還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2在局限性骨肉瘤組織中表達及與新輔助化療效應及局部進展相關(guān)性研究

陳葉玲，謝 馨，李 卉，羅凱燕

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院 骨科，湖北 武漢 430022

骨肉瘤是一種來源于成骨間充質(zhì)干細胞的原發(fā)性惡性腫瘤，主要累及兒童和青少年的長骨干骺端區(qū)域部分[1-2]。隨著順鉑、多柔比星和大劑量甲氨蝶呤等輔助化療的出現(xiàn)及手術(shù)技術(shù)的進步，骨肉瘤的臨床療效得到明顯改善，但仍有近三分之一的局限性骨肉瘤患者在診斷后兩年內(nèi)復發(fā)，以肺部轉(zhuǎn)移較為常見(5年存活率<20%)[3-4]。因此，尋找新的預測因子和治療靶點，減少骨肉瘤的轉(zhuǎn)移，提高其生存率已成為當務之急。有研究表明，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)家族可通過產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導關(guān)鍵的生理、病理學過程(如細胞信號傳遞、炎癥反應、有絲分裂發(fā)生等)，在惡性腫瘤細胞中，ROS代謝物可作為信號分子，可促進細胞存活[5]。NOX 酶和線粒體是細胞ROS的主要來源。然而，臨床對NOX家族在人類癌癥發(fā)生和發(fā)展中作用了解仍然有限[6]。本研究通過分析兒童/青少年骨肉瘤組織NOX2蛋白表達與臨床病理特征、新輔助化療后局部病變進展情況，為明確NOX2能否成為骨肉瘤治療的潛在生物學靶標提供證據(jù)支持?，F(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性分析自2005年1月至2016年12月收治的134例局限性(非轉(zhuǎn)移性)原發(fā)性骨肉瘤患兒的臨床資料。納入標準：(1)年齡≤18歲；(2)確診為局限性(非轉(zhuǎn)移性)原發(fā)性骨肉瘤。排除標準：(1)未接受新輔助化療或臨床信息不可用；(2)中途轉(zhuǎn)院或任何原因停止治療。所有患兒均接受新輔助化療(多柔比星和甲氨蝶呤聯(lián)合治療)后行手術(shù)切除。根據(jù)Huvos分級系統(tǒng)評估腫瘤對化療的反應。新輔助化療后腫瘤壞死率≥90%被歸類為病理反應良好，否則為病理反應不良。選取同期醫(yī)院收治的53例多指畸形患兒的軟骨組織樣本作為參考組。參考組男性30例,女性23例；年齡(12.74±3.95)歲。骨肉瘤組男性69例,女性65例；年齡(11.06±4.13)歲。兩組患兒的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，有可比性。參加本研究的患兒法定監(jiān)護人均簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2 檢測組織NOX2蛋白表達 采用免疫組織化學法(immunohistochemical method，IHC)使用PV9000免疫組化試劑盒(Origene Technologies，中國)對所有患兒組織樣本NOX2表達進行檢測。將樣本制成4 mm厚連續(xù)切片，60℃孵育1 h，脫蠟脫水，室溫下使用3%過氧化氫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性。將切片在檸檬酸緩沖液(pH=6.0)中微波2 min，以恢復抗原，自然冷卻至室溫。使用NOX2抗體(兔單克隆抗體，1:100稀釋，Abclonal，美國)，37℃孵育1～2 h，室溫下過氧物酶-抗兔免疫球蛋白G(Origene Technologies，中國)孵育20 min。切片使用二氨基聯(lián)苯胺(Origene Technologies，中國)進行3～5 min染色，再于室溫下使用蘇木精復染2 min，脫水。所有樣本均使用蘇木精-伊紅染色識別腫瘤部位。染色結(jié)果由2名病理學專家進行評估，染色程度<10%為0分，10%～25%為1分，25%～70%為2分，染色程度>70%為3分，評分≤2分為低表達，評分>2分為高表達。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測組織NOX2蛋白表達 使用裂解緩沖液(Beyotime Biotechnology，中國)提取蛋白，并采用Pierce Bicinchoninic Acid蛋白檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)進行定量檢測。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，New Cell & Molecular Biotech，中國)用于分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(Merck Millipore，德國)上。用牛血清白蛋白(Beyotime Biotechnology，中國)封閉膜1 h，然后與抗NOX2(Abclonal，美國)和微管蛋白抗體(Affinity，美國)在4℃下孵育過夜?？筃OX2膜與山羊抗兔單克隆二抗(Affinity，美國)、微管蛋白膜及目標抗兔多克隆二抗體(Affinity，美國)在37℃孵育1 h。使用Enhanced Chemiluminescent(New Cell & Molecular Biotech，中國)、FluorChem R檢測系統(tǒng)(ProteinSimple，美國)和Image Lab 3.0軟件(Bio-Rad Laboratories，美國)對結(jié)果進行可視化處理。

1.3 隨訪觀察 為評估患兒5年內(nèi)局部復發(fā)轉(zhuǎn)移的進展情況，所有患兒在治療后的5年內(nèi)，每3個月進行一次X線或CT掃描，3年后每6個月進行一次CT掃描。由2名放射科醫(yī)師在不知患者預后的前提下，獨立回顧分析從診斷到新輔助化療的原發(fā)腫瘤灶MRI掃描圖像，測量腫瘤長度、寬度和深度。判斷是否有局部疾病進展(local progressive disease，L-PD)[7]。無進展生存時間定義為從診斷之日到腫瘤首次進展或最后一次隨訪的時間間隔，總生存時間定義為從診斷到死亡甚至最后一次隨訪的時間間隔。如果未發(fā)生腫瘤進展或死亡，則在最后一次隨訪時對患者進行評估。

2 結(jié)果

2.1 2組患兒組織NOX2蛋白表達情況 經(jīng)IHC分析，骨肉瘤組NOX2蛋白高表達率高于參考組[33.6%(45/134) vs.13.2%(7/53)],骨肉瘤組腫瘤組織NOX2蛋白相對表達量高于參考組[0.505(0.277，0.838)vs.0.367(0.281，0.499)],差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)ROC曲線分析，組織NOX2蛋白相對表達量用于診斷骨肉瘤的AUC為0.746。見圖1。經(jīng)Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析，IHC結(jié)果與蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果具有相關(guān)性(P<0.001)。

圖1 組織NOX2蛋白相對表達量用于診斷骨肉瘤ROC曲線

2.2 不同程度NOX2蛋白表達骨肉瘤患兒相關(guān)指標比較 根據(jù)IHC法檢測的組織NOX2蛋白表達狀態(tài)分為低表達組(n=89)與高表達組(n=45)。結(jié)果顯示，高表達組病灶數(shù)目≥5個及新輔助化療反應不良的患兒比例高于低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同程度NOX2蛋白表達骨肉瘤患兒相關(guān)指標比較/例(百分率/%)

2.3 單因素和多因素分析影響5年L-PD預后的臨床因素 隨訪期內(nèi)發(fā)生L-PD的患兒有34例。Kaplan-meier生存曲線結(jié)果顯示，組織NOX2高表達者5年無L-PD時間短于低表達者(χ2=6.204，P<0.001，圖2)。單因素及多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，組織NOX2蛋白高表達是骨肉瘤患兒5年L-PD預后不良的獨立預測因子(P<0.001)。見表2。

圖2 組織NOX2蛋白表達狀態(tài)與骨肉瘤患兒生存時間的Kaplan-Meier生存曲線

表2 單因素及多因素COX回歸模型分析影響骨肉瘤患兒5年L-PD預后的預測因素

2.4 ROC曲線分析組織NOX2蛋白表達預測骨肉瘤患兒新輔助化療反應及L-PD的臨床效能 經(jīng)ROC曲線分析，組織NOX2蛋白表達預測骨肉瘤患兒新輔助化療反應不良及L-PD的AUC分別為0.774(95%可信區(qū)間0.693～0.855)、0.774(95%可信區(qū)間0.678～0.870)。見表3、圖3。

表3 組織NOX2蛋白表達對骨肉瘤患兒新輔助化療反應及L-PD預測價值分析

圖3 組織NOX2蛋白表達預測骨肉瘤患兒新輔助化療反應及L-PD的ROC曲線(a.新輔助化療反應不良；b.預測L-PD)

3 討論

骨肉瘤是較常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，是高度侵襲性腫瘤，易轉(zhuǎn)移至肺部。轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的5年存活率僅有15%～30%，對于可以完全切除的局限性骨肉瘤，5年存活率僅提高至70%[8-9]。因此，臨床仍迫切需要尋找新的預后生物標志物以預測治療后局部病變進展狀態(tài)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，組織NOX2蛋白表達預測骨肉瘤患兒L-PD有很好的效能。NOX是一種用以介導電子跨膜運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)，參與激酶磷酸化，分布廣泛，在胸腺、脾、小腸、胰腺等器官及非吞噬細胞內(nèi)也有表達[5]。NOX酶的作用是觸發(fā)適應機制以響應壓力、環(huán)境攻擊或其他有害刺激，其對入侵微生物造成直接損害的作用可以被認為是利用ROS破壞入侵微生物大分子能力的應激反應的一個子類。ROS在先天免疫中的其他適應性作用也符合這一范式，但NOX產(chǎn)生的ROS也可直接損傷宿主組織，從而引發(fā)進一步組織損傷的過度炎癥反應，造成改變細胞凋亡和分化程序等長期變化。其中，NOX2衍生的ROS被認為在發(fā)病機制中起重要作用[10-11]。已有眾多生物標志物被證實是通過調(diào)節(jié)ROS來影響骨肉瘤的疾病進展。CYT997可通過ROS和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑顯著增加細胞凋亡和自噬，并且CYT997誘導的ROS和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相互增強[12]。長鏈非編碼RNA THAP9-AS1通過減少ROS和通過SOCS3/JAK2/STAT3通路增強骨肉瘤細胞的線粒體膜電位來降低氧化應激，且其穩(wěn)定過表達有助于體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[13]。Withaferin-A通過ROS介導的線粒體膜電位降低和caspase-3激活誘導骨肉瘤U2OS細胞凋亡[14]。本研究骨肉瘤組的組織NOX2蛋白表達顯著高于參考組，表明NOX2在骨肉瘤組織中存在差異表達，組織NOX2蛋白表達還與骨肉瘤患兒的病灶數(shù)目及新輔助化療反應相關(guān)，可以說明NOX2與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展有一定相關(guān)性。

NOX2已被證實參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，如NOX2 mRNA在人炎癥性腸病結(jié)腸組織中的表達量顯著更高，是患者自身正常結(jié)腸組的2倍[15]。SARS-CoV-2感染可能引起小膠質(zhì)細胞中NOX2活化，從而激活通過釋放氧化化合物和促炎細胞因子放大炎癥過程[16]。髓系細胞NOX2形成的ROS對于吞噬微生物的破壞至關(guān)重要。有研究表明，由惡性微環(huán)境中的NOX2+骨髓細胞形成的ROS發(fā)揮與腫瘤細胞生長和擴散相關(guān)的多種作用；腫瘤浸潤性髓系細胞和NOX2+白血病骨髓細胞可能通過產(chǎn)生ROS損害相鄰細胞毒性淋巴細胞的功能和活力，包括自然殺傷細胞和T細胞、氧化DNA以觸發(fā)促癌體細胞突變或影響氧化還原平衡在癌細胞中控制其增殖和存活[17-18]。有研究表明，NOX2的表達狀態(tài)與骨肉瘤患者的預后結(jié)局相關(guān)[19]。本研究針對年齡≤18歲的骨肉瘤患兒進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織NOX2高表達確實影響患兒預后，有預測骨肉瘤患兒L-PD及新輔助化療反應的效能。

綜上所述，NOX2在骨肉瘤組織組織中呈高表達，且與病灶數(shù)目增多相關(guān)。NOX2表達對骨肉瘤患兒新輔助化療不良及L-PD具有良好的預測效能，NOX2有可能成為局限性骨髓瘤患兒新輔助化療療效及預后預測的潛在生物標志物。