去雜，磨成粉末，過(guò)80目篩。以95%乙醇為溶劑，在50 ℃條件下超聲浸提20 min，提取濾液，對(duì)濾渣反復(fù)以上步驟3次，料液比分別為1 ∶ 15、1 ∶ 9、1 ∶ 6（g/mL），合并濾液，經(jīng)活性炭脫色處理，減壓過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏，真空冷凍干燥得夏枯草醇提取物粉末，用二甲基亞砜溶液溶解稀釋至梯度濃度，備用。

1.2.2 夏枯草水提取物的制備 夏枯草去雜，磨成粉末，過(guò)80目篩。以蒸餾水為溶劑，在50 ℃條件下超聲浸提20 min，提取濾液，對(duì)濾渣反復(fù)以上步驟3次，料液比分別為1 ∶ 15、1 ∶ 9、1 ∶ 6（g/mL），合并濾液，95%乙醇沉淀去除雜質(zhì)，過(guò)濾取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏，真空冷凍干燥即得夏枯草水提取物粉末，用蒸餾水溶解稀釋至梯度濃度，備用。

1.2.3 模擬胃液的制備 稱取胃蛋白酶3.2 g，NaCl 2.0 g，蒸餾水溶解，定容至1 000 mL，鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.0。

1.2.4 夏枯草提取物對(duì)亞硝鹽清除率的測(cè)定 參考盛瑋等[16]的方法測(cè)定亞硝鹽清除率，略有修改。分別取不同濃度的樣液2.0 mL，加入4.0 mL檸檬酸鈉-鹽酸緩沖溶液，再加入0.5 mL 1.0 mmol/L NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液，于37 ℃水浴，根據(jù)時(shí)間梯度，分別于30、60、120、180 min取出，加入1.0 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸，靜置5 min，加0.5 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，靜置15 min。540 nm波長(zhǎng)下測(cè)樣品吸光度As，蒸餾水代替NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白對(duì)照，測(cè)其吸光度值A(chǔ)o，以蒸餾水代替樣品溶液測(cè)出樣液本底吸光度值A(chǔ)b，計(jì)算清除率S=[Ao-（As-Ab）]/Ao×100%。平行重復(fù)3次，并求平均值。

1.2.5 夏枯草提取物亞硝胺合成阻斷率的測(cè)定

夏枯草對(duì)亞硝胺合成阻斷率的測(cè)定參考傅茂潤(rùn)等[17]和郭艷華等[18]方法，略有修改。分別取不同濃度樣液0.4 mL，加入2 mL檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液，0.2 mL 1 mmol/L NaNO2溶液，0.2 mL 1 mmol/L二甲胺溶液，加入2.4 mL蒸餾水，于37 ℃的恒溫水浴，根據(jù)時(shí)間梯度，分別于30、60、120、180 min時(shí)刻，移取1.0 mL反應(yīng)液，加入0.5 mL 0.5% Na2CO3溶液，于254 nm波長(zhǎng)紫外燈下，照射處理15 min后，加入1.5 mL 1%的對(duì)氨基苯磺酸、1.5 mL 0.1%的α-萘胺、0.5 mL蒸餾水，靜置15 min。525 nm波長(zhǎng)下測(cè)樣品吸光度值A(chǔ)s；以蒸餾水代替NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液，作為空白對(duì)照，測(cè)其吸光度值A(chǔ)o，以蒸餾水代替樣品液測(cè)得樣液本底吸光度值A(chǔ)b，計(jì)算阻斷率X=[Ao-（As-Ab）]/Ao×100%。平行重復(fù)3次，并求平均值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Stata軟件處理，進(jìn)行一般線性模型分析和擬合線圖分析，通過(guò)SPSS19.0進(jìn)行IC50值計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 夏枯草提取物對(duì)亞硝酸鹽的清除作用

不同質(zhì)量濃度的夏枯草水提取物（0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL）在體外模擬胃液反應(yīng)條件下，其對(duì)亞硝酸鹽的清除效果如圖1。清除效果隨著提取物濃度的增加而增強(qiáng)?？疾旆磻?yīng)時(shí)間對(duì)清除效果的影響發(fā)現(xiàn)，樣液濃度在≤1.50 mg/mL時(shí)，亞硝酸鹽清除率在前1 h內(nèi)，表現(xiàn)為隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，清除率略微下降，但繼續(xù)延長(zhǎng)處理時(shí)間，清除率幾乎都表現(xiàn)為明顯的上升。當(dāng)水浴時(shí)間為30、60、120和180 min時(shí)，水提取物溶液對(duì)亞硝酸鹽的清除效果半數(shù)抑制率IC50值分別為0.519、0.676、0.327和0.290 mg/mL。綜合考慮樣液質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，可以看出，夏枯草水提取物清除亞硝酸鹽的最適質(zhì)量濃度1.00 mg/mL，最佳反應(yīng)時(shí)間為120 min，清除率為90.68%。

不同質(zhì)量濃度的夏枯草醇提取物（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL）在體外模擬胃液反應(yīng)條件下，其對(duì)亞硝酸鹽的清除效果如圖2。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間較短，即反應(yīng)時(shí)間為30 min和60 min時(shí)，夏枯草醇提溶液對(duì)亞硝酸鹽的清除效果較差。而當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，其清除效果表現(xiàn)為隨處理時(shí)間增長(zhǎng)而顯著上升。在作用時(shí)間相同的情況下，夏枯草醇提溶液的亞硝酸鹽清除率表現(xiàn)為隨樣液質(zhì)量濃度增加而增大的趨勢(shì)。水浴時(shí)間為30、60、120和180 min時(shí)，夏枯草醇提取物對(duì)亞硝酸鹽的清除效果的半數(shù)抑制率IC50值分別為1.659、1.408、0.376、0.341 mg/mL。綜合考慮樣液質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，可以看出，夏枯草醇提取物清除亞硝酸鹽的最適質(zhì)量濃度為2.00 mg/mL，最佳反應(yīng)時(shí)間為120 min，清除效果可高達(dá)92.06%。

2.2 夏枯草提取物對(duì)亞硝胺合成的阻斷作用

由圖3可知，在模擬胃液反應(yīng)體系中，夏枯草水提取物對(duì)亞硝胺合成的阻斷效果也與其樣液濃度呈正相關(guān)。水浴時(shí)間為30、60、120和180 min時(shí)，夏枯草水提取物對(duì)亞硝胺合成的阻斷效果的半數(shù)抑制率IC50值分別為2.159、1.759、0.922、0.899 mg/mL。綜合考慮樣液質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，可見(jiàn)，夏枯草水提取物清除亞硝酸鹽的最適質(zhì)量濃度2.50 mg/mL，最佳反應(yīng)時(shí)間為120 min，阻斷效果可達(dá)94.27%。

由圖4可知，夏枯草醇提取物對(duì)亞硝胺合成的阻斷能力與其濃度同樣呈正相關(guān)。水浴時(shí)間為30、60、120和180 min時(shí)，夏枯草醇提取物對(duì)亞硝胺合成的阻斷效果的半數(shù)抑制率IC50值分別為6.589、5.182、3.320、1.614 mg/mL。該結(jié)果表明夏枯草醇提取物具有阻斷亞硝胺合成的作用，且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而阻斷率提高。綜合考慮樣液質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，可以看出，夏枯草醇提取物清除亞硝酸鹽的最適質(zhì)量濃度7.50 mg/mL，最佳反應(yīng)時(shí)間為120 min，阻斷效果可達(dá)92.89%。

2.3 夏枯草提取物對(duì)亞硝酸鹽清除效果

由表1、2可知，亞硝酸鹽的清除率與夏枯草水提取物的質(zhì)量及不同作用時(shí)間均呈統(tǒng)計(jì)顯著的正相關(guān)關(guān)系。根據(jù)回歸分析，R2表示清除率變異的83%由夏枯草水提取物質(zhì)量濃度導(dǎo)致。當(dāng)其他因素不變時(shí)，作用時(shí)間每增加1 min，清除率平均增長(zhǎng)0.16%；當(dāng)其他因素不變時(shí)，夏枯草水提取物質(zhì)量濃度每增加1 mg/mL，清除率平均增長(zhǎng)32.70%。即對(duì)該體系的亞硝酸鹽清除作用中，由夏枯草水提取物的質(zhì)量濃度占主導(dǎo)作用。

由表3、4可知，亞硝酸鹽的清除率與夏枯草醇提取物的質(zhì)量濃度及不同作用時(shí)間均呈線性關(guān)系，差異性極顯著。根據(jù)表4中F檢驗(yàn)的P值及R2可知，本模型總體統(tǒng)計(jì)顯著，擬合度較高。當(dāng)其他因素不變時(shí)，作用時(shí)間每增加1 min，清除率平均增加0.27%，當(dāng)其他因素不變時(shí)，醇提取物質(zhì)量濃度每增加1 mg/mL，清除率平均增長(zhǎng)13.29%。即夏枯草醇提取物的質(zhì)量濃度對(duì)亞硝酸鹽的清除作用影響較大。

2.4 夏枯草提取物對(duì)亞硝胺合成阻斷結(jié)果

由表5、6可知，亞硝胺合成的阻斷率與夏枯草提取物的質(zhì)量濃度以及不同作用時(shí)間均呈線性關(guān)系，阻斷效果伴隨提取物質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，伴隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，差異性極顯著。根據(jù)圖6可知，由于F檢驗(yàn)的P值為0，模型總體是統(tǒng)計(jì)顯著的，R2大于80%，說(shuō)明模型的擬合度較高，模型較好。當(dāng)其他因素不變時(shí)，處理時(shí)間每增加1 min，清除率平均增加0.17%；在其他因素不變情況下，夏枯草水溶液質(zhì)量濃度每增加1 mg/mL，清除率平均增長(zhǎng)6.15%。提取方式和阻斷率在1%顯著性下相關(guān)，醇提溶液較水提溶液在其他因素不變的情況阻斷率平均低28%，即在相同體系下，相同質(zhì)量濃度的夏枯草水提取物比醇提取物能夠更好阻斷亞硝胺合成。

2.5 夏枯草提取物與維生素C對(duì)亞硝酸鹽清除能力與亞硝胺合成阻斷能力的比較

以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果如表7所示。當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL，作用時(shí)間為60 min時(shí)，夏枯草水提取物清除亞硝酸鹽的能力較維生素C低29.87%，夏枯草醇提取物清除亞硝酸鹽的能力較維生素C低53.30%，夏枯草水提取物阻斷亞硝胺合成的能力為相同體系下的維生素C阻斷能力的56.38%，而夏枯草醇提取物對(duì)亞硝胺合成阻斷的能力為維生素C的12.31%。這說(shuō)明夏枯草提取物能夠有效對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行清除和阻斷體系內(nèi)亞硝胺的合成。說(shuō)明夏枯草可能具有一定的腫瘤化學(xué)預(yù)防作用，可作為抑亞硝化清除劑或腫瘤預(yù)防劑。

3 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)多篇文獻(xiàn)報(bào)道了眾多植物提取物在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中在清除亞硝酸鹽和對(duì)阻斷亞硝胺合成上具有良好的效果[19-22]。本實(shí)驗(yàn)表明，在模擬人體胃液條件下，夏枯草水提取物溶液和醇提取物溶液均能有效的清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的合成，其中水提取物效果較好。亞硝酸鹽的清除率和亞硝胺合成的阻斷率與提取物質(zhì)量濃度及作用時(shí)間呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，而夏枯草提取物的質(zhì)量濃度對(duì)亞硝酸鹽的清除率和亞硝胺合成的阻斷率的相關(guān)性較大。

之前的研究顯示，夏枯草中主要含有三萜及其皂苷，酚酸，甾醇及其苷，黃酮[23]及其苷，有機(jī)酸，揮發(fā)油及糖類等成分[24-26]。藥效關(guān)系研究表明，抗氧化活性成分多為多糖[27-28]。亞硝酸鹽在酸性環(huán)境下，通常以氧化性為主，則抗氧化物質(zhì)通過(guò)還原作用達(dá)到清除亞硝酸鹽的目的。當(dāng)往夏枯草提取物溶液中加入亞硝酸鈉與二甲胺時(shí)，夏枯草提取物優(yōu)先與亞硝酸鈉發(fā)生反應(yīng)，避免了二甲胺與亞硝酸鈉生成二甲基亞硝胺。本實(shí)驗(yàn)中，夏枯草水提取物對(duì)亞硝酸鹽的清除效果及對(duì)亞硝胺合成的阻斷效果，相較于夏枯草醇提取物更佳，可能是因?yàn)樗崛∥镏泻写罅慷嗔u基多糖類化合物，抗氧化性較強(qiáng)，清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的能力也較強(qiáng)。但本實(shí)驗(yàn)的供試材料夏枯草的水提取物和醇提取物均是植物粗提取物，其發(fā)揮主要作用的成分尚不能確定。因而后續(xù)的研究可進(jìn)一步對(duì)提取物進(jìn)行柱色譜分離純化、并探討其與亞硝酸鹽作用的構(gòu)效關(guān)系，同時(shí)進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià)分析，為體內(nèi)胃酸條件下亞硝胺的控制提供理論指導(dǎo)和技術(shù)參考。

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