霍山石斛PMM基因的克隆及其表達(dá)分析

林榕燕 鐘淮欽 葉秀仙 黃敏玲

摘 要 為研究磷酸甘露糖變位酶基因（PMM）的功能及其在多糖生物合成中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以霍山石斛原球莖為材料，利用RT-PCR技術(shù)，克隆PMM基因，對(duì)其 cDNA序列和表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：霍山石斛PMM基因cDNA序列長(zhǎng)949 bp，包含一個(gè)747 bp的開(kāi)放閱讀框，共編碼248個(gè)氨基酸，GenBank中的登錄號(hào)為KY912084。生物信息學(xué)分析表明：該蛋白屬于HAD超家族，可能是一種穩(wěn)定的、不具有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)的親水蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，霍山石斛PMM與鐵皮石斛、海棗、油棕、蘆筍親緣關(guān)系較近，處于同一分支。qPCR結(jié)果顯示：PMM基因在莖中的相對(duì)表達(dá)量最高；在4種不同藥用石斛比較中，鼓槌石斛的相對(duì)表達(dá)量最高，霍山石斛的表達(dá)量最低。本研究結(jié)果表明PMM基因可能不僅參與到石斛多糖的合成，還與其它化合物的生物合成相關(guān)。

關(guān)鍵詞 霍山石斛；PMM基因；克隆；qPCR

中圖分類號(hào) S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In the stusy， the cDNA sequence of PMM gene was isolated from the protocorm by RT-PCR， and its expression level was analyzed to elucidate the function of phosphomannomutase gene and its role during polysaccharides biosynthesis. The results showed that the length of PMM gene（accession number was KY912084 in GenBank）was 949 bp， containing a 747 bp open reading frame encoding 248 amino acids. Bioinformatics analysis showed that the protein belonged to HAD superfamily and might be a kind of hydrophily and stable protein， which had no signal peptide and transmembrane structures. The phylogenetic tree analysis showed that the protein had closer relationship with Dendrobium catenatum， Phoenix dactylifera， Elaeis guineensis and Asparagus officinalis， which at the same branch. qPCR results indicated that PMM gene was highly expressed in the stem and the relative expression of PMM gene was the highest in Dendrobium chrysotoxum and the lowest in Dendrobium huoshanense in the comparison of the four different medicinal dendrobium. The results suggested that PMM gene may not only be involved in the synthesis of dendrobius polysaccharide， but also related to the biosynthesis of other compounds.

Key words Dendrobium huoshanense； PMM gene； cloning； qPCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.020

霍山石斛（Dendrobium huoshanense），又名米斛，是蘭科石斛屬多年生草本植物，更是眾多保健藥品和保健食品的主要來(lái)源之一[1-3]，是石斛屬植物中藥用價(jià)值較高的一種石斛[4]。由于霍山石斛對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求十分苛刻，自然繁殖效率極低，加上人工的長(zhǎng)期采挖，其野生資源已難覓蹤跡[5]?；蚬こ碳夹g(shù)能夠?yàn)橹参锏母牧继峁├碚撘罁?jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)，近幾十年來(lái)，對(duì)霍山石斛進(jìn)行了大量的研究，特別是組織培養(yǎng)技術(shù)取得了較大的進(jìn)展[6-7]，但在基因工程研究方面，有關(guān)霍山石斛的報(bào)道還較少。石斛多糖是石斛屬植物的主要有效成分之一[8-9]，因此通過(guò)基因工程手段提高石斛多糖的含量具有重大意義。

石斛中的多糖主要由葡萄糖和甘露糖等單糖組成，從兜唇石斛中提取的多糖AP-l、AP-2和AP-3為β（l→4）連接的直連D-葡萄甘露聚糖[10]；密花石斛中分離得到的均一多糖DDP-1-D也被證實(shí)為葡萄甘露聚糖，主要由D-葡萄糖和D-甘露糖按3.01 ∶ 1的比例組成[11]；從流蘇石斛分離獲得的3種均一性多糖，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)現(xiàn)這3種多糖都是由葡萄糖和甘露糖按不同比例構(gòu)成的[12]；袁晨琳[13]從霍山石斛中分離得到七種組分多糖，它們均由葡萄糖、半乳糖和甘露糖以不同的摩爾比組成。磷酸甘露糖變位酶（Phosphomannomutase，PMM）屬于一類新型的磷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠催化D-甘露糖-6-磷酸和D-甘露糖-1-磷酸之間的相互轉(zhuǎn)變，為合成GDP-甘露糖提供底物[14]。而GDP-甘露糖作為甘露糖供體參與到抗壞血酸、細(xì)胞壁多糖、含甘露糖的多糖、糖基化蛋白、褐藻膠和巖藻聚糖等的生物合成中[15-18]。目前有關(guān)磷酸甘露糖變位酶的研究在真菌[19-21]、動(dòng)物[22-23]、植物[24-25]中均有報(bào)道，但在霍山石斛中還未見(jiàn)任何報(bào)道。本研究以霍山石斛原球莖為材料，克隆了PMM基因，對(duì)其cDNA序列進(jìn)行分析，并利用qPCR技術(shù)檢測(cè)了霍山石斛不同組織及不同品種藥用石斛中PMM基因的表達(dá)情況，為后續(xù)研究磷酸甘露糖變位酶的功能以及石斛多糖合成代謝提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取繼代培養(yǎng)50 d的生長(zhǎng)旺盛的霍山石斛原球莖為材料，用于基因克隆；選取繼代培養(yǎng)120 d的霍山石斛試管苗中的莖、葉、根以及4種不同藥用石斛（霍山石斛、金釵石斛、鐵皮石斛、鼓槌石斛）的試管苗為試驗(yàn)材料，用于定量表達(dá)分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 采用通用植物總RNA提取試劑盒對(duì)供試材料進(jìn)行總RNA的提取，并進(jìn)行試驗(yàn)所需的cDNA的合成。除5′RACE外，其它步驟中所用cDNA的合成都是采用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，按說(shuō)明書進(jìn)行具體操作步驟，采用AP接頭作為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，5′RACE 所需cDNA的逆轉(zhuǎn)錄是在反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈基礎(chǔ)上進(jìn)行純化和加尾。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中植物相關(guān)的PMM核酸序列信息，完成PMM基因保守區(qū)引物的設(shè)計(jì)。而后根據(jù)PMM基因保守區(qū)的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE 所需要的引物。然后拼接所獲的的各片段序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于ORF的擴(kuò)增。本試驗(yàn)所用的各項(xiàng)引物見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)及后續(xù)步驟參照樊榮輝等[26]的試驗(yàn)方法進(jìn)行。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 參照林榕燕等[27]的分析方法，利用ExPASy軟件、CBS Prediction Servers軟件、Conserved Donain Search軟件、PSORT軟件以及PredictProtein軟件進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征分析，并利用MEGA5.0軟件（Neighbor-Joining，鄰位相連法）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.4 霍山石斛PMM基因定量表達(dá)分析 本研究采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑（Takara）和ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器（美國(guó)ABI公司），以18S rRNA作為參照基因，依據(jù)熒光引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)定量引物PMM-RT-F和PMM-RT-R用于PMM的qPCR擴(kuò)增，檢測(cè)PMM基因在霍山石斛不同組織以及不同品種藥用石斛試管苗中的表達(dá)情況。每個(gè)反應(yīng)包括3個(gè)重復(fù)，具體操作流程參照林榕燕等[27]的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 霍山石斛PMM基因cDNA序列的獲得

通過(guò)PMM基因保守區(qū)的PCR擴(kuò)增，獲得一條455 bp的特異性條帶，片段大小與預(yù)期一致。而后進(jìn)行5′RACE和3′RACE擴(kuò)增，分別得到174 bp和503 bp的條帶，與預(yù)計(jì)的一致。將以上的3段序列進(jìn)行拼接，得到長(zhǎng)為949 bp的PMM核酸序列。應(yīng)用ORF擴(kuò)增引物（表1）驗(yàn)證得到一條786 bp的特異性條帶（圖1）。測(cè)序結(jié)果經(jīng)檢索，與其它植物有較高的同源性，說(shuō)明本研究克隆得到的確實(shí)是霍山石斛PMM基因序列。該序列長(zhǎng)949 bp，包含一個(gè)完整的共747 bp的ORF（6-752），編碼248個(gè)氨基酸，以及5 bp的5′UTR，197 bp的3′UTR（含poly A）。該基因在GenBank上的登錄號(hào)為KY912084。PMM基因cDNA的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列見(jiàn)圖2。

2.2 霍山石斛PMM基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征分析

利用ProtParam軟件和ProtScale軟件對(duì)霍山石斛PMM蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析的結(jié)果顯示，該蛋白的分子式為C1 275H1 977N327O376S8，由20種共248個(gè)氨基酸組成，分子量為28 159.17，原子總數(shù)為3 963。預(yù)測(cè)結(jié)果還顯示該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為37.98，推測(cè)該蛋白是一個(gè)穩(wěn)定蛋白；總平均疏水指數(shù)為-0.289，疏水性最高值2.122出現(xiàn)在第39個(gè)氨基酸處；親水性最強(qiáng)值-2.956出現(xiàn)在第139個(gè)氨基酸處；故推測(cè)該蛋白為親水性蛋白。

信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)及卷曲螺旋的預(yù)測(cè)結(jié)果表明：霍山石斛PMM的C值、Y值、以及D值均小于0.5，且從N末端開(kāi)始的前60個(gè)氨基酸期望值為0.000 34，小于10，由此看出，霍山石斛PMM蛋白不含有信號(hào)肽。PMM蛋白的跨膜螺旋氨基酸期望值為0.001 71，遠(yuǎn)小于18，推測(cè)該蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)。PMM蛋白在值窗口值為14，21和28時(shí)形成卷曲螺旋的預(yù)測(cè)概率均遠(yuǎn)低于0.5，預(yù)測(cè)該蛋白無(wú)法形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)的功能與其亞細(xì)胞定位有著緊密的相關(guān)性，對(duì)霍山石斛PMM蛋白的亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)結(jié)果表明：該蛋白定位于微體的可能性最大，為57.2%；定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性為45.0%；定位于線粒體基質(zhì)的可能性較低，為10.0%。

通過(guò)分析霍山石斛PMM蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于HAD超家族，還含有植物PMM蛋白特有的3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：保守序列為DXDXTLX的區(qū)域Ⅰ、保守序列為DKTY的結(jié)構(gòu)域Ⅲ以及保守序列為[GSTDE][DSEN][DSENVG]的區(qū)域Ⅳ。這些保守結(jié)構(gòu)域的存在是霍山石斛PMM蛋白行駛其功能所必須的。

對(duì)霍山石斛PMM蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PMM的二級(jí)結(jié)構(gòu)由39.92%的螺旋結(jié)構(gòu)、36.29%的卷曲結(jié)構(gòu)以及23.79%的折疊結(jié)構(gòu)組成。利用SWISS-MODEL軟件，以5ue7.1.A為模板，預(yù)測(cè)霍山石斛PMM蛋白的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖中可以看出該蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件還是螺旋、折疊和卷曲，與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

2.3 霍山石斛PMM蛋白同源性和進(jìn)化分析

選取包括霍山石斛（Dendrobium huoshanense，KY912084）在內(nèi)的7種不同物種的氨基酸序列，利用DNANAN軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)分析。分析結(jié)果表明，不同植物的PMM之間具有較高的一致性，達(dá)到88.41%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，霍山石斛PMM的功能域氨基酸組成與其它植物幾乎一致，即都含有保守序列為DXDXTLX的區(qū)域Ⅰ、保守序列為XXSX的結(jié)構(gòu)域Ⅱ、保守序列為DKTY的結(jié)構(gòu)域Ⅲ以及保守序列為[GSTDE][DSEN][DSENVG]的區(qū)域Ⅳ（圖4方框所示）。

根據(jù)NCBI Blast比對(duì)結(jié)果顯示，PMM cDNA核酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列與其它植物的同源性均較高，與鐵皮石斛（Dendrobium catenatum，AHY34917.1）的同源性最高，為99%。其它依次為：木本棉（Gossypium arboreum，XP_017616871.1）和黃麻（Corchorus capsularis，OMO78718.1）的88%，蘆筍（Asparagus officinalis，XP_020274219.1）和葡萄（Vitis vinifera，XP_002267677.1）的87%，海棗（Phoenix dactylifera，XP_008806840.1）和油棕（Elaeis guineensis，XP_010934857.1）的86%，玉米（Zea mays，NP_

001140792.1）、短花藥野生稻（Oryza brachyantha，XP_006653042.2）、小米（Setaria italica，XP_004960027.1）以及馬鈴薯（Solanum tuberosum，XP_006345602.1）的84%，二穗短柄草（Brachypodium distachyon，XP_003580842.1）、碧桃（Prunus persica，XP_007221006.1）和大葉藻（Zostera marina，KMZ62827.1）的83%。

以包括霍山石斛PMM的編碼蛋白在內(nèi)15種不同物種的PMM氨基酸序列為模板，構(gòu)建PMM的系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹中數(shù)字代表Bootstrap值。從進(jìn)化樹結(jié)果（圖5）可以看出，序列被分為2個(gè)大的分支，包括霍山石斛在內(nèi)的5種單子葉植物為一個(gè)分支；其它10種植物為另一分支，該分支中又可分為2大類，分別為單子葉和雙子葉植物。值得注意的是單子葉植物大葉藻被劃分到雙子葉植物這一類別，說(shuō)明大葉藻的PMM氨基酸序列與雙子葉植物較為接近。霍山石斛PMM首先與鐵皮石斛、海棗、油棕、蘆筍處于同一分支，與它們的親緣關(guān)系較近，其次是另一分支中的單子葉植物包括玉米、短花藥野生稻、二穗短柄草和小米。

2.4 定量表達(dá)分析

為了解PMM基因在霍山石斛不同組織中的表達(dá)水平，選取莖、根、幼葉及成熟葉為材料，以18S rRNA為參照基因，不同組織中的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖6。從圖中可以看出，霍山石斛PMM基因的相對(duì)表達(dá)量高低依次為莖> 成熟葉> 根> 幼葉。運(yùn)用SPSS軟件分析發(fā)現(xiàn)，幼葉與其它3種組織間的相對(duì)表達(dá)量存在顯著性差異。

利用qPCR技術(shù)檢測(cè)PMM在4種不同藥用石斛，霍山石斛、金釵石斛、鐵皮石斛和鼓槌石斛試管苗中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PMM基因在不同石斛品種中的相對(duì)表達(dá)量大小依次為鼓槌石斛、金釵石斛、鐵皮石斛和霍山石斛，且各品種間的相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異。

3 討論

本試驗(yàn)從霍山石斛原球莖中克隆得到PMM基因，其編碼248個(gè)氨基酸，與大部分真核生物中的 PMM長(zhǎng)度相似。通過(guò)BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列與鐵皮石斛、木本棉、黃麻、蘆筍、葡萄、海棗、油棕等植物有很高的同源性，基本都在80%以上。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，對(duì)其氨基酸序列的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析，可以為闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。本研究利用軟件對(duì)霍山石斛PMM蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于親水性、穩(wěn)定性、不含信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白，屬于 HAD 超家族的成員。HAD 超家族是一個(gè)巨大的蛋白家族[28]，其中包括各種各樣的酶，數(shù)量龐大，如磷酸甘露糖變位酶、磷酸酯酶以及脫鹵酶等，涵蓋了眾多代謝途徑。該家族有4個(gè)極為保守的基序，其中motif I的保守序列為D x x x[TV]，第一個(gè)天冬氨酸可作為必要的Asp親核試劑；motif II的保守序列為[S/T]，其中的氨基酸殘基可通過(guò)氫鍵結(jié)合到底物的磷酸基團(tuán)；motif III和motif Ⅳ保守序列分別為DKTY和[GSTDE][DSEN][DSENVG]，參加到 ASP親核劑對(duì)底物磷酸基團(tuán)的定向，并能夠結(jié)合Mg2+[29]。本研究所克隆得到的PMM基因序列與其它植物相比，具有較強(qiáng)的保守性，也表明本次試驗(yàn)的可靠性。

磷酸甘露糖變位酶能夠催化D-甘露糖-6-磷酸和D-甘露糖-1-磷酸之間的相互轉(zhuǎn)化，一定程度上為GDP-甘露糖的合成提供前體物質(zhì)。有研究證明該基因還參與抗壞血酸、含甘露糖的多糖、糖基化蛋白等的生物合成。經(jīng)由農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，將水稻PMM基因（OsPMM）轉(zhuǎn)入到粳型三系恢復(fù)系C418中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)基因植株中的相對(duì)表達(dá)量明顯提高，相應(yīng)地，抗壞血酸含量也有所提升[30]。在本氏煙中對(duì)PMM基因進(jìn)行病毒誘導(dǎo)的基因沉默研究發(fā)現(xiàn)，減量表達(dá)該基因，葉片中維生素C的含量降低了；同時(shí)過(guò)表達(dá)該基因則可以提高葉片中維生素C的含量[14]。通過(guò)構(gòu)建鐵皮石斛[31]PMM超表達(dá)載體，并對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證，結(jié)果顯示，相較于對(duì)照植株，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的抗壞血酸含量和多糖含量均有明顯增加，說(shuō)明鐵皮石斛PMM基因與抗壞血酸和多糖合成代謝有關(guān)。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示霍山石斛PMM與鐵皮石斛PMM的親緣關(guān)系最近，推測(cè)二者之間的功能具有一定的相似性，說(shuō)明霍山石斛PMM可能參與到抗壞血酸和多糖生物合成代謝中。

為探究PMM基因在霍山石斛多糖合成中的作用，本研究通過(guò)定量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)霍山石斛PMM基因在莖中的相對(duì)表達(dá)量最高，且成熟葉的相對(duì)表達(dá)量高于幼葉；這與鐵皮石斛PMM在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)階段的莖中均高度表達(dá)的結(jié)果基本一致[31]。結(jié)合金海英等[32]對(duì)霍山石斛多糖含量變化規(guī)律的研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)周期的延長(zhǎng)，多糖含量逐漸增加；以及基于莖是石斛多糖存儲(chǔ)的主要部位這一認(rèn)知，推斷PMM基因可能與石斛多糖的生物合成相關(guān)。通過(guò)對(duì)不同藥用石斛品種中PMM基因的相對(duì)表達(dá)量比較發(fā)現(xiàn)，鼓槌石斛的表達(dá)水平明顯高于金釵石斛、鐵皮石斛和霍山石斛。而王再花等[33]對(duì)35種石斛材料的多糖含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，與鼓槌石斛和金釵石斛相比較，鐵皮石斛的多糖含量遙遙領(lǐng)先。鄭志新等[34]的研究也證明了鼓槌石斛的多糖含量低于鐵皮石斛。由此推測(cè)，PMM基因不僅參與到石斛多糖的合成，還可能與其它化合物的生物合成相關(guān)。因此，霍山石斛PMM基因的克隆與表達(dá)分析，將有助于該基因的功能及石斛多糖生物合成的進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳鳳芹， 黃德武， 何 苗， 等. 霍山石斛膠囊抗過(guò)氧化作用的研究[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2007， 28（10）： 54-58.

[2] Zha X Q， Luo J P， Luo S Z. Stucture identification of a new immunostimulating polysaccharide from the stems of Dendroobium Huoshanense[J]. Barbohydrate Polymers， 2007， 69： 86-93.

[3] 張煒玲， 李 濱， 王新生， 等. 復(fù)方霍山石斛浸膏增強(qiáng)免疫力作用的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 40（30）： 14 792-14 794.

[4] 羅宇琴， 肖蘇萍， 趙潤(rùn)懷， 等. 霍山石斛與鐵皮石斛對(duì)比研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥， 2016， 18（8）： 1 067-1 070.

[5] Lee P L， Chen J T. Plant regeneration via callus culture and subsequent in vitro flowering of Dendrobium Huoshanense[J].Acta Physiologiae Plantarum， 2014， 36（10）： 2 619-2 625.

[6] Wang Y， Luo J， Zha X Q. Protocorm-like body formation and plant regeneration of Dendrobium huoshanense， an endangered medicinal plant[J]. Acta Horticulture， 2006， 725（1）： 379-384.

[7] 李 蕤， 王 琳， 陳 群， 等. 霍山石斛組織培養(yǎng)及快速克隆繁殖技術(shù)[J]. 藥物生物技術(shù)， 2011， 18（1）： 11-15.

[8] 魏 明. 霍山石斛類原球莖懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和多糖合成的動(dòng)力學(xué)研究[D]. 合肥： 合肥工業(yè)大學(xué)， 2007.

[9] 劉 莉， 蕭鳳回. 石斛屬藥用植物多糖研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐， 2009， 23（1）： 77-80.

[10] 趙永靈， 王世林， 李曉玉. 兜唇石斛多糖的研究[J]. 云南植物研究， 1994， 16（4）： 392-396.

[11] 李 強(qiáng). 密花石斛多糖DDP-1-D的分離純化及結(jié)構(gòu)表征[D]. 廣州： 南方醫(yī)科大學(xué)， 2012.

[12] 張 展. 流蘇石斛多糖分離純化、 結(jié)構(gòu)分析及免疫活性的研究[D]. 合肥： 合肥工業(yè)大學(xué)， 2013.

[13] 袁晨琳. 霍山石斛多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性及其與結(jié)構(gòu)特征的關(guān)系[D]. 合肥： 合肥工業(yè)大學(xué)， 2013.

[14] Qian W Q， Yu C M， Qin H J， et al. Molecular and functional analysis of phosphomannomutase （PMM） from higher plants and genetic evidence for the involvement of PMM in ascorbic acid biosynthesis in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana[J]. The Plant Journal， 2007， 49（3）： 399-413.

[15] Smirnoff N， Conklin P L， Loewus F A. Biosynthesis of ascorbic acid in plants： A renaissance[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology， 2001， 52： 437-467.

[16] Lukowitz W， Nickle T C， Meinke D W. Arabidopsis cyt1 mutants are deficient in a mannose-1-phosphate guanylyltransferase and point to a requirement of N-linked glycosylation for cellulose biosynthesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2001， 98（5）： 2 262-2 267.

[17] Michel G. The cell wall polysaccharide metabolism of the brown alga Ectocarpus siliculosus. Insights into the evolution of extracellular matrix polysaccharides in Eukaryotes[J]. New Phytologist， 2010， 188（1）： 82-97.

[18] 張朋艷， 于 雪， 姚建亭， 等. 海帶磷酸甘露糖變位酶（PMM）基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 海洋科學(xué)， 2016， 40（3）： 32-39.

[19] Kim M H， Choi J D， Malshick S， et al. Expression and cloning of the pmmC gene encoding phosphomannomutase in sphingomonas chung-bukensis DJ77[J]. Korean Journal of Microbiology and Biotechnology， 2005， 33（2）： 84-89.

[20] Huang H D， Li X Y， Wu M M， et al. Cloning， expression and characterization of a phosphoglucomutase/phosphomannomutase from sphingan-producing sphingomonas sanxanigenens[J]. Biotechnology letters， 2013， 35（8）： 1 265-1 270.

[21] Ryunkyoung O， Soo Y M， Hwa J C， et al. Cloning and characterization of phosphomannomutase/phosphoglucomutase （pmm/pgm） gene of Vibrio anguillarum related to synthesis of LPS[J]. Microbiology and Biotechnology Letters， 2016， 44（3）： 355-362.

[22] Kedzierski L， Malby R L， Smith B J， et al. Structure of Leishmania mexicana Phosphomannomutase highlights similarities with human isoforms[J]. Journal of Molecular Biology， 2006， 363（1）： 215-227.

[23] Su S S M， Cang Y， Chan B， et al. A mouse model of a human congenital disorder of glycosylation caused by loss of PMM2[J].Human Molecular Genetics， 2016， 25（11）： 2 182-2 193.

[24] Hoeberichts F A， Vaeck E， Kiddle G， et al. A temperature-sensitive mutation in the arabidopsis thaliana phosphomannomutase gene disrupts protein glycosylation and triggers cell death[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2008， 283（9）： 5 708-5 718.

[25] Badejo A A， Eltelib H A， Fukunaga K， et al. Increase in ascorbate content of transgenic tobacco plants overexpressing the acerola （Malpighia glabra） phosphomannomutase gene[J]. Plant and Cell Physiology， 2009， 50（2）： 423-428.

[26] 樊榮輝， 黃敏玲， 吳建設(shè)， 等. 鶴望蘭花青素合成酶基因SrANS的克隆及表達(dá)分析[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 35（11）： 1 620-1 625.

[27] 林榕燕， 賴鐘雄. 霍山石斛HMGR基因的克隆及其定量表達(dá)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（10）： 1 975-1 983.

[28] Schmidberger J W， Wilce J A， Tsang J S， et al. Crystal structures of the substrate free-enzyme， and reaction intermediate of the HAD superfamily member， haloacid dehalogenase DehIVa from burkholderia cepacia MBA4[J]. Journal of Molecular Biology， 2007， 368（3）： 706-717.

[29] Seifried A， Schultz J， Gohla A. Human HAD Phosphatases： structure， mechanism， and roles in health and disease[J]. Federation of European Biochemical Societies， 2013， 280（2）： 549-571.

[30] 高利芬， 夏志輝， 張 繼， 等. 轉(zhuǎn)磷酸甘露糖變位酶基因提高水稻維生素C含量[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)， 2016， 30（4）： 111-116.

[31] He C M， Zeng S J， Jaime A， et al. Molecular cloning and functional analysis of the Phosphomannomutase （Pmm） gene from Dendrobium Officinale and evidence for the involvement of an abiotic stress response during germination[J]. Protoplasma， 2017， 254（4）： 1 693-1 704.

[32] 金海英， 張煒玲， 戴亞鋒， 等. 霍山產(chǎn)3種石斛多糖含量變化規(guī)律[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 40（9）： 5 152-5 153， 5 163.

[33] 王再花， 李 杰， 章金輝， 等. 石斛屬植物多糖與生物堿含量的比較研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2015， 31（24）： 5 242-5 246.

[34] 鄭志新， 金亞征， 耿浩林. 不同栽培方式下鼓槌石斛化學(xué)成分的測(cè)定[J]. 北方園藝， 2013， （23）： 168-170.