基于cDNA—AFLP技術(shù)分析半膜覆蓋下玉米大喇叭口期基因差異表達(dá)

高海榮 李倩 王玉芬 郭九峰 馬夢宇 李玉東 白嵐方

摘 要 為了探討半膜覆蓋調(diào)控玉米生長的差異表達(dá)基因及分子機(jī)制，以‘浚單29為材料，露地栽培作為對(duì)照，與半膜覆蓋間隔種植，利用cDNA-AFLP技術(shù)，采用90對(duì)單引物篩選半膜覆蓋下差異表達(dá)基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，利用90對(duì)單引物組合共擴(kuò)增出2 298條差異片段，其中上調(diào)表達(dá)的有1 429條，占總條帶數(shù)的45%；下調(diào)表達(dá)的有869條，占總條帶數(shù)的23.7%；無差異表達(dá)的有877條，占總條帶數(shù)的27.6%。選擇重復(fù)擴(kuò)增穩(wěn)定的20條差異片段進(jìn)行回收測序，經(jīng)過Blast數(shù)據(jù)庫對(duì)比和基因注釋分析，再將所得的15條差異片段按功能分為細(xì)胞骨架相關(guān)基因（13.3%）、能量代謝相關(guān)基因（13.3%）、細(xì)胞挽救和防御相關(guān)基因（6.7%）、轉(zhuǎn)錄過程相關(guān)基因（40%）、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因（6.7%）和未知功能基因（20%）6大類。分析其中一些重要的基因，如RPM1在逆境抗性中起作用，MYM鋅指蛋白、BCAS2蛋白和EIF3B翻譯起始因子都與調(diào)控轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)。通過cDNA-AFLP技術(shù)篩選了多個(gè)半膜覆蓋下差異表達(dá)的基因，為揭示半膜覆蓋影響玉米生長發(fā)育的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞 玉米；栽培方式；半膜覆蓋；cDNA-AFLP；差異表達(dá)

中圖分類號(hào) S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In order to investigate the molecular mechanism of the regulation of maize growth under partial plastic film-mulched cultivation， the differentially expressed genes were screened by 90 pairs of single primers using cDNA-AFLP technique， and bioinformatics analysis was carried out with Jundan 29 as the material under open-field-cultivation for the control and partial plastic film-mulched. The results showed that a total of 2 298 differential fragments were amplified by the 90 primer pairs， of which 1 429 were up-regulated（45% of the total number of bands）， 869 were down-regulated（23.7%of the total number of bands）. 877 genes were expressed without difference（27.6% of the total number of bands）. Twenty different differential fragments were selected and sequenced. Used Blast database comparison and gene annotation analysis， fitteen fragments could be divided into 6 groups according to the functions， namely cytoskeleton genes（13.3%）， energy metabolism gens（13.3%）， cell rescue and defense genes（6.7%）， transcription genes（40%）， intracellular transport related genes（6.7%）and unknown function（20%）. Some important genes were analyzed. For example， RPM1 protein plays a crucial role in adversity resistance， MYM zinc finger protein， BCAS2 protein and EIF3B are related to the regulation of transcription and translation. This study would provide basic data for revealing the molecular mechanism of partial plastic film-mulched affecting maize growth and development.

Key words Maize； cultivation pattern； partial plastic film-mulched； cDNA-AFLP； differential gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.018

玉米（Zea mays L.）是重要的糧食、經(jīng)濟(jì)和飼料作物。和玉米一樣，大多數(shù)作物對(duì)于干旱敏感，干旱地區(qū)的作物生長發(fā)育會(huì)受到不同程度的影響。干旱脅迫影響到植物的許多進(jìn)程，如細(xì)胞壁的延伸受抑，降低光合速率以及葉綠體對(duì)光能的吸收能力，影響光合碳同化和滲透調(diào)節(jié)等方面[1-3]。覆蓋地膜栽培在旱作農(nóng)業(yè)方面起到很大的幫助，尤其是北方地區(qū)，地膜覆蓋栽培可以有效的減少地面水分散失，存儲(chǔ)雨水，增加地表溫度和抗蟲防病等[4-7]。因此，篩選和分離地膜覆蓋影響玉米生長的相關(guān)基因，探尋地膜覆蓋調(diào)控玉米生長的分子機(jī)理，為玉米栽培和育種方面提供有價(jià)值的基因資源。

半膜覆蓋和全膜覆蓋已經(jīng)廣泛應(yīng)用到世界各地，尤其干旱地區(qū)，帶來的經(jīng)濟(jì)效益已得到廣泛認(rèn)可。李霞[8]在研究抗旱栽培模式的技術(shù)效益時(shí)發(fā)現(xiàn)，半膜覆蓋壟溝栽培和全膜雙壟溝播前覆膜較不覆膜栽培的增產(chǎn)率分別是149.56%和223.31%。長時(shí)間全壟地膜覆蓋會(huì)導(dǎo)致植株側(cè)根量減少，根層變淺，中后期土壤溫度偏高，植物易早衰等。半膜覆蓋的優(yōu)勢有：①作物根系一半處于膜內(nèi)，一半處于膜外，能提高肥料利用率，促進(jìn)根系發(fā)育和生長；②減少一半地膜使用量，有效降低“白色污染”[9]。

cDNA-AFLP是Bachem等[10]于1996年提出的一種差異表達(dá)鑒定技術(shù)，是結(jié)合了RT-PCR與AFLP 兩種技術(shù)建立的，主要用于RNA指紋圖譜分析，具有可靠性高，重復(fù)性好和不需預(yù)知序列信息等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛的用于基因差異顯示、表達(dá)基因遺傳連鎖作圖和基因克隆。Melloul M等[11]利用cDNA-AFLP技術(shù)篩選硬粒小麥（Triticum durum）在干旱脅迫下差異表達(dá)的基因。高鳳華等[12]應(yīng)用相同技術(shù)，比較干旱脅迫條件下水稻和旱稻轉(zhuǎn)錄本表達(dá)譜，結(jié)果表明57個(gè)基因在旱稻中特異表達(dá)，38個(gè)在水稻中特異表達(dá)，這些基因可能包括在干旱抗性中起作用的細(xì)胞挽救和防御基因，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，生長發(fā)育必需的核苷酸和氨基酸生物合成基因以及生長發(fā)育調(diào)控基因等。近年來，cDNA-AFLP 技術(shù)被廣泛應(yīng)用在作物逆境脅迫的差異基因表達(dá)方面，而對(duì)作物不同栽培方式下相關(guān)基因的鑒定和發(fā)掘方面涉及很少。

然而，目前作物不同栽培方式的研究主要集中在耕作方式、改善土壤理化性狀、提高土壤肥力、促進(jìn)早生快發(fā)和提高產(chǎn)量與品質(zhì)等方面，而對(duì)其生理和分子機(jī)制方面的研究還較少。研究不同栽培方式下，作物基因的差異表達(dá)將已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以玉米露地種植為對(duì)照（CK），同時(shí)將半膜覆蓋間隔種植，在大喇叭口時(shí)期取樣，利用cDNA-AFLP技術(shù)分離篩選差異表達(dá)的基因，揭示基因表達(dá)譜的變化情況，旨在分子水平上了解半膜覆蓋調(diào)控玉米生長發(fā)育的分子機(jī)制，對(duì)玉米栽培的生理和分子方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 選用玉米品種‘浚單29號(hào)，在內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市松山區(qū)試驗(yàn)田進(jìn)行種植。將半膜覆蓋和露地栽培（CK）間隔種植，大喇叭口期分別在玉米頂端葉片取樣10株，無菌水沖洗后用液氮冷凍，材料置于小液氮罐中帶回，保存在-70 ℃冰箱中備用。

1.1.2 主要試劑 PrimeScript Double Strand cDNA Synthsis Kit（6111A）購自大連TaKaRa寶生物工程有限公司；DEPC購自上海VETEC復(fù)申生物科技有限公司；MseⅠ購自美國NEB公司；PstⅠ購自加拿大Fermentas公司；T4 DNA Ligase、Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）購自美國Thermo Scientific公司；接頭、預(yù)擴(kuò)增引物及選擇性擴(kuò)增引物均由上海Invitrogen有限公司合成；其他藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 取約400 mg的冷凍玉米葉片材料，分別在液氮中混樣充分研磨后，按照改良的SDS法提取總RNA，測OD值確定RNA的濃度，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量。加入一定量的DNase消化gDNA；cDNA的合成按照PrimeScript Double Strand cDNA Synthsis Kit使用說明，分為cDNA第一條鏈的合成，第二條鏈的合成及cDNA雙鏈的精制純化過程。

1.2.2 酶切及連接 用兩種高頻限制性內(nèi)切酶MseⅠ和PstⅠ分別對(duì)兩種樣品的cDNA分別進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系為dscDNA（100 ng/μL）5 μL，MseⅠ1 μL，PstⅠ1 μL，10×Fast Digest Buffer 2 μL，ddH2O補(bǔ)充至總體積為20 μL；反應(yīng)條件為37 ℃反應(yīng)20 min，65 ℃滅活5 min。

取10 μL酶切產(chǎn)物，向其中加入MseⅠ接頭（5 μmol/L）1 μL，PstⅠ接頭（50 μmol/L）2 μL，T4 DNA Ligase（5 U/L）1 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，ddH2O補(bǔ)充至總體積為20 μL。反應(yīng)條件為22 ℃反應(yīng)1～2 h，65 ℃滅活10 min。酶切連接產(chǎn)物保存在-20 ℃冰箱中備用。接頭序列及預(yù)擴(kuò)選擴(kuò)引物見表1。

1.2.3 預(yù)擴(kuò)增體系與選擇性擴(kuò)增體系 以酶切連接產(chǎn)物原濃度及不同稀釋倍數(shù)（10、20倍稀釋）作為預(yù)擴(kuò)增體系PCR模板，反應(yīng)體系為酶切連接產(chǎn)物2 μL，M00引物（10 pmol/μL） 1 μL，P00引物（10 pmol/μL）1 μL，PCR Master Mix（2X）10 μL，ddH2O補(bǔ)充至總體積為20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸70 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后篩選最佳模板稀釋倍數(shù)。

將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物以原濃度和不同稀釋倍數(shù)（20、40、60、80倍稀釋）作為選擇性擴(kuò)增體系PCR模板，反應(yīng)體系為預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，使用兩種單引物組合，即MseⅠ+NN與MseⅠ+NN，另一組為PstⅠ+NNN與PstⅠ+NNN，每個(gè)引物各加1 μL（引物濃度均為6 pmol/μL），PCR Master Mix（2X） 10 μL，ddH2O補(bǔ)充至總體積為20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，65 ℃退火40 s，每個(gè)循環(huán)降低0.7 ℃，72 ℃延伸1 min，循環(huán)12次；94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)28次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。電泳檢測確定最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.4 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中加上樣緩沖液并混勻，變性10 min后，在5%的聚丙烯酰胺凝膠上以70 W功率電泳2 h，銀染并統(tǒng)計(jì)條帶結(jié)果。

1.2.5 差異條帶的回收及測序 回收有明顯差異的條帶，裝于200 μL離心管中，加入30 μL ddH2O，100 ℃水浴15 min，10 000 r/min離心10 min，待冷卻后取上清，用與差異條帶相同的引物進(jìn)行2次PCR。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇單一且清晰的條帶送英濰捷基公司測序。

cDNA-AFLP試驗(yàn)進(jìn)行了3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 將測序成功的序列在NCBI（http： //www.Ncbi.nlm.nih.gov）和MaizeGDB （http： //www.maizegdb.org/）網(wǎng)站上進(jìn)行同源序列比對(duì)，推斷基因的功能及其代謝通道。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米葉片RNA的提取及cDNA的合成

玉米嫩葉用改良的SDS法提取RNA后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，結(jié)果見圖1，可以清晰的看到3條亮帶，即28S RNA、18S RNA和5S RNA；濃度用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，樣品的OD260/OD280介于1.92～2.07之間，RNA純度較高，可以繼續(xù)進(jìn)行AFLP分析的下一步試驗(yàn)。

圖2所示為cDNA的合成，可知經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后的cDNA呈彌散狀，大小在500～2 000 bp之間，取少量樣品進(jìn)行超微量紫外分光檢測，cDNA的OD260/OD280介于1.81～1.95之間，含量在100～180 ng/μL，說明含量充足，符合酶切要求。

2.2 預(yù)擴(kuò)增體系、選擇性擴(kuò)增體系的建立與優(yōu)化

cDNA酶切連接接頭后，產(chǎn)物稀釋20倍稀釋時(shí)條帶較明亮且集中，大小為1 000 bp左右，效果最佳，故選擇將酶切連接產(chǎn)物稀釋20倍作為預(yù)擴(kuò)增的模板。選擇性擴(kuò)增時(shí)，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋60倍作為模板，以單引物不同堿基作為選擇性擴(kuò)增的1對(duì)引物組合進(jìn)行擴(kuò)增。部分選擇性擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖3 所示。

2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)化

利用45對(duì)MseⅠ+NN與MseⅠ+NN引物組合與45對(duì)PstⅠ+NNN與PstⅠ+NNN引物組合，研究了露地栽培和半膜覆蓋下基因的差異表達(dá)，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后，可觀察到大量差異表達(dá)條帶，表達(dá)有無差異和表達(dá)量差異，都記為差異表達(dá)條帶（部分聚丙烯酰胺凝膠電泳示差異表達(dá)條帶見圖4）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，共得到2 298條差異條帶，約占總條帶數(shù)的 72.4%，其中上調(diào)表達(dá)1 429條，下調(diào)表達(dá)869條。

2.4 差異條帶回收測序及序列同源性分析

用手術(shù)刀切取20個(gè)差異條帶，進(jìn)行2次PCR之后，產(chǎn)物回收測序，獲得18個(gè)成功的測序結(jié)果。利用Blast系統(tǒng)比對(duì)分析，檢索到與Gene Bank 中已有的基因具有同源性的片段共有15個(gè)，只有3個(gè)沒有顯著的同源序列。通過來源可以把這些序列分類為：與玉米同源性較高的序列有5條，與其他植物同源性較高的有2條，與動(dòng)物同源性較高的有3條，與微生物同源性較高的有5條（表2）。利用生物信息學(xué)知識(shí)將15條差異條帶進(jìn)行基因注釋分析，按功能可分為細(xì)胞骨架相關(guān)基因（13.3%）、能量代謝相關(guān)基因（13.3%）、細(xì)胞挽救和防御相關(guān)基因（6.7%）、轉(zhuǎn)錄過程相關(guān)基因（40%）、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因（6.7%）和未知功能基因（20%）6大類。

3 討論

3.1 半膜覆蓋調(diào)控玉米的生長

半膜覆蓋作為一種常見的作物增收的栽培方式，在播種的同時(shí)覆蓋地膜，以起到土壤水分向耕層移動(dòng)，并且保水增溫，提早生育期等，研究某個(gè)時(shí)期覆蓋地膜和露地栽培的基因差異表達(dá)，利用cDNA-AFLP的技術(shù)特點(diǎn)，可以篩選出差異表達(dá)的基因。覆膜玉米在其生理指標(biāo)方面，覆膜能夠平均升高土壤溫度（5 cm土層）1.7 ℃，增加土壤含水量，單株葉面積和葉綠素含量始終大于露地栽培[13]；在生化指標(biāo)方面，同樣在大喇叭口期，覆膜與露地栽培相比，玉米葉片中SOD（超氧化物歧化酶）活性和丙二醛（MDA）含量都相對(duì)較低，說明覆膜條件下能有效緩解玉米植株的氧化衰老，膜質(zhì)過氧化程度減輕，同時(shí)脯氨酸含量也顯著降低，在一定程度上反應(yīng)了覆膜玉米遭受干旱脅迫程度較輕，且凈光合速率和蒸騰速率明顯大于露地栽培[14]。另外，覆膜后耕層土壤細(xì)菌、放線菌和真菌會(huì)增加2～4倍，土壤中微生物數(shù)量增加，微生物活動(dòng)旺盛，必然會(huì)影響土壤有機(jī)質(zhì)的分解， 從而提高作物對(duì)養(yǎng)分的吸收和利用率[15]。本實(shí)驗(yàn)預(yù)期得到的差異基因應(yīng)當(dāng)主要與水分、溫度及微生物等調(diào)節(jié)玉米生長發(fā)育過程有關(guān)，包括根的水分吸收、能量的電子傳遞、細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和對(duì)逆境的抗性生理等。

3.2 cDNA-AFLP顯示基因差異表達(dá)

cDNA-AFLP技術(shù)有著多態(tài)性豐富、效率較高，而且重復(fù)性好，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)較高時(shí)，擴(kuò)增條帶的強(qiáng)度能準(zhǔn)確反應(yīng)基因間表達(dá)量的差別，可以有效的應(yīng)用于表達(dá)基因遺傳連鎖作圖和基因克隆，還可以同時(shí)研究不同生長時(shí)期和不同栽培條件下基因的差異表達(dá)。cDNA-AFLP技術(shù)中預(yù)擴(kuò)模板和選擴(kuò)模板濃度的稀釋是關(guān)鍵之一， 稀釋倍數(shù)太小，模版過早被耗盡，導(dǎo)致遺傳信息復(fù)制不完全，且極易在電泳時(shí)發(fā)生拖尾現(xiàn)象，若稀釋倍數(shù)太大則擴(kuò)增條帶很弱或不顯示，導(dǎo)致擴(kuò)增信號(hào)強(qiáng)度減弱，也不利于多態(tài)性檢測。常見的選擴(kuò)引物為雙引物組合（MseⅠ+NN與PstⅠ+NN），也有使用單引物組合的，如Habu Y等[16]用一個(gè)識(shí)別4堿基的限制性內(nèi)切酶，對(duì)牽?；ǎ↖pomoea purpurea）紅花和白花的花芽cDNA進(jìn)行酶切，擴(kuò)增引物使用單引物（M+N3， M+NNN3），即M引物3端有1個(gè)隨機(jī)堿基，另一個(gè)M引物3端有3個(gè)隨機(jī)堿基，最終利用cDNA-AFLP技術(shù)篩選出了一個(gè)只在紅花中出現(xiàn)的查爾酮合成基因（CHS）。本試驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)后采用單引物組合（MseⅠ+NN與MseⅠ+NN，PstⅠ+NNN與PstⅠ+NNN），利用引物在不同堿基之間的組合，理論上MseⅠ+NN單引物組合有162個(gè)，PstⅠ+NNN單引物組合有163個(gè)，筆者只選擇了MseⅠ+NN和PstⅠ+NNN單引物組合各45對(duì)，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段具有較好的多態(tài)性。本研究通過對(duì)反應(yīng)條件的反復(fù)優(yōu)化，構(gòu)建了cDNA-AFLP體系，在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜上，良好的顯示出了選擇性擴(kuò)增片段，通過分析，可以顯著分辨露地栽培和半膜覆蓋下玉米葉片基因表達(dá)的差異片段。

3.3 半膜覆蓋調(diào)控玉米生長的相關(guān)基因

3.3.1 與抗病相關(guān)基因 本試驗(yàn)篩選到一個(gè)與玉米抗病蛋白R(shí)PM1高度同源的基因（編號(hào)4），RPM1基因是植物主要的一類抗病蛋白，越來越多證據(jù)表明，RPM1蛋白參與植物的許多生理過程，最重要的功能就是調(diào)節(jié)抗病防御反應(yīng)；RPM1基因在擬南芥中對(duì)于丁香假單胞桿菌（pseudomonas syringae）具有抗性[17]，Grant等[18]在研究此基因的結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，RPM1被限制在一個(gè)5 kb的區(qū)域內(nèi)，并且識(shí)別丁香假單胞桿菌avrRpm1和avrB基因的表達(dá)。RPM1作為一個(gè)螺旋NBS-LRR蛋白，RPM1與質(zhì)膜定位蛋白R(shí)IN4相互作用[19]；RIN13作為一個(gè)耦合子來增強(qiáng)RPM1的功能[20]；RPM1基因還可以促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度的快速持續(xù)增加，來進(jìn)行植物必要的氧化迸發(fā)和過敏性細(xì)胞死亡等過程[21]，氧化迸發(fā)是細(xì)胞水平上作物對(duì)付病原菌侵染的第一步，過敏性細(xì)胞死亡也是在作物遭受非親和病原物侵染或激發(fā)因子的刺激后發(fā)生的。另外在高粱、水稻和二穗短柄草等植物中點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了抗病基因RPM1；抗病蛋白已公認(rèn)在正常生長和脅迫應(yīng)答條件下，對(duì)作物的一系列生理和細(xì)胞功能具有重要作用，而不只是在遭受病蟲害后起作用，此基因在半膜覆蓋下誘導(dǎo)表達(dá)可能在脅迫抗性中扮演重要角色。有趣的是，筆者也鑒定到一個(gè)假單胞桿菌屬的基因（編號(hào)14），更進(jìn)一步證明了假單胞桿菌是一種與玉米共生的微生物。

此外，還鑒定到另外一些與微生物同源性較高的基因，也可能是與玉米共生有關(guān)的微生物。許多研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)外的大量微生物與植物的生長發(fā)育及植物的抗性密切相關(guān)[22]，并與其鄰近生態(tài)環(huán)境（土壤）有明顯區(qū)別[23]。

3.3.2 與轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因 在半膜覆蓋調(diào)控玉米生長發(fā)育的過程中，轉(zhuǎn)錄過程及相關(guān)因子起到關(guān)鍵作用。編號(hào)2的片段與玉米鋅指蛋白MYM1型的基因高度同源，鋅指蛋白是一個(gè)龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，通過結(jié)合鋅離子折疊成手指狀結(jié)構(gòu)域，其功能主要是調(diào)控基因表達(dá)[24-25]。在植物中，普遍認(rèn)為鋅指蛋白在非生物脅迫與植物發(fā)育方面有重要功能。近年來，許多報(bào)道在作物中研究鋅指蛋白各種類型的結(jié)構(gòu)和功能，如Xuan N等[26]在玉米中研究了A20/AN1（ZmAN13）型鋅指蛋白，在擬南芥中過表達(dá)可以提高對(duì)冷脅迫的抗性，但同時(shí)降低了對(duì)鹽和干旱脅迫的抗性。但是幾乎沒有關(guān)于MYM型的報(bào)道，只有在動(dòng)物方面的實(shí)驗(yàn)。在Catherine M等[27]的研究中報(bào)道稱，MYM型鋅指蛋白是ZNF261和ZNF198（兩種小泛素樣修飾蛋白）對(duì)于結(jié)合泛素蛋白是充分必要的。MYM型鋅指蛋白還可能具有指導(dǎo)兩種蛋白相互作用的功能[28]。

編號(hào)10的基因與玉米BCAS2蛋白的基因高度同源，功能可能與mRNA進(jìn)程相關(guān)[29]。BCAS2基因在玉米及其他作物方面的相關(guān)研究較少，相關(guān)報(bào)道集中在動(dòng)物方面。Nicolai M等[30]在研究人的乳癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，BCAS2基因位于染色體1p13.3-21區(qū)且上調(diào)表達(dá)，預(yù)測功能是形成一個(gè)核糖核蛋白復(fù)合體或者與剪切體相互作用。玉米BCAS2基因在半膜覆蓋后下調(diào)，可能是通過調(diào)控小分子RNA和蛋白復(fù)合物的相互作用，這方面的研究還有待于今后的實(shí)驗(yàn)。

編號(hào)8與玉米翻譯起始因子3亞基B（EIF3B）高度同源，EIF3B是一個(gè)龐大的多亞基蛋白復(fù)合體，具有促進(jìn)tRNA結(jié)合到40S核糖體亞基的功能，通過磷酸化作用頻繁地調(diào)控翻譯過程[31]。此外還有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能[32]。

4 結(jié)論

本研究利用cDNA-AFLP技術(shù)對(duì)半膜覆蓋栽培下的玉米進(jìn)行基因差異表達(dá)研究，采用90對(duì)單引物組合檢測到2 298條差異片段，其中1 429條為上調(diào)表達(dá)，869條為下調(diào)表達(dá)。對(duì)成功測序和BLAST比對(duì)的15條差異條帶進(jìn)行分析，并按照功能分類將15個(gè)差異表達(dá)基因分為6類。半膜覆蓋調(diào)控玉米生長發(fā)育的分子機(jī)制涉及細(xì)胞骨架、能量代謝、轉(zhuǎn)錄過程和細(xì)胞挽救和防御，以及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程協(xié)同調(diào)控。

參考文獻(xiàn)

[1] Wu Y， Huang F， Jia Z， et al. Response of soil water， temperature， and maize（Zea may L.） production to different plastic film mulching patterns in semi-arid areas of northwest China[J]. Soil & Tillage Research， 2017， 166： 113-121.

[2] Xie Z K， Wang Y J， Li F M. Effect of plastic mulching on soil water use and spring wheat yield in arid region of northwest China[J]. Agricultural Water Management， 2005， 75（1）： 71-83.

[3] Rizhsky L， Liang H， Mittler R. The combined effect of drought stress and heat shock on gene expression in Tobacco[J]. Plant Physiology， 2002， 130（3）： 1 143-1 151.

[4] Qin S， Yeboah S， Wang D， et al. Effects of ridge-furrow and plastic mulching planting patterns on microflora and potato tuber yield in continuous cropping soil[J]. Soil Use & Management， 2016， 32（3）： 465-473.

[5] 岳俊芹， 邵運(yùn)輝， 汪慶昌. 等. 不同栽培方式對(duì)小麥生理特性和產(chǎn)量的影響[J]. 麥類作物學(xué)報(bào)， 2009， 29（5）： 878-880.

[6] Gong D Z， Hao W P， Mei X R， et al. Warmer and wetter soil stimulates assimilation more than respiration in rainfed agricultural ecosystem on the China loess pateau： The role of partial plastic film mulching tillage[J]. Plos One， 2015， 10（8）： e0136578.

[7] Dang J， Liang W L， Wang G Y， et al. A preliminary study of the effects of plastic film-mulched raised beds on soil temperature and crop performance of early-sown short-season spring maize（Zea mays L.） in the North China Plain[J]. Crop Journal， 2016， 4（4）： 331-337.

[8] 李 霞. 榆林市旱地玉米抗旱栽培模式的技術(shù)效益研究[D]. 西安： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2012.

[9] 高維常， 胡 偉， 林葉春. 半膜覆蓋栽培對(duì)烤煙生長發(fā)育的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015（1）： 13-18.

[10] Bachem C W B， Van der Hoeven R S， De Bruijn S M， et al. Visualization of differential gene expression using a novel method of RNA finger printing based on AFLP： analysis of gene expression during potato tuber development[J]. The Plant Journal， 1996， 9（5）： 745-753.

[11] Melloul M， Iraqi D， El A M， et al. Identification of differentially expressed genes by cDNA-AFLP technique in response to drought stress in Triticum durum[J]. Food Technology & Biotechnology， 2014， 52（4）： 479-488.

[12] 高鳳華， 張洪亮， 王海光. 應(yīng)用cDNA-AFLP比較干旱脅迫條件下水稻和旱稻轉(zhuǎn)錄本表達(dá)譜[J]. 科學(xué)通報(bào)， 2009（16）： 2 305-2 319.

[13] 秦 學(xué)， 曹翠玲， 鄭險(xiǎn)峰，等. 不同種植模式對(duì)玉米幼苗某些生理特性及產(chǎn)量的影響[J]. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究， 2005， 23（3）： 96-99.

[14] 李 超， 唐海明， 汪 柯，等. 栽培模式對(duì)南方丘陵紅壤旱地春玉米生理生化特性及產(chǎn)量的影響[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 37（4）： 13-17.

[15] 廖 敏， 謝曉梅， 吳良?xì)g. 水稻覆膜旱作對(duì)稻田土壤微生物生態(tài)質(zhì)量的影響[J]. 中國水稻科學(xué)， 2002， 16（3）： 243-246.

[16] Habu Y， Fukada-Tanaka S， Hisatomi Y， et al. Amplified restriction fragment length polymorphism-based mRNA fingerprinting using a single restriction enzyme that recognizes a 4-bp sequence[J]. Biochemical Biophysical Research Communications， 1997， 234（2）： 516-521.

[17] Dangl J L， Jones J D. Plant pathogens and integrated defence responses to infection[J]. Nature， 2001， 411（6839）： 826-833.

[18] Grant M R， Godiard L， Straube E， et al. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance[J]. Science， 1995， 269（5225）： 843-846.

[19] Gao Z， Chung E H， Eitas T K， et al. Plant intracellular innate immune receptor resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1（RPM1） is activated at， and functions on， the plasma membrane[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， USA， 2011， 108（18）： 7 619-7 624.

[20] Al-Daoude A， De T Z M， Ko J H， et al. RIN13 Is a positive regulator of the plant disease resistance protein RPM1[J]. Plant Cell， 2005， 17（3）： 1 016-1 028.

[21] Grant M， Brown I， Adams S， et al. The RPM1 plant disease resistance gene facilitates a rapid and sustained increase in cytosolic calcium that is necessary for the oxidative burst and hypersensitive cell death[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology， 2000， 23（4）： 441.

[22] Li C， Wang X， Wang Q. Effect of different textural soils on rhizosphere microorganisms and enzyme activities in maize[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2007， 40（2）： 412-418.

[23] Kothari S K， Marschner H， Ro··mheld V. Direct and indirect effects of VA mycorrhizal fungi and rhizosphere microorganisms on acquisition of mineral nutrients by maize（Zea mays L.） in a calcareous soil[J]. New Phytologist， 2010， 116（4）： 637-645.

[24] Urnov F D， Rebar E J， Holmes M C. Genome editing with engineered zinc finger nucleases[J]. Nature Reviews Genetics， 2010， 11（9）： 636.

[25] Nieto M A. The snail superfamily of zinc-finger transcription factors[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2002， 3（3）：155.

[26] Xuan N， Jin Y， Zhang H W， et al. A putative maize zinc-finger protein gene， ZmAN13， participates in abiotic stress response[J]. Plant Cell Tissus and Organ Culture， 2011， 107（1）： 101-112.

[27] Guzzo C M， Ringel A， Cox E， et al. Characterization of the SUMO-binding activity of the myeloproliferative and mental retardation （MYM）-type zinc fingers in ZNF261 and ZNF198[J]. Plos One， 2014， 9（8）： e105271.

[28] Gocke C B， Yu H. ZNF198 stabilizes the LSD1-CoREST-HDAC1 complex on chromatin through its MYM-type zinc fingers[J]. Plos One， 2008， 3（9）： e3255.

[29] Worsham M J， Pals G， Schouten J P， et al. High-resolution mapping of molecular events associated with immortalization， transformation， and progression to breast cancer in the MCF10 model[J]. Breast Cancer Research and Treatment， 2006， 96（2）：177.

[30] Worsham M J， Pals G， Schouten J P， et al. Amplification of the BCAS2 gene at chromosome 1p13.3-21 in human primary breast cancer[J]. Cancer Letters， 2002， 185（2）： 219.

[31] Elantak L， Tzakos A G， Locker N， et al. Structure of eIF3b RNA recognition motif and its interaction with eIF3j： structural insights into the recruitment of eIF3b to the 40 S ribosomal subunit[J]. Journal of Biological Chemistry， 2007， 282（11）： 8 165 -8 174.

[32] Asano K， Merrick W C， Hershey J W. The translation initiation factor eIF3-p48 subunit is encoded by int-6， a site of frequent integration by the mouse mammary tumor virus genome[J]. Journal of Biological Chemistry， 1997， 272（38）： 23 477- 23 480.