甘蔗與河八王雜交雙親染色體在F、BC和BC代的傳遞研究

段維興 黃玉新 周珊 張保青 羅霆 楊翠芳 高軼靜 張革民

摘 要 對(duì)甘蔗與河八王屬間雜種F1、BC1和BC2及其親本材料的根尖體細(xì)胞染色體數(shù)目進(jìn)行觀察及傳遞分析，以探討甘蔗與河八王染色體在不同世代的傳遞方式。采用根尖分生區(qū)細(xì)胞酶解去壁低滲法制片，每個(gè)世代選擇5個(gè)子代進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)及傳遞分析。結(jié)果表明，廣西河八王1號(hào)（GXN1）的染色體為30條，其他親本和子代數(shù)目存在2～5條變幅。甘蔗與河八王染色體在F1代以n+2n方式進(jìn)行傳遞，部分材料的染色體略有增加；在BC1和BC2代中均以n+n方式進(jìn)行傳遞。研究結(jié)果為河八王在甘蔗育種中的進(jìn)一步利用提供了細(xì)胞學(xué)參考。

關(guān)鍵詞 甘蔗；河八王；染色體傳遞

中圖分類(lèi)號(hào) S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To explore the chromosome transmission of parents in different generations，the somatic cell chromosomes of root-tips of the parents and F1， BC1 and BC2 progeny from the distant crossing between sugarcane（Saccharum spp.）× Narenga porphyrocoma（Hance）Bor were analyzed. Chromosomes were prepared following the wall degradation hypotonic method， five hybrids each generation were selected for chromosome counting and transmission analysis. Results showed that the somatic chromosome number of GXN1 was 30， while that for other accessions were non-constant and the amplitude was 2-5. The chromosomes of the parents were transmitted by n+2n in F1 progenies， but more than n+2n existed in some materials， and by n+n in BC1 and BC2 progenies， respectively. The results would provide a cytological reference for further utilization of the N. porphyrocoma （Hance）Bor in sugarcane breeding.

Key words Sugarcane； Narenga porphyrocoma（Hance）Bor； Chromosome transmission

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.001

河八王[Narenga porphyrocoma （Hance） Bor]是甘蔗近緣屬河八王屬（Narenga Bor）的一個(gè)種。具有較多甘蔗需要的經(jīng)濟(jì)性狀，如早熟，分蘗力強(qiáng)，直立抗倒，抗赤腐病、花葉病和黑穗病[1]。利用甘蔗與河八王雜交獲得的F1，植株直立、高大，莖徑、錘度介于雙親之間；其抗逆性、宿根性等方面都超越母本甘蔗。因此，河八王在甘蔗遺傳改良中具有重要的價(jià)值[2]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)河八王的研究不多。在雜交利用方面，僅見(jiàn)獲得F1的報(bào)道[2-5]。近年來(lái)，劉昔輝等[6-7]利用SSR標(biāo)記對(duì)甘蔗與廣西河八王雜種F1后代進(jìn)行真實(shí)性鑒定，并利用AFLP標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳對(duì)15份廣西河八王無(wú)性系進(jìn)行遺傳多樣性分析及分子身份證構(gòu)建。羅霆等[8]研究表明河八王及其F1后代材料比桂糖系列新品種、ROC22、斑茅、割手密以及甘蔗與斑割復(fù)合體雜交后代等表現(xiàn)出更高的固氮能力，河八王F1雜種固氮率達(dá)到36.13%。

本課題利用甘蔗與廣西河八王進(jìn)行雜交，獲得了一批真實(shí)雜種F1、BC1及BC2無(wú)性系材料，但甘蔗與河八王雙親染色體在不同世代中的傳遞情況目前尚未明確，限制了進(jìn)一步雜交利用。本研究對(duì)甘蔗與廣西河八王1號(hào)（GXN1）屬間雜種F1、BC1和BC2進(jìn)行染色體數(shù)目觀察和傳遞分析，初步研究甘蔗與河八王染色體在不同世代的遺傳特點(diǎn)，為提高河八王在甘蔗育種中的利用效率提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為廣西河八王1號(hào)（GXN1）與甘蔗雜交獲得的F1、BC1、BC2無(wú)性系及其雙親共19個(gè)材料（見(jiàn)表1）。所有試驗(yàn)材料種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗種質(zhì)資源圃。

1.2 試驗(yàn)材料真雜種鑒定

取試驗(yàn)材料幼嫩葉片，SDS法[9]提取基因組DNA。雜種F1真實(shí)性鑒定PCR引物mSSCIR198；BC1鑒定引物mSSCIR41；BC2鑒定引物mSSCIR190；mSSCIR43（見(jiàn)表2）。

PCR反應(yīng)總體積20.0 μL，其中10×PCR Buffer 2.0 μL，模板DNA30 ng，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，10 nmol/L dNTPs 0.4 μL，Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，用蒸餾水補(bǔ)充體積至20.0 μL。反應(yīng)程序，95 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用7%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

1.3 根尖細(xì)胞染色體觀察及計(jì)數(shù)

根尖處理及染色體玻片制備參考黃玉新等[10]的方法，略有修改。2016年11～12月，將健康粗壯蔗莖（河八王用蔗兜），置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，保濕沙培發(fā)根。每天上午10 ： 30～11 ： 00，剪取0.5～1 cm幼嫩根尖置于飽和對(duì)二氯苯水溶液室溫預(yù)處理4 h，經(jīng)0.075 mol/L KCl低滲1 h，現(xiàn)配的固定液（甲醛 ∶ 冰乙酸=3 ∶ 1）4 ℃固定12 h以上后，70%酒精保存，置于4 ℃冰箱備用。

切取根尖分生區(qū)部位進(jìn)行酶解，制備染色體玻片。先用0.25 mol/L HCl酸解10 min，再轉(zhuǎn)入3.5%纖維素酶和1.75%果膠酶混合液，37 ℃恒溫酶解8 h左右。酶解好的根尖，去離子水低滲30 min后，取2～3個(gè)根尖輕輕涂抹于干凈的載玻片中，酒精燈上干燥。制好的玻片用改良苯酚卡寶品紅染色20 min，于尼康正立熒光顯微鏡Ni下觀察，選擇15～20個(gè)分散完整的染色體拍照，取眾數(shù)進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 河八王F1、BC1、BC2材料真實(shí)性鑒定

河八王F1代，桂糖05-3256做母本，河八王1號(hào)做父本，經(jīng)SSR雜種鑒定，參試的5個(gè)材料都是真雜種（見(jiàn)圖1）；BC1代，F(xiàn)1 10-6-33做母本，桂糖91-116做父本，經(jīng)雜種鑒定參試材料都為真雜種（見(jiàn)圖2）；BC2代，桂糖05-120做母本，BC114-53-4做父本，經(jīng)雜種鑒定參試材料都為真雜種（見(jiàn)圖3、4）。

2.2 河八王F1、BC1、BC2材料染色體觀察

甘蔗與廣西河八王1號(hào)屬間雜交，其親本和子代的染色體如圖5和表3所示。由表3可知，GXN1染色體為30，其他親本和子代的染色體數(shù)目不恒定，變幅在2～5條之間。在F1組合中，子代SNF110-6-11和SNF110-6-18的染色體均為84，SNF110-6-33為81，SNF110-6-12和SNF110-6-21分別為96和93。由此推斷，SNF110-6-11、SNF110-6-18、SNF110-6-33基本遺傳了母本GT05-3256 n配子（53）染色體，父本GXN1 2n配子（30）染色體。SNF110-6-12和SNF110-6-21則超過(guò)母本n配子（53）和父本2n配子（30）染色體之和（83）。以上分析表明，甘蔗與河八王雜交，F(xiàn)1染色體的遺傳方式為n+2n，部分后代染色體發(fā)生加倍，超過(guò)親本n+2n之和。

BC1組合中，以F1雜種SNF110-6-33為母本，其染色體為81，則n配子數(shù)為40或41，父本GT91-116的染色體為108，則n配子數(shù)為54，兩親本的配子數(shù)之和為94或95。BC1子代中，SNBC114-53-9和SNBC114-53-13染色體為94，SNBC114-53-7和SNBC114-53-23染色體為97，SNBC114-53-4染色體為98。由此推測(cè)，河八王F1與甘蔗雜交，染色體基本按“n+n”方式傳遞給BC1。

BC2組合中，甘蔗品系GT05-120為母本，染色體為104，BC1雜種SNBC114-53-4為父本，染色體為98，母本雌配子（52）與父本雄配子（49）數(shù)目之和為101。4個(gè)BC2的染色體數(shù)為106、102、102、106，由此推測(cè)，甘蔗與河八王BC1雜交，染色體基本按“n+n”方式傳遞給BC2。

3 討論

甘蔗野生種質(zhì)資源是甘蔗創(chuàng)新和遺傳育種重要基礎(chǔ)和優(yōu)異性狀的基因庫(kù)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外積極開(kāi)展野生資源的收集、鑒定、評(píng)價(jià)與光周期誘導(dǎo)雜交利用等工作[11-15]。廣州甘蔗糖業(yè)研究所海南甘蔗育種場(chǎng)主要對(duì)斑茅進(jìn)行研究，目前已獲一批含斑茅血緣的優(yōu)良抗性親本[15-17]。黃永吉等[18]和吳嘉云等[19]研究表明，斑茅染色體在不同世代遺傳方式不同，F(xiàn)1、BC2、BC3為“n+n”的遺傳方式，BC1則以“n+n”和“2n+n”的遺傳方式，同時(shí)發(fā)現(xiàn)斑茅染色體在傳遞時(shí)發(fā)生易位，易位的染色體能穩(wěn)定遺傳。云南甘蔗研究所（含瑞麗育種站）側(cè)重于滇蔗茅的雜交利用，滇蔗茅高抗銹病，是甘蔗抗銹病育種的理想抗源材料[14]。林秀琴等[20-21]的研究結(jié)果表明甘蔗與滇蔗茅雜交，F(xiàn)1和BC1的染色體遺傳方式分別為n+n和2n+n。廣西甘蔗研究所主要開(kāi)展斑茅割手密復(fù)合體以及河八王的研究利用[7-8， 22]。黃玉新等[10， 23]的研究結(jié)果表明廣西斑茅割手密復(fù)合體GXAS 07-6-1與甘蔗雜交，其F1、BC1和BC2的染色體遺傳方式均為n+n。國(guó)外Lekshmi等[24]通過(guò)GISH分析，發(fā)現(xiàn)斑茅割手密復(fù)合體CYM 04-420與甘蔗雜交，其F1、BC2的染色體傳遞為n+n，而B(niǎo)C1為2n+n。

本研究中，廣西河八王1號(hào)染色體為30，與前人報(bào)道一致[2-3]。觀察的5個(gè)F1雜種體細(xì)胞染色體數(shù)目差異較大。SNF110-6-11、SNF110-6-18、SNF110-6-33染色體數(shù)為81～84，基本等于母本n配子和父本2n配子之和（83），而SNF110-6-12和SNF110-6-21染色體為93～96，超過(guò)親本n+2n的遺傳。F1形成兩種不同類(lèi)型的染色體，有可能是河八王染色體導(dǎo)入后影響了甘蔗同源染色體以及部分同源染色體的重組和分離，減數(shù)分裂過(guò)程產(chǎn)生不均等配子。Raghavan利用S. officinarum var. Vellai（2n=80）與Narenga（2n=30）雜交，獲得2n=95和2n=55兩種類(lèi)型的F1后代，由此表明，熱帶種與河八王雜交，F(xiàn)1的染色體遺傳為n+n和2n+n[3]。文穎[22]曾報(bào)道，大莖野生種（2n=84）與河八王屬雜交，大部分雜種的染色體為2n=57，少數(shù)為2n=60和62，染色體基本按n+n方式傳遞；而割手密（2n=40）與河八王屬雜交，染色體遺傳方式為n+n，割手密（2n=64）與河八王屬雜交，染色體遺傳方式為2n+n。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果不一致，有可能是選擇的親本不同。在BC1和BC2過(guò)程，子代的染色體數(shù)分別為94～98和102～106，雙親的單倍配子體數(shù)目之和分別為94/95和101，由此表明，BC1和BC2的染色體基本按n+n方式進(jìn)行傳遞。

本研究從體細(xì)胞染色體觀察計(jì)數(shù)研究了河八王染色體的遺傳特點(diǎn)，推斷了親本染色體的遺傳方式，但對(duì)于后代染色體的組成以及染色體傳遞過(guò)程中是否有易位染色體都尚未明確。下一步應(yīng)該利用基因組原位雜交（GISH）技術(shù)，鑒定子代中雙親染色體的組成。

參考文獻(xiàn)

[1] 李楊瑞. 現(xiàn)代甘蔗學(xué)[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2010.

[2] 黃家雍， 廖江雄， 諸葛瑩. 甘蔗與河八王、五節(jié)芒、滇蔗茅屬間交配性及雜種F1無(wú)性系的形態(tài)學(xué)和同工酶分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 1997， 10（3）： 92-98.

[3] Raghavan T S. The genetic behavior of Sclerostachya × Narenga hybrids and their back-crosses[J]. Current Science， 1952， 21（2）：35.

[4] Raghavan T S. Sugarcane bamboo hybrids[J]. Nature， 1952， 170（4321）： 329-330.

[5] 諸葛鎣， 黃吉森. 甘蔗屬及其野生近緣植物雜交研究初報(bào)[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 1996（1）： 5-6.

[6] 劉昔輝， 方鋒學(xué)， 張榮華， 等. 甘蔗與河八王屬間雜種的SSR 標(biāo)記鑒定[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2012， 25（1）： 38-43.

[7]劉昔輝， 張榮華， 張革民， 等. 基于AFLP標(biāo)記的河八王種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及分子身份證構(gòu)建[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 35（4）： 7-13.

[8] 羅 霆， 李長(zhǎng)寧， 李毅杰， 等. 15N自然豐度法分析甘蔗及近緣屬野生種固氮效率[J]. 中國(guó)糖料， 2017， 39（1）： 4-6.

[9] 劉昔輝， 宋煥忠， 張革民， 等. 一種快速高效提取甘蔗及其近緣屬基因組DNA的方法[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2010， 23（2）： 515-518.

[10]黃玉新， 羅 霆， 高軼靜， 等. 甘蔗與斑茅割手密復(fù)合體的回交后代真實(shí)性鑒定及染色體遺傳分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2016， 47（10）： 1 642-1 647.

[11] 劉 洋， 劉新龍， 蘇火生， 等. 海南甘蔗野生種資源的收集與遺傳多樣性初析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2013， 29（1）： 199-208.

[12] 張 瑜， 鄢家俊， 白史且， 等. 野生割手密種質(zhì)資源的考察與收集[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 54（2）： 377-381.

[13] 李文鳳， 王曉燕， 黃應(yīng)昆， 等. 31份甘蔗野生核心種質(zhì)資源褐銹病抗性鑒定及Bru1基因的分子檢測(cè)[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2015， 41（5）： 806-812.

[14] 李文鳳， 蔡 青， 黃應(yīng)昆. 甘蔗野生資源對(duì)蔗茅柄銹菌的抗性鑒定[J]. 植物保護(hù)， 2005， 31（2）： 51-53.

[15] 劉少謀， 符 成， 陳勇生. 近十年海南甘蔗育種場(chǎng)斑茅后代回交利用研究[J]. 甘蔗糖業(yè)， 2007（4）： 1-6.

[16] 王麗萍， 蔡 青， 陸 鑫， 等. 甘蔗近緣屬野生種滇蔗茅（Erianthus rochii）的種質(zhì)創(chuàng)新利用[J]. 中國(guó)糖料， 2008（2）： 8-11.

[17] 黃忠興， 符 成， 黃錦福， 等. 含斑茅血緣甘蔗親本的抗旱性研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 43（6）： 49-57.

[18] Huang Y J， Wu J Y， Wang P， et al. Characterization of chromosome inheritance of the intergeneric BC2 and BC3 progeny between Saccharum spp. and Erianthus arundinaceus[J]. Plos One， 2015， 10（7）： e0133722.

[19] Wu J Y， Huang Y J， Lin YQ， et al. Unexpected inheritance pattern of Erianthus arundinaceus chromosomes in the intergeneric progeny between Saccharum spp. and Erianthus arundinaceus[J]. Plos One， 2014， 9（10）： 1-9.

[20]林秀琴， 陸 鑫， 劉新龍， 等. 應(yīng)用GISH技術(shù)鑒定甘蔗野生種外源染色體[J]. 分子植物育種（網(wǎng)絡(luò)版）， 2013， 11： 1 025-1 031.

[21]林秀琴， 陸 鑫， 劉新龍， 等. 甘蔗與滇蔗茅雜交后代 F1、 BC1表型和GISH分析[J]. 分子植物育種， 2017， 15（6）： 2 307-2 316.

[22]劉昔輝， 方鋒學(xué)， 高軼靜， 等. 斑茅割手密雜種后代真實(shí)性鑒定及遺傳分析[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2012， 38（5）： 914-920.

[23] 黃玉新， 羅 霆， 劉昔輝， 等. 甘蔗與斑茅割手密復(fù)合體（GXAS07-6-1）雜交后代的染色體遺傳分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2016， 37（2）： 220-225.

[24] Lekshmi M， Pazhany A S， Sobhakumari V P， et al. Nuclear and cytoplasmic contributions from Erianthus arundinaceus （Retz.） Jeswiet in a sugarcane hybrid clone confirmed through genomic in situ hybridization and cytoplasmic DNA polymorphism[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2017， 64（7）： 1 553-1 560.