銀翹散加減對手足口病CA16病毒全基因組表達(dá)譜的影響

張澤淵, 楊宏仁

(云南省楚雄醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校, 云南 楚雄, 675005)

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銀翹散加減對手足口病CA16病毒全基因組表達(dá)譜的影響

張澤淵, 楊宏仁

(云南省楚雄醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校, 云南 楚雄, 675005)

目的 探討銀翹散加減對柯薩奇病毒A組16型感染手足口病恒河幼猴細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。方法 30只SPF級恒河幼猴，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組(15只)和對照組(15只)，治療組以銀翹散加減方保留灌腸，對照組不進(jìn)行治療。連續(xù)7 d后樣本的全基因組表達(dá)譜進(jìn)行PCA分析。研究2組患者基因表達(dá)譜的差異，并對差異基因行Venn 圖分析、分層聚類分析和基因本體論GO分析。結(jié)果 通過基因組表達(dá)譜共篩選到894個差異表達(dá)基因，明顯上升和下調(diào)2個大類。差異表達(dá)基因參與的富集的分子包括: 許多炎性趨化因子、參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞周期、免疫系統(tǒng)過程、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和代謝過程等生物學(xué)過程的因子。結(jié)論 2組基因表達(dá)譜存在明顯差異，差異表達(dá)基因所涉及的生物學(xué)過程與中藥減輕CA16引起的炎性趨化、免疫系統(tǒng)反應(yīng)等有相關(guān)性。

手足口病; 銀翹散; CA16; 基因表達(dá)譜

手足口病(HFMD)是一種全球性的疾病, 本病屬于中醫(yī)學(xué)“溫病學(xué)”范疇[1], 其易感人群主要是5歲以下幼兒。近年來對于HFMD的研究大多數(shù)集中于腸道病毒71型(以下簡稱EV71)的感染。臨床上，柯薩奇病毒A組16型(以下簡稱CA16)感染所致HFMD患者一旦發(fā)展到重癥階段，其基本情況和臨床癥狀特征基本與EV71感染病例一致[2]。盡管 EV71 滅活疫苗已經(jīng)上市，但缺乏CA16滅活疫苗[3], CA16感染所致HFMD也需要治療。本文從病毒學(xué)和免疫學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等方法，通過全基因組譜分析CA16所致疾病的的基因表達(dá)，為CA16 感染的中藥防治研究開拓思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

30 只SPF級恒河幼猴[由于恒河幼猴與5 歲以下幼兒體質(zhì)相似故可選用，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所靈長類實驗動物中心(滇實動證第2015006號]。體質(zhì)量3.6～4.8 kg, 3～4個月周齡，分為治療組與對照組，15只/組，雌雄兼用。動物飼養(yǎng)于生物安全Ⅲ級實驗室[許可證號: SYX(滇)2012-0004]。給予自然光照、空氣、食物、水、玩具，溫度控制在(25±1) ℃，濕度42%～74%。采用噴霧吸毒方式，即模擬正常情況下呼吸道感染方式，CA16 感染組接種滴度為 4.7 lg CCID 50/mL的病毒液 1 mL, 隨后每天觀察所有動物的臨床癥狀及相關(guān)指標(biāo)。常規(guī)飼養(yǎng)檢測相關(guān)指標(biāo); 治療組以銀翹散加減方保留灌腸，處方如下: 金銀花、連翹、板藍(lán)根、炒梔子、玄參、藿香(后下)、紫草、桔梗、太子參各 10 g, 荊芥穗、淡豆豉、薄荷(后下)8 g, 生石膏 20 g, 黃連、牛蒡子3 g, 生甘草6 g。每劑煎至200 mL備用。每只恒河幼猴灌腸量25～35 mL; 治療組恒河幼猴每天灌腸1次，連續(xù)7 d, 造模成功后對照組不進(jìn)行治療。

1.2 儀器與方法

分離恒河猴血液中的PBMC，稀釋血樣、分離淋巴細(xì)胞、吸取 PBMC 層作為標(biāo)本，采用細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶; 無酶槍頭及無酶離心管、MEM 培養(yǎng)液、PBS 緩沖液、1%胰酶、4%EDTA、Gene Expression Hybridization Kit、Recombinant RNase Inhibitor、Low Input Quick Amp Labeling Kit，One-Color、定制引物、基因芯片。按照 Agilent 表達(dá)譜芯片配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程和配套試劑盒，在滾動雜交爐中雜交cRNA上樣量 1.65 μg，并在洗缸中洗片。完成雜交的芯片采用 Agilent Microarray Scanner 進(jìn)行掃描，設(shè)置 Dye channel。用 Feature Extraction software 10.7讀取數(shù)據(jù)，最后用 Gene Spring Software 11.0 處理(Quantile算法)SBC分析、Venny圖、差異表達(dá)基因的分層聚類分析、Gene Ontology分析。

1.3 觀察指標(biāo)

通過PCA芯片數(shù)據(jù)、差異性表達(dá)基因、分層聚類及GO分析，研究治療組和對照組間的差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采取SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)(%)表示，采用卡方檢驗，兩樣本均數(shù)比較用獨立樣本t檢驗，組間各時間點的比較采用單因素方差分析，組間相關(guān)采用直線相關(guān)分析，伯豪公司提供的在線 SAS系統(tǒng)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CA16感染恒河猴幼猴不同時間點的PCA

分析

從圖1可知，病毒感染前，中藥治療組聚集在同一象限內(nèi)，對照組在其他象限，對照組病毒感染樣本明顯離散在其余各組之外。

圖1 治療組與對照組的PCA芯片數(shù)據(jù)

2.2 CA16感染恒河猴幼猴不同時間點差異性表達(dá)基因

和治療前比較差異基因的數(shù)目, 2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組不同時間點差異基因的數(shù)目比較(和治療前比較差異基因的數(shù)目)

2.3 CA16感染恒河猴幼猴不同時間的分層聚類及GO分析

分析顯示，各個時間點內(nèi)用中藥治療存在特異性的改變，將圖2、3的表達(dá)趨勢在表2中顯示可得差異基因分析表。治療組和對照組基因表達(dá)存在顯著差異(P<0.05), 見表2。

圖2 分層聚類(注紅代表上調(diào)、藍(lán)代表下調(diào))

圖3 基因組GO分析

表2 差異基因分析表

“+”表示上調(diào), “-”表示下調(diào)。

3 討 論

本實驗發(fā)現(xiàn)CA16感染恒河猴幼猴后，在對照組中許多參與了CA16感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)趨化因子(CXCL系列)的表達(dá)量發(fā)生了顯著改變[4]，應(yīng)用中藥的治療組以上因子較對照組出現(xiàn)明顯下調(diào)(CXCL1、2、9、10、11), 提示中藥可減輕CA16引起的炎性反應(yīng)。另外，與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子及炎癥因子包括 IL(6、8、18、1A)的表達(dá)量[5]在CA16感染后對照組中都發(fā)生了顯著變化，說明 CA16 感染激活宿主的免疫系統(tǒng)，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。而應(yīng)用中藥組的炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子及炎癥因子包括IL(6、8、18、1A)的表達(dá)量[6]在 CA16感染后和感染前相比變化較小，說明應(yīng)用中藥后CA16感染雖然能夠激活宿主的免疫系統(tǒng)，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，但是不能引起較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。將上述的這些差異性表達(dá)基因經(jīng)過GO分析[7]后顯示，在細(xì)胞通訊、細(xì)胞周期、免疫系統(tǒng)過程、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和代謝過程等生物學(xué)過程中，中藥能夠影響病毒對宿主的代謝反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主的免疫以及減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生。CA16感染恒河猴幼猴的全基因組分析中發(fā)現(xiàn)，在感染后的不同時間點，應(yīng)用中藥和不用中藥均具有不同的差異性表達(dá)基因，說明隨著時間的變化, CA16感染后應(yīng)用中藥治療與不治療存在特異性。

銀翹散源于《溫病條辨》[8], 既有辛透之功，又具解毒之效[9], 為溫病學(xué)中較為常用的方劑，通過一系列的加減可加強(qiáng)其此方面的療效。CA16感染手足口病導(dǎo)致死亡的原因中，肺水腫、肺出血引發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變等，都離不開炎性反應(yīng)的發(fā)生[10]。名方銀翹散具有較強(qiáng)的抗炎作用，因此研究此方對防治HFMD引發(fā)嚴(yán)重病例及死亡病例有重要意義[11], 從研究中發(fā)現(xiàn)溫病學(xué)中銀翹散在HFMD治療中存在巨大價值與作用的分子基礎(chǔ)。

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Effect of modified yinqiao powder on whole genome spectral expression in monkey with hand-foot-mouth disease induced by CA16 virus

ZHANG Zeyuan, YANG Hongren

(ChuxiongMedicalandPharmaceuticalCollege,Chuxiong,Yunnan, 675005)

Objective To investigate effect of modified yinqiao powder on the expression of gene profiling in monkey with hand-foot-mouth disease infected by CA16 cells of genomics. Methods Thirty SPF Ganges river young monkey were randomly divided into treatment group (n=15) and control group (n=15). The monkeys in treatment group were treated with yinqiao powder, while the monkeys in control group were treated nothing. After 7 days, sample gene expression profiles were analyzed by PCA. The gene expression patterns between two groups were studied. Results Totally 894 differentially expressed genes were screened by gene expression profiles, which were significantly clustered into 2 major types. Differential expression of genes involved in the enrichment of molecular function, including many inflammatory chemokines expression, cell communication, cell cycle, regulation of the immune system process, transcription and metabolism process of biological process. Conclusion There are significant differences in the gene expression profile of ovarian granulosa cells between the two groups. The biological processes involved in the differential expression of genes are related to the effects of yinqiao powder on CA16 induced inflammatory chemotaxis and immune system response.

hand-foot-mouth disease; yinqiao powder; CA16; gene expression profile

2017-01-09

中醫(yī)科學(xué)院重大創(chuàng)新、綜合性中藥新藥研究開發(fā)技術(shù)大平臺建設(shè)項目(2014ZX9301-007)

R 511

A

1672-2353(2017)09-126-03

10.7619/jcmp.201709033