甘蔗褐銹病菌巢式PCR分子檢測方法的建立

汪涵 吳偉懷 楊旭光 楊先鋒 李銳 鄭金龍 黃興 梁艷瓊 賀春萍 易克賢

摘 要 為建立甘蔗褐銹病菌巢式PCR分子檢測方法，本研究利用真菌DNA內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1/ITS4擴增甘蔗黑頂柄銹菌DNA，并對其擴增產(chǎn)物進行克隆測序，獲得序列于NCBI網(wǎng)站進行比對分析，并于該序列多態(tài)性豐富區(qū)域設(shè)計了2對引物PM2F/R、PM3F/R。通過對同寄主不同病原菌、以及不同屬的銹菌DNA進行PCR檢測以驗證引物的特異性。結(jié)果表明，在優(yōu)化的單一PCR反應(yīng)體系與程序條件下，2對引物均僅能從甘蔗黑頂柄銹菌中擴增出約474 bp和363 bp的特異條帶，而從其它真菌DNA中均擴增不出任何條帶。進一步將引物PM2F/R作為第一輪擴增引物、PM3F/R作為第二輪擴增引物進行巢式PCR擴增后，其檢測靈敏度在DNA水平上可達0.001 ng/μL，較常規(guī)PCR提高100倍。由此表明，依據(jù)本研究所設(shè)計的2對引物而建立的快速、靈敏、準確的甘蔗黑頂柄銹菌的檢測技術(shù)，對病原菌的早期診斷、快速檢測及病害流行學研究具有重要意義。

關(guān)鍵詞 甘蔗褐銹??；黑頂柄銹菌；巢式PCR分子檢測

中圖分類號 S435.661 文獻標識碼 A

Abstract The objective of this study is to develop a nested-PCR method to rapidly and accurately detect sugarcane brown rust. In the present study， based on the differences in the sequences of internal transcribed spacer（ITS）ITS1-ITS4 sequence ribosomal DNA of P. melanocephala in sugarcane and the other closely related species at the NCBI web， two pairs of primers PM2F/R and PM3F/R were designed and a PCR assay was developed. Among the same host and rust fungi of different genera including brown rust was implemented to determine the primer specificity that two pairs of primers were amplified， only two PCR bands of 474 bp and 363 bp were amplified with DNA extracted from all isolates of P. melanocephala in sugarcane， while other tested isolates had no corresponding bands. The detection sensitivity increased 100-fold to 0.001 ng/μL genomic DNA by developing a nested PCR procedure with bacterial universal primer pair PM2F/R as the first round primers and PM3F/R as the second round primers. Therefore， this study set up a fast， sensitive and accurate nested PCR detection system of sugarcane brown rust pathogen. It has important significance in early diagnosis， and rapid detection and research on epidemiology of sugarcane brown rust.

Key words Sugarcane brown rust disease； Puccinia melanocephala Sydow； nested PCR detection system

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.021

由黑頂柄銹菌（Puccinia melanocephala Sydow）引起的甘蔗褐銹病是我國甘蔗種植區(qū)普遍發(fā)生的一種病害。該病依賴夏孢子傳播，借風力附著在葉片表面，經(jīng)氣孔侵入植物體內(nèi)。主要為害葉片，老葉較幼葉易感病。病斑分布較分散，多發(fā)自葉頂端。初期病斑長形，淡綠色至黃色；后期病斑擴大，長2～10 mm，有時可達30 mm，寬1～3 mm。夏孢子堆呈紅褐色，主要著生在葉背，嚴重時，葉面也可見。受害后的甘蔗分蘗減少，蔗莖變細[1-4]。甘蔗褐銹病一旦發(fā)生，很容易引起流行，發(fā)病田地一般減產(chǎn)15%～30%，嚴重時減幅可達40%以上[5-6]，已成為世界上普遍發(fā)生，危害最嚴重的甘蔗病害之一。自1977年該病在我國首次發(fā)生以來，現(xiàn)已遍及云南、福建、四川、江西、海南和廣東等蔗區(qū)，造成甘蔗產(chǎn)量及其含糖量的極大損失[7-9]，嚴重影響了蔗糖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展[10-11]。

目前甘蔗褐銹病的防治仍以加強檢疫、推廣脫毒健康苗和選用抗病品種為主，以栽培管理和藥劑防治為輔。因此，建立一種快速、高效、實用的甘蔗褐銹病早期檢測技術(shù)，對病害防治具有重大意義。迄今為止，針對甘蔗黑頂柄銹菌的檢測技術(shù)已有傳統(tǒng)田間診斷、免疫學診斷、分子檢測診斷等[12]，其中傳統(tǒng)田間診斷一直以來都是甘蔗銹病的主要檢測方法，該方法主要通過外部形態(tài)觀察發(fā)病癥狀，顯微觀察孢子形態(tài)確認是否感病，但耗時長，靈敏度較低，結(jié)果的準確性和可信度也在很大程度上取決于檢測人員的技術(shù)水平和經(jīng)驗，很容易錯過病害防治的最佳時期；免疫學診斷也存在耗時長，易出現(xiàn)假陽性等缺點[13]；比較而言，以PCR為基礎(chǔ)的分子檢測技術(shù)具有快速、靈敏度較高的優(yōu)點。

針對甘蔗黑頂柄銹菌常規(guī)PCR分子檢測技術(shù)雖已建立[14]，但該檢測技術(shù)靈敏度較低[15]，比較而言，巢式PCR具有更高靈敏性。目前，巢式PCR檢測技術(shù)已經(jīng)在甘蔗黑穗病菌[16]，西瓜細菌性果斑病菌[17]，琯溪蜜柚黑斑病菌[18]，辣椒疫霉菌[19]，煙草青枯病菌[20]等多種植物病原菌檢測中得以應(yīng)用。而黑頂柄銹菌的巢式PCR檢測技術(shù)鮮有報道[21-22]。為此，本研究基于真菌種間ITS區(qū)段序列高度變異和種內(nèi)穩(wěn)定性特點，設(shè)計2對甘蔗黑頂柄銹菌特異性引物，旨在建立甘蔗黑頂柄銹菌的巢式PCR檢測體系，以期為該菌的早期診斷、快速檢測等提供新的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本實驗采用甘蔗褐銹病菌（Puccinia melanocephala Sydow）、甘蔗黑穗病菌（Ustilago scitaminea）、甘蔗環(huán)斑病菌（Leptosphaeria sacchari Breda）、甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum）、甘蔗黃銹病菌（Puccinia kuehnii）、咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）、葡萄層銹菌（Phakopsora ampelopsidis Diet.et syd.）、雞蛋花鞘銹菌（Coleosporium plumierae）等作為供試菌株。供試菌株具體寄主來源詳見表1，所有菌株DNA均保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所。

1.1.2 試劑 DL 2 000標準分子量，10×rTaq Buffer，2.5 mmol/L dNTPs，以及rTaq DNA Polymerase均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA提取 甘蔗褐銹病菌DNA采用CTAB法提取，其他供試菌株的DNA均采用真菌DNA提取試劑盒（E.Z.N.ATM Fungal DNA kit，Omega公司，美國）提取，具體實驗步驟參考說明書進行。

1.2.2 甘蔗黑頂柄銹菌ITS序列的重組質(zhì)粒構(gòu)建及特異性引物設(shè)計 利用真菌ITS系列擴增通用引物ITS1/ITS4[23]，采用20 μL反應(yīng)體系：ddH2O 14.2 μL，10×rTaq Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，rTaq DNA Polymerase 0.2 μL，10 μmol/L的上下通用引物各0.5 μL，DNA模板（30 ng/μL）1 μL，對甘蔗黑頂柄銹菌基因組DNA進行擴增。PCR反應(yīng)在Mastercycler gradient Mastercycler PCR擴增儀上進行。反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。擴增結(jié)束后取8 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)檢測并拍照保存。取4 μL PCR擴增產(chǎn)物與T1載體連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌培養(yǎng)，采用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒，提取構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA，委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司廣州實驗室測序。

將測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中已登錄的銹菌近緣種基因進行同源序列比較，選取多態(tài)性豐富位點進行引物設(shè)計，設(shè)計好的引物委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司廣州合成部合成。

1.2.3 巢式PCR擴增體系及條件優(yōu)化 單一PCR反應(yīng)體系與巢式PCR擴增體系一致，均為20 μL反應(yīng)體系，其具體程序與參數(shù)同1.2.2。以單一體系為參考，分別對巢式PCR擴增內(nèi)外2輪引物的退火溫度進行優(yōu)化，分別設(shè)置55、58、61、64 ℃ 4個溫度梯度，并對其擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。

1.2.4 引物特異性分析 基于引物的最佳退火溫度，選取4個甘蔗黑頂柄銹菌、2個甘蔗赤腐病菌、2個甘蔗黑穗病菌、2個甘蔗環(huán)斑病菌、2個甘蔗黃銹病菌、2個咖啡駝孢銹菌、葡萄層銹菌與雞蛋花鞘銹菌各1個，共16個菌株基因組DNA為模板進行PCR擴增，并以滅菌ddH2O為陰性對照，檢測2對引物的特異性。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，克隆測序，通過序列比對驗證其準確性。

1.2.5 靈敏度檢測 通過超微量分光光度計（NanoDrop 2000c）將甘蔗黑頂柄銹菌ITS序列的重組質(zhì)粒DNA初始濃度調(diào)整為100 ng/μL，采用10倍梯度稀釋法依次稀釋為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL共7個不同濃度梯度。分別取1 μL甘蔗黑頂柄銹菌ITS序列的重組質(zhì)粒DNA為模板，以合成的2對引物分別進行單獨PCR擴增，反應(yīng)體系和擴增程序同1.2.4。反應(yīng)結(jié)束后將PM2F/R PCR產(chǎn)物稀釋10倍，分別取1 μL為DNA模板，用引物PM3F/R進行第2輪PCR擴增，反應(yīng)體系與擴增程序同1.2.4。擴增結(jié)束后取8 μL 2輪的PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 田間發(fā)病甘蔗植株檢測 采集田間不同發(fā)病程度的甘蔗葉片，以發(fā)病程度從高到低的甘蔗植株基因組DNA（30 ng/μL）為模板，依次為3株發(fā)病典型癥狀，2株發(fā)病輕微癥狀，2株疑似癥狀、2株病害爆發(fā)區(qū)域內(nèi)的無病癥葉片。甘蔗黑頂柄銹菌ITS序列的重組質(zhì)粒DNA為陽性對照，以甘蔗健康植株基因組DNA為陰性對照。用PM2F/R、PM3F/R引物分別進行常規(guī)PCR檢測與巢式PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異引物的設(shè)計與同源性分析

將測序結(jié)果與近源種進行多重比較，獲得了甘蔗黑頂柄銹菌ITS序列多態(tài)性豐富區(qū)域。最終于多態(tài)性區(qū)域內(nèi)設(shè)計了PM2F/R與PM3F/R 2對甘蔗黑頂柄銹菌的特異引物。具體引物序列為：PM2F：5′-GGCTTCATTGCCACATTACC-3′，PM2R：5′-TTTGAGGTCTTAAATGTTAGGGG-3′。PM3F：5′-CATAAACACTATATTAAAGATTTTGAAG-3′，PM3R：5′-GTATTGCTACTTTCCTTGATGCTC-3′。2者包含引物序列在內(nèi)的預(yù)期片段大小分別為474、363 bp。將2對引物序列分別于NCBI網(wǎng)站中進行同源性搜索，結(jié)果均顯示只與NCBI數(shù)據(jù)庫中甘蔗黑頂柄銹菌具有100%的同源性。

2.2 PCR擴增體系退火溫度優(yōu)化

優(yōu)化結(jié)果表明，引物PM2F/R在退火溫度為61 ℃條件下，其條帶較為均勻清晰（圖1-A）；而引物PM3F/R在退火溫度為55 ℃和58 ℃條件下其擴增出來的條帶較為清晰（圖1-B）。故后續(xù)擴增中，將引物PM2F/R與PM3F/R的退火溫度分別設(shè)定為61 ℃與58 ℃。

2.3 引物特異性檢測

2對引物均只能從ITS序列的重組質(zhì)粒DNA模板中擴增到預(yù)期的目的條帶，其它同寄主不同病原菌以及不同屬的銹菌DNA均未擴增出任何條帶（圖2）。擴增出的陽性條帶通過克隆測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫中甘蔗黑頂柄銹菌序列完全一致，進一步表明該引物具有很高的特異性。

2.4 普通PCR及巢式PCR靈敏度分析

靈敏度檢測結(jié)果表明，當模板濃度稀釋到0.1 ng/μL時，引物PM2F/R與PM3F/R在常規(guī)PCR擴增中均能檢測出預(yù)期目標條帶，而模板濃度為0.01 ng/μL時，二者均未檢測出任何條帶（圖3-A、B），由此表明，引物PM2F/R與PM3F/R在普通PCR擴增中其靈敏度為0.1 ng/μL。而在PM2F/R作為外引物，PM3F/R作為內(nèi)引物的巢式PCR中，當模板濃度稀釋到0.001 ng/μL時，巢式PCR仍能檢測出目標條帶，而當模板濃度稀釋到0.000 1 ng/μL時，未能檢測出任何條帶（圖3-C），由此表明，巢式PCR檢測靈敏度為0.001 ng/μL。換言之，巢式PCR檢測靈敏度是常規(guī)PCR靈敏度的100倍。

2.5 甘蔗田間植株檢測

對9份不同發(fā)病程度的田間甘蔗植株樣品進行檢測，結(jié)果顯示：以引物PM2F/R進行的常規(guī)PCR僅能從其中3份樣品中檢測為陽性，即能穩(wěn)定地擴增出一條分子量為474 bp的特異條帶，其余6份均未檢測出任何條帶（圖4-A）；以引物PM3F/R進行的常規(guī)PCR僅能從其中5份樣品中檢測出條帶，即能穩(wěn)定地擴增出一條分子量為363 bp的特異條帶，其余均未檢測出任何條帶（圖4-B）；而由二者組成的巢式PCR則從全部甘蔗植株樣品中均能檢測出一條分子量為363 bp的特異條帶（圖4-C）。進一步測序比對表明，擴增出的條帶與甘蔗黑頂柄銹菌具有100%的一致性，說明該巢式PCR檢測技術(shù)能用于甘蔗黑頂柄銹菌的快速檢測與診斷。

3 討論

尋找抗銹病品種是目前一種較為重要甘蔗抗銹病的方式，但在病害早期精確靈敏識別病原菌也是非常必要的手段。甘蔗褐銹病早期癥狀與甘蔗其它葉斑病癥，尤其是與黃銹病早期癥狀比較相似，雖然甘蔗褐銹病與黃銹病可以通過田間甘蔗感病癥狀及夏孢子的顏色和形態(tài)加以區(qū)別。但需待孢子堆完全成熟通過高倍顯微鏡才可鑒別，且受繁殖季節(jié)、病原保存、儀器設(shè)備等諸多因素的限制[24]。因此，可利用實用可靠的分子生物檢測技術(shù)來區(qū)別甘蔗褐銹病。但需設(shè)計出高度特異的分子標記。

參照巢式PCR檢測琯溪蜜柚黑斑病菌[18]、煙草青枯病菌[20]采用病原菌通用引物作為第一輪PCR的引物，本實驗通過真菌通用引物ITS1/4，擴增得到黑頂柄銹菌的ITS序列。通過序列比對，在獲得的適宜區(qū)域設(shè)計了2對特異引物（PM2F/R和PM3F/R），分別對同寄主甘蔗赤腐病菌、甘蔗黑穗病菌、甘蔗環(huán)斑病菌、甘蔗黃銹病菌、以及不同屬的咖啡駝孢銹菌菌株基因組進行PCR擴增，最終只有甘蔗黑頂柄銹菌DNA中能夠檢測出大小分別為474、363 bp的條帶，空白對照及其余菌株DNA模板均無擴增產(chǎn)物。通過對擴增產(chǎn)物的克隆測序以及序列比對，驗證了該引物的特異性。由此表明，巢式PCR檢測能夠有效區(qū)分甘蔗褐銹病菌、甘蔗黃銹病菌及其他病原菌，具有高特異性。

分子檢測中靈敏度是衡量檢測技術(shù)的另一個重要參數(shù)。本實驗通過對常規(guī)PCR和巢式PCR檢測甘蔗褐銹病菌DNA模板的靈敏度進行比較分析。結(jié)果顯示常規(guī)PCR能檢測到濃度為0.1 ng/μL的甘蔗褐銹病菌DNA模板，而巢式PCR能檢測到的濃度為0.001 ng/μL，是常規(guī)PCR的100倍，與番石榴焦腐病菌的檢測靈敏度屬于同一級別[25]。可見巢式PCR較常規(guī)PCR更為靈敏。在田間檢測中，相較常規(guī)PCR，巢式PCR能檢測出未顯癥狀的甘蔗植株潛伏期樣品中的病原菌，可滿足對甘蔗褐銹病菌的早期檢測與診斷需求，為及早發(fā)現(xiàn)病害，及時采取防治措施，有效預(yù)防病害的大規(guī)模爆發(fā)，減少產(chǎn)量損失提供了依據(jù)。值得注意的是，相較于常規(guī)PCR檢測，巢式PCR靈敏度雖可提高10～1 000倍，但操作過程中極易造成污染[15]。因此，實際操作過程中需進行嚴格細致的實驗操作，以防假陽性的出現(xiàn)。

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