布地奈德對(duì)哮喘小鼠模型IL-22的調(diào)控作用

王明磊，王文革，張俊紅，戰(zhàn)大偉，顏克松

(1.河北北方學(xué)院研究生部，河北 張家口 075000;2.中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院兒科，北京 100142;3.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科，北京 100048)

研究報(bào)告

布地奈德對(duì)哮喘小鼠模型IL-22的調(diào)控作用

王明磊1，王文革2*，張俊紅2，戰(zhàn)大偉3，顏克松3

(1.河北北方學(xué)院研究生部，河北 張家口 075000;2.中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院兒科，北京 100142;3.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科，北京 100048)

目的 觀察白介素22(IL-22)在哮喘模型中的作用，研究布地奈德對(duì)哮喘小鼠模型氣道炎癥及IL-22的調(diào)控作用。方法 24只BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、哮喘模型組和布地奈德組3組，用卵清蛋白(OVA)致敏、激發(fā)小鼠以制備哮喘模型。小鼠肺組織進(jìn)行HE及AB-PAS染色，進(jìn)行氣道炎癥評(píng)分，ELISA法檢測(cè)3組小鼠肺泡灌洗液(BALF)中IL-22的水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠肺組織中IL-22mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 與對(duì)照組相比較，哮喘小鼠肺組織炎癥評(píng)分增加，BALF中IL-22水平增高，肺組織中IL-22mRNA表達(dá)水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給予布地奈德治療后，小鼠氣道炎癥評(píng)分及肺組織IL-22mRNA的表達(dá)水平均較哮喘組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 布地奈德對(duì)哮喘氣道炎癥的治療作用與其抑制肺內(nèi)IL-22的表達(dá)和分泌有關(guān)。

哮喘；IL-22；布地奈德；氣道炎癥；氣道重塑

哮喘是一種多種細(xì)胞及細(xì)胞組分共同參與的異質(zhì)性疾病，以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為主要特征[1]。新近研究證實(shí)，在哮喘、炎癥性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種慢性炎癥性疾病的進(jìn)程中，均存在著以IL-22分泌亢進(jìn)或受抑為特征的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制異常[2,3]。以布地奈德為代表的吸入性糖皮質(zhì)激素(inhaled corticosteroids，ICS)是目前控制哮喘氣道炎癥的首選治療措施[4]，ICS控制哮喘的作用機(jī)制涉及IL-17、IL-10、IL-4、IFN-γ等多種機(jī)制[5-9]。目前鮮有研究探討ICS是否會(huì)對(duì)哮喘中IL-22的分泌和表達(dá)產(chǎn)生影響。本研究通過(guò)探討哮喘小鼠肺組織中IL-22的表達(dá)水平，以及布地奈德干預(yù)后的影響，探討IL-22在哮喘中的作用及ICS治療哮喘的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠24只，4周齡，體重12～14 g，購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司[SCXK(京)2016-0002]，實(shí)驗(yàn)在中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK(軍)2012-0013]，按3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 主要試劑

卵清白蛋白(OVA，A5253-250 g，純度≥98%)、十二水硫酸鋁鉀(237086)購(gòu)自sigma；吸入用布地奈德混懸液(1 mg/2 mL)購(gòu)自阿斯利康制藥有限公司；HE染色試劑盒及AB-PAS染色試劑盒購(gòu)自武漢谷歌生物公司；ELISA IL-22試劑盒購(gòu)自eBioscience；RNAprep Pure 動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(DP431)、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(KR106)及SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑(FP205)購(gòu)自天根生化科技有限公司；IL-22引物及內(nèi)參β-actin由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建模方法

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，經(jīng)隨機(jī)數(shù)表法分為A組對(duì)照組、B組哮喘模型組和C組布地奈德組，每組8只。參考文獻(xiàn)[10,11]建立哮喘模型，B、C組小鼠分別于實(shí)驗(yàn)第0、7、14天腹腔注射OVA致敏液0.2 mL(內(nèi)含OVA 100 μg，硫酸鋁鉀1 mg，PBS溶解)，A組腹腔注射PBS溶液。自實(shí)驗(yàn)21 d起，將小鼠置于自制霧化盒內(nèi)，用空氣壓縮泵對(duì)小鼠進(jìn)行霧化激發(fā)。A組以PBS激發(fā)，B、C2組以5%的OVA溶液激發(fā)，每日1次，每次30 min，連續(xù)激發(fā)12 d。

1.3.2 給藥方法

每次激發(fā)前30 min，給予C組小鼠霧化吸入布地奈德溶液30 min，A、B組小鼠同時(shí)給予生理鹽水霧化。

1.3.3 一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意觀察小鼠是否出現(xiàn)撓耳抓鼻、打噴嚏、弓背直立、腹肌抽搐、煩躁不安等行為學(xué)改變。

1.3.4 ELISA檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-22的水平

1%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，引頸法處死小鼠，將小鼠置于 75%酒精中浸泡2 min，切開(kāi)頸胸部皮膚，逐層分離組織，充分暴露氣管，在氣管上段做一橫行切口，以21 G的注射器針頭行氣管插管，結(jié)扎右肺，以注射器吸取0.3 mL的PBS溶液，經(jīng)氣管插管緩慢注入小鼠左肺進(jìn)行灌洗，待PBS溶液完全進(jìn)入左肺后緩慢回抽。重復(fù)以上過(guò)程3次，3次灌洗的總回收率約為60%?；爻楹笏靡后w用單層紗布過(guò)濾，以除去黏液，即刻離心(2000 r/min，4℃，10 min)，回收上清置于-80℃保存，依照IL-22 ELISA試劑盒操作步驟檢測(cè)BALF中IL-22的水平。

1.3.5 小鼠肺組織病理學(xué)檢測(cè)及炎癥評(píng)分

取右上葉肺組織，4%的多聚甲醛固定48 h。石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE及AB-PAS染色，觀察小鼠支氣管及血管周圍嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況，觀察氣道杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌情況，觀察小鼠肺組織內(nèi)是否出現(xiàn)了肺泡壁變薄甚至斷裂，間隔增寬，以及是否存在支氣管上皮增生，基底膜及氣道平滑肌增厚，支氣管管腔狹窄等典型哮喘病理學(xué)改變。觀察綜合文獻(xiàn)[12,13]對(duì)各組病理學(xué)進(jìn)行分級(jí)評(píng)分并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：0分：無(wú)炎癥細(xì)胞；1分：少許炎癥細(xì)胞；2分：較多分布不均勻的炎癥細(xì)胞，或炎癥細(xì)胞形成環(huán)狀，層厚為1個(gè)細(xì)胞；3分：大量分布均勻的炎癥細(xì)胞，少見(jiàn)聚集成團(tuán)，或炎癥細(xì)胞形成環(huán)狀；4分：大量炎癥細(xì)胞聚集成團(tuán)，或炎癥細(xì)胞形成環(huán)狀，層厚 < 4個(gè)細(xì)胞。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠肺組織中IL-22mRNA的表達(dá)

IL-22 上游引物 5’-CCGAGGAGTCAGTGCTAA GG-3’，下游引物3’-TCTGGATGTTCTGGTCG TCA-5’。小鼠肺組織總RNA采用RNA prep Pure提取試劑盒提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后進(jìn)行RT-PCR。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

哮喘模型組小鼠在激發(fā)過(guò)程中及激發(fā)后均可觀察到撓耳抓鼻、打噴嚏、弓背直立、腹肌抽搐、煩躁不安等癥狀，可于短時(shí)間內(nèi)自行緩解。對(duì)照組小鼠未見(jiàn)上述改變，布地奈德組小鼠以上行為改變與哮喘模型組比較明顯減少。

2.2 小鼠肺組織病理學(xué)改變

如圖1、圖2所示，通過(guò)HE染色及AB-PAS染色可以看到，對(duì)照組小鼠支氣管及肺泡等肺組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，僅在黏膜下可見(jiàn)少許散在的炎性細(xì)胞，血管及支氣管周圍無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)杯狀細(xì)胞增生，也無(wú)肺泡壁變薄、斷裂及間隔增寬等現(xiàn)象。哮喘模型組小鼠的病理切片可觀察到明顯的氣道炎癥反應(yīng)，顯微鏡下可觀察到小鼠肺泡壁變薄、甚至有些已經(jīng)發(fā)生斷裂，肺泡之間間隔增寬，支氣管及血管周圍可見(jiàn)大量嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有杯狀細(xì)胞大量增生，黏液分泌增多的現(xiàn)象。哮喘小鼠肺組織同時(shí)伴發(fā)了支氣管上皮增生，基底膜及氣道平滑肌增厚，及支氣管管腔狹窄等重塑性改變。給予布地奈德干預(yù)后，小鼠支氣管及血管周圍嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減少，杯狀細(xì)胞增生減少，支氣管上皮增生，基底膜及氣道平滑肌增厚，及支氣管管腔狹窄等病理學(xué)改變明顯改善。

2.3 肺組織病理學(xué)炎癥評(píng)分

如圖3炎癥評(píng)分結(jié)果顯示：哮喘模型組的炎癥評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P< 0.05)，布地奈德組炎癥評(píng)分高于對(duì)照組(P< 0.05)，但低于哮喘模型組(P< 0.05)。

2.4 小鼠BALF中IL-22水平的變化

3組BALF中IL-22的水平如圖4所示。與對(duì)照組相比較，哮喘組BALF中IL-22的水平明顯增高(P< 0.05)。布地奈德組小鼠BALF中IL-22的水平高于對(duì)照組，但較哮喘模型組明顯下降(P< 0.05)。

圖1 HE染色下小鼠肺組織鏡下觀(×400)Fig.1 Histology of the mouse lung HE staining

圖2 AB-PAS染色下小鼠肺組織鏡下觀(×400)Fig.2 Histology of the mouse lung(AB-PAS staining)

注：與對(duì)照組相比，*P < 0.05；與哮喘模型組相比，**P < 0.05。圖3 布地奈德對(duì)哮喘小鼠肺組織炎癥評(píng)分的影響(n=8)Note.*P < 0.05 compared with control group,**P < 0.05 compared with asthma group.Fig.3 Effect of budesonide on murine inflammatory scores for lung tissue

注：與對(duì)照組相比，*P < 0.05，與哮喘模型組相比，**P < 0.05。圖4 支氣管肺泡灌洗液中IL-22的水平(n=8)Note.*P < 0.05 compared with control group,**P < 0.05 compared with asthma group.Fig.4 Secretion levels of IL-22 in the bronchoalveolar lavage fluid

2.5 小鼠肺組織中IL-22 mRNA 的表達(dá)水平

3組小鼠肺組織中IL-22 mRNA 的表達(dá)水平如圖5所示。統(tǒng)計(jì)表明，與對(duì)照組比較，哮喘組肺組織中IL-22 mRNA 的表達(dá)水平明顯增高(P< 0.01)。給予布地奈德、黃芪甲苷治療后，IL-22 mRNA水平較哮喘組下降(P< 0.01)，黃芪甲苷組小鼠肺組織中IL-22 mRNA水平在數(shù)值上低于布地奈德組(P> 0.05)。

注：與對(duì)照組相比，*P < 0.05；與哮喘模型組相比，**P < 0.05。圖5 肺組織中IL-22 mRNA 的表達(dá)水平(n=8)Note.*P < 0.05 compared with control group, **P < 0.05 compared with asthma group.Fig.5 Expression of IL-22 mRNA in mice of three groups

3 討論

IL-22屬于IL-10細(xì)胞因子家族，可由Th22細(xì)胞、Th17細(xì)胞、NK細(xì)胞、DCs、LTi-like細(xì)胞、固有淋巴細(xì)胞(ILCs)等分泌，巨噬細(xì)胞、DC和非免疫細(xì)胞則不產(chǎn)生IL-22。在體內(nèi)IL-22的總分泌量中，Th22約占37%～63%，是體內(nèi)IL-22的主要來(lái)源[14-17]。IL-22生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮依賴于其與IL-22R1/IL-10R2受體復(fù)合物的結(jié)合[18]，IL-22與受體的特異性結(jié)合依賴于IL-22R1，IL-10R2則主要參與了細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[19]。IL-22由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，但由于免疫細(xì)胞不表達(dá)IL-22R1，故IL-22對(duì)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞并不發(fā)揮生物學(xué)作用，而呼吸道上皮細(xì)胞、呼吸道平滑肌細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞等表達(dá)IL-22受體的細(xì)胞，常成為其作用的靶點(diǎn)[20]。IL-22在保護(hù)皮膚及肺組織粘膜屏障、組織損傷及哮喘等疾病的發(fā)病過(guò)程中十分關(guān)鍵[21，22]，有研究提示，它很可能是哮喘等炎癥性疾病由急性改變轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿淖兊年P(guān)鍵性因子之一[23-25]?，F(xiàn)階段對(duì)于IL-22的研究較多是通過(guò)采集患者標(biāo)本進(jìn)行，對(duì)于IL-22在動(dòng)物模型中的研究仍比較少。哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，由于不同患者遺傳因素、所處環(huán)境、發(fā)病原因及病程的不同，?？蓪?duì)研究結(jié)果造成一定的影響。同時(shí)，針對(duì)患者的研究也常受到取材、檢測(cè)發(fā)方法等方面的限制，不利于系統(tǒng)、全面、客觀的探討IL-22作用于哮喘的機(jī)制。與之相比，動(dòng)物模型更便于控制實(shí)驗(yàn)條件，將臨床標(biāo)本研究、動(dòng)物模型研究結(jié)合起來(lái)，有利于我們更系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)IL-22在哮喘中的作用及作用機(jī)制，但目前，對(duì)于IL-22在哮喘小鼠模型中作用的研究還較少。

我們通過(guò)對(duì)哮喘模型的研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘病程的炎癥反應(yīng)階段，哮喘模型組小鼠BALF中IL-22的水平，肺組織中IL-22 mRNA 的表達(dá)水平均較哮喘模型組明顯增高，同時(shí)哮喘模型組小鼠伴有肺組織炎癥評(píng)分增高，大量嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞增生，黏液分泌增多等氣道炎癥反應(yīng)，甚至出現(xiàn)了支氣管上皮增生，基底膜及氣道平滑肌增厚，及支氣管管腔狹窄等重塑性改變[26]。證實(shí)在哮喘發(fā)病的初期，即存在IL-22表達(dá)及分泌水平的增高，IL-22表達(dá)的增加很可能是促進(jìn)哮喘氣道炎癥進(jìn)行性發(fā)展，甚至導(dǎo)致后期氣道重塑性改變的的重要因素之一。

吸入性糖皮質(zhì)激素(ICS)是目前控制哮喘氣道炎癥的一線治療措施，可有效控制哮喘氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生，并減緩氣道重塑進(jìn)程，布地奈德作為ICS中最常應(yīng)用于臨床的一種藥物，已被證實(shí)可通過(guò)影響Th17、Treg、Th1、Th2等多種炎癥細(xì)胞及炎性細(xì)胞因子，抑制哮喘的發(fā)展[5-9]。目前尚無(wú)研究探討吸入性糖皮質(zhì)激素是否會(huì)對(duì)IL-22的表達(dá)和分泌產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，布地奈德可有效降低哮喘小鼠BALF中IL-22的水平，以及肺組織中IL-22 mRNA 的表達(dá)水平，提示ICS治療哮喘的機(jī)制可能與其具有降低IL-22表達(dá)水平有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，IL-22表達(dá)水平的增高是開(kāi)啟哮喘氣道炎癥及氣道重塑進(jìn)程的炎性因子之一，布地奈德能通過(guò)抑制IL-22的表達(dá)及分泌，減緩肺組織內(nèi)炎癥反應(yīng)及氣道重塑的發(fā)生，從而對(duì)哮喘發(fā)揮治療作用。

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Budesonide inhibits murine asthmatic airway inflammation through reduction IL-22 secretion

WANG Ming-lei1, WANG Wen-ge2*, ZHANG Jun-hong2, ZHANG Da-wei3, YAN Ke-song3

(1.Department of Postgraduates, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China; 2.Department of Paediatrics, Air Force General Hospital of People’s Liberation Army,Beijing 100142; 3.Department of Laboratory Animals， 304 Hospital of Chinese Peoples Liberation Army,Beijing 100048)

Objective To study the effect of Interleukin-22 (IL-22) on murine asthmatic airway inflammation and airway remodeling, observe the effect of budesonide on IL-22 of asthmatic mouse model, explore the mechanism of budesonide in the treatment of asthma. Methods Ovalbumin(OVA) was used as an allergen to sensitize and challenge the mice. 24 female specific-free (SPF) BALB/c mice aged four weeks were randomly divided into 3 groups：control group, asthma group and budesonide treatment group (BUD group). For Histopathological Examination, HE staining was used to measure the inflammation scores, AB-PAS staining was used to measure the hyperplasia of goblet cells and mucin. Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) was used to analyze IL-22 levels in bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Quantitative Real-time PCR was performed to analyze the effects of budesonide on IL-22 mRNA levels in lung tissue. Results The inflammation scores of asthma group were elevated compared with the control group. An overall change towards less severe asthmatic airway inflammation by the end of the trial was observed in the BUD group. IL-22 levels in BALF were significant decreased after the treatment of budesonide, the mRNA levels of IL-22 were obviously decreased in BUD group, too. A significant positive correlation was observed between the mRNA levels of IL-22 and airway inflammation. Conclusions The increasing IL-22 secretion can lead to the occurrence of airway inflammation of asthma. Budesonide can inhibit the expression of IL-22, thereby Budesonide could inhibit the development of airway inflammation of asthma.

Asthma; Interleukin-22; Budesonide; Airway inflammation；Airway remodeling

北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(7162028)；中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院面上項(xiàng)目(KZ2014005)。

王明磊(1988- )，女，碩士研究生，研究方向：兒童哮喘。 E-mail：wangml2015@126.com

王文革(1966- )，女，副主任醫(yī)師，博士，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治兒童哮喘。E-mail：1264516006@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0055-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.013

2017-04-13