高分辨率熔解曲線技術用于結核分枝桿菌臨床分離株異煙肼耐藥性的快速檢測

楊彩虹，楊 敏，于 璐，包海洋，吳長新，曹旭東，陳創(chuàng)夫

?

高分辨率熔解曲線技術用于結核分枝桿菌臨床分離株異煙肼耐藥性的快速檢測

楊彩虹1，楊 敏2，于 璐3，包海洋1，吳長新3，曹旭東3，陳創(chuàng)夫1

目的 評價高分辨率熔解曲線分析技術(high-resolution melting curve，HRM)檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的應用價值。方法 1)通過傳統(tǒng)比例法藥敏實驗對本實驗室保存的49株結核分枝桿菌進行異煙肼耐藥性分析。2)進一步對該結核分枝桿菌進行異煙肼耐藥相關基因KatG基因和inhA基因進行異煙肼耐藥決定區(qū)測序分析，篩查突變位點。3)根據(jù)篩查到的突變位點設計高分辨率熔解曲線分析所用的特異性引物，對異煙肼耐藥基因耐藥決定區(qū)進行高分辨率熔解曲線分析檢測DNA突變，評估用高分辨率熔解曲線分析技術對結核分枝桿菌異煙肼耐藥性檢測的效率。結果 1)比例法藥敏結果顯示，49株實驗菌株中20株為異煙肼耐藥株，29株為異煙肼敏感株。 2)測序分析結果顯示：①KatG基因出現(xiàn)了4種突變形式，分別是234單位點突變；234、315雙位點突變；234、463雙位點突變；234、315、463三位點聯(lián)合突變。②inhA基因檢測到3種突變，即-8位、-15位、-152位。3) ①對耐藥株的基因突變進行分析發(fā)現(xiàn)：20株異煙肼耐藥株中11株存在KatG基因第315位密碼子的突變、占異煙肼耐藥株的55%；6株存在inhA基因-15(4株)位堿基、-8(1株)位堿基、-152(1株)位堿基的突變，共占異煙肼耐藥株的30%；2株同時存在基因KatG315密碼子和inhA-15位堿基的突變，占異煙肼耐藥株的10%；1株均未檢測到KatG基因和inhA基因的突變，占異煙肼耐藥株的5%。通過基因突變檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的敏感性為95%、特異性為100%。 ②用高分辨率溶解曲線檢測實驗菌株耐藥基因突變的結果顯示，18株存在基因突變，24株不存在基因突變，檢測的靈敏度為94.7%、特異性為80%。③以高分辨率熔解曲線檢測到突變?yōu)槟退幍呐袛鄻藴?，檢出19株為耐藥株，24株為敏感株。以比例法藥敏結果為參照，檢測的靈敏度為95%、特異性為82.76%。結論 高分辨率溶解曲線用于結核分枝桿菌對異煙肼耐藥性的檢測具有較好的靈敏度，耗時短，在異煙肼耐藥結核病的快速診斷方面具有一定的應用價值。

結核分枝桿菌；高分辨率熔解曲線(HRM)；DNA測序；耐藥性；異煙肼

結核病是感染結核分枝桿菌引起的傳染病。近年來由于HIV的流行及耐藥結核分枝桿菌(MDR-TB)的出現(xiàn)等原因，使結核病成為一個嚴重威脅人類生存的公共衛(wèi)生問題。在抗擊結核病的醫(yī)療實踐過程中，用到利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、氧佛沙星、阿米卡星、卡那霉素等一線及二線抗結核藥物。異煙肼對結核桿菌有很強的抑菌和殺菌作用，該藥在消化道吸收完全，易滲入肺組織和腦脊液，對宿主細胞內(nèi)外各期結核病病灶中的結核桿菌均有殺滅作用。異煙肼在肝內(nèi)被乙?；土u化后，可隨尿排出，毒性較??；由于其作用強、療效好、用量少、價格低等原因，多年來異煙肼成為臨床抗結核的首選藥[1]。幾十年過去了，結核桿菌對異煙肼已產(chǎn)生了耐藥性，在1990年、2000年和2010年全國3次結核病流行病學抽樣調(diào)查數(shù)據(jù)中顯示，異煙肼初始耐藥率分別為9.6%、11.0%、28.2%，呈現(xiàn)上升趨勢；異煙肼獲得性耐藥率分別為23.5%、31%、30.8%，亦呈現(xiàn)嚴重上升趨勢[2]。耐藥及耐多藥結核桿菌感染，使原來可治愈的結核病變成難以治療的致死性疾病。

目前，常用的結核桿菌藥敏檢測方法，是將菌株接種到含有抗癆藥物的固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，觀察其生長情況來判斷耐藥性。該方法準確性高，但耗時長，一般需要1～2個月時間，不僅受培養(yǎng)條件、培養(yǎng)技術及各種人為因素的影響，而且對快速診斷結核耐藥性來說，存在嚴重的滯后性，有些嚴重患者在藥敏結果出來前已死亡。因此，快速檢測獲得菌株的耐藥信息，及時設計制定臨床化療方案，是有效治療耐藥結核病的關鍵[3]。

回顧近年來結核桿菌異煙肼耐藥機制研究資料顯示，結核桿菌發(fā)生異煙肼耐藥與其基因組中katG、inhA、kasA、oxy-ahpC、ndh、efpA、furA、iniA等基因突變有關；其中50%～70%的結核桿菌異煙肼耐藥株katG基因有突變，25%的的結核桿菌異煙肼耐藥株與inhA基因突變有關?？傮w上，高達80%的結核桿菌異煙肼耐藥株基因突變發(fā)生在katG和inhA這兩個基因。因此，katG和inhA這兩個基因可作為臨床檢測異煙肼耐藥菌的靶點[4]。

本實驗在傳統(tǒng)耐藥分析基礎上，對異煙肼耐藥相關基因耐藥決定區(qū)進行DNA測序，根據(jù)測序檢測到的DNA突變，設計HRM實驗檢測KatG基因、inhA基因突變的特異性引物，對實驗菌株進行HRM檢測，分析HRM檢出耐藥基因突變的效率，評估以HRM檢測到DNA突變?yōu)榫昴退幍呐袛鄻藴?，分析用HRM對結核分枝桿菌異煙肼耐藥性進行檢測的效率。以建立一種快速檢測異煙肼耐藥性的方法，并評價其應用價值，為結核病的治療提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 結核分枝桿菌H37Rv及49株實驗菌株均由本實驗保存。

1.1.2 主要試劑 氨酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、檸檬酸鎂、丙三醇、天澤恩基因柱式分支桿菌DNAout 試劑盒、高分辨率熔解曲線試劑盒(羅氏公司)、谷核酸染料及2×Taq PCR Master Mix 購與生工生物科技有限公司、引物均由上海祥音生物科技有限公司合成、DNA ladder購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器與設備 渦旋混合儀、恒溫培養(yǎng)箱、實時熒光定量PCR儀(LightCycler480，瑞士羅氏公司)。Nanodrop 2000分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 比例法藥敏實驗 將培養(yǎng)至出現(xiàn)可見菌落的結核分枝桿菌進行藥敏實驗，實驗操作遵循《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》進行，異煙肼在含藥培養(yǎng)基中的濃度為0.2 μg/mL[5]。

1.2.2 結核分枝桿菌DNA的提取及HRM檢測模板濃度的標準化 在改良的羅氏培養(yǎng)基上挑取適量生長良好的結核分枝桿菌加入磨菌瓶，磨菌瓶提前加入磨菌株高壓備用，使用時再加入5～6滴生理鹽水。每株菌磨3 min，靜止5 min，然后分裝到0.5 mL的滅菌管中，再將其放入滅活儀85 ℃，1 h。滅活后的菌液按照柱式分枝桿菌DNAout試劑盒說明書提取，獲得的DNA原液用分光光度計檢測濃度， HRM檢測所需模板將DNA原液用雙蒸水稀釋成10 ng/μL，備用。

1.2.3 異煙肼耐藥決定區(qū)(IRDR)DNA測序分析 結核桿菌異煙肼耐藥機制研究資料顯示，結核桿菌發(fā)生異煙肼耐藥與其基因組中katG、inhA、kasA、oxy-ahpC、ndh、efpA、furA、iniA等基因突變有關[6]。但總體上，高達80%的結核桿菌異煙肼耐藥株基因突變發(fā)生在katG(基因登錄號為X68081)和inhA(基因登錄號為U66801)這兩個基因，這兩個基因分別存在跟異煙肼耐藥相關的突變位點，這些位點主要集中在基因的某一區(qū)域，這個區(qū)域就稱為異煙肼耐藥決定區(qū)(IRDR)[7]。katG基因的異煙肼耐藥決定區(qū)有2個，分別為KatG1區(qū)和KatG2區(qū)；KatG1區(qū)從第194個密碼子到第348個密碼子之間，包含189個密碼子，片段長度為569bp；KatG2區(qū)從第348個密碼子到第524個密碼子之間，包含177個密碼子，片段長度為531 bp。inhA基因啟動子區(qū)的擴增覆蓋-8、-15位點，片段長度為300 bp。針對katG基因和inhA基因異煙肼耐藥決定區(qū)設計的測序引物序列見表1所示。

表1 異煙肼耐藥決定區(qū)DNA測序用到的引物
Tab.1 Primers of DNA sequencing

基因(Gene)序列(Thesequence)退火溫度(Tm)片段長度(Fragmentlength)KatG1F1:CGATGAGGTC-TATTGGGGCA58.5℃568bpR1:AGAGGTCAGT-GGCCAGCATCKatG2F2:CTGGCGCTTG-GCAATACACC59.5℃531bpR2:GGATCTCTTC-CAGGGTGCGAInhAF:ACATACCTGCT-GCGCAATTC59.7℃300bpR:CCGATCCCCCG-GTTTCCTC

對49株實驗菌株進行異煙肼耐藥決定區(qū)進行PCR擴增，PCR體系為25 μL，包括9.7 μL dd H2O、25 μm上下游引物各0.4 μL、模板2 μL、Mix 12.5 μL。PCR反應條件為95 ℃預變性5 min、94 ℃變性40 s、59.5 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s、重復30個循環(huán)、72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。

將PCR擴增產(chǎn)物進行DNA測序分析，DNA測序結果與GenBank上公布的結核分枝桿菌H37Rv標準株對應基因序列進行比對分析，獲得每株菌在耐藥決定區(qū)的突變信息，將該突變信息與文獻報道過的突變位點進行比較，觀察二者之間的異同并統(tǒng)計各突變位點在耐藥株里所占比例。

1.2.4 高分辨率熔解曲線(HRM)分析 根據(jù)結核分枝桿菌在異煙肼耐藥決定區(qū)的測序結果，針對耐藥突變發(fā)生頻率最高的部位設計HRM檢測KatG基因和inhA基因突變的特異性引物(引物序列見表2)，片段長度約為100～400 bp。

表2 HRM檢測異煙肼耐藥性的引物
Tab.2 Primers of detecting isoniazid-resistance by HRM

GeneSequenceAnnealingtempSizeofproductKatGF:TCGTATGGCACCG-GAACC59℃123bpR:CAGCTCCCACTCG-TAGCCInhAF:CGTTACGCTCGTG-GACATAC57℃126bpR:TCCGGTAACCAG-GACTGAAC

對異煙肼耐藥決定區(qū)進行DNA突變的HRM檢測。HRM檢測的反應體系為10 μL，其中包括HRM Mix 5μL 、10 μmol/L上下游引物各0.5 μL、ddH2O 1.8 μL、MgCl2 1.8 μL、模板1 μL。

HRM檢測檢測參數(shù)如表3、表4。

表3 高峰辯率熔解曲線(HRM)分析實驗條件設計
Tab.3 Experiment conditions of HRM

ProgramCyclesAnalysismodePre-incubate1NoneAmplification55QuantificationTm-calling1MeltingcurvesCooling1None

表4 不同反應階段條件
Tab.4 Experiment conditions of each procedure

ProcedureTarget(℃)AcquisitionmodeHold(h:m:s)Rapmrate(℃/S)Acquisitions(per℃)Pre-incubate95None00:10:004.495None00:00:104.4amplification59None00:00:152.272Single00:00:104.495None00:01:004.4Tm-calling40None00:01:002.270None00:00:014.495Continuous0.0320Cooling40None00:00:302.2

每個樣本檢測時設置3個重復樣本孔。HRM擴增完成后，對結果進行分析。

首先，①對樣本的擴增曲線進行分析，確定模板濃度是否符合要求，當CP<30時符合；②再觀察每個樣本擴增曲線上顯示的CP值是否一致對模板的起始量是否在同一水平進行分析。然后，再對樣本的熔解峰進行分析，確定設計的引物是否符合要求，觀察是否存在雜峰或者引物二聚體。最后，再對樣本是否存在基因突變進行分析，以H37Rv為野生型參照，比較3個重復樣本孔與野生型復孔的峰形和顏色異同來判斷樣本是否存在基因突變。當樣本的3個復孔或2個復孔的峰形和顏色相同且與野生型復孔的峰型不同時，則判斷為基因突變株；反之則為野生株。若3個重復樣本孔之間的峰形和顏色都不同，則要重復試驗以確定。

以上分析完成后，對49株結核分枝桿菌異煙肼耐藥性HRM檢測的結果進行整理分析，再評估用HRM對結核分枝桿菌臨床分離株進行異煙肼耐藥性檢測的效率。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 對所有菌株HRM檢測結果分析完成后，應用spss17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，以DNA測序結果為參照，計算HRM檢測結果與DNA測序檢測結果之間的符合率。以傳統(tǒng)藥敏結果為參照，計算HRM檢測結果與傳統(tǒng)藥敏檢測結果之間的符合率。再用卡方檢測法分析HRM檢測菌株耐藥性與傳統(tǒng)藥敏檢測菌株耐藥性、DNA測序檢測菌株耐藥性與之間存在的差異性。用Kappa檢測來分析兩種結果的一致性。Kappa<0.4時為低度一致性；0.75≥Kappa≥0.4時為中度一致性；1≥Kappa≥0.75時為高度一致性。

2 結 果

2.1 比例法藥敏實驗結果 比例法藥敏結果顯示49株結核分枝桿菌中20株為異煙肼耐藥株，29株為異煙肼敏感株。

2.2 異煙肼耐藥決定區(qū)(IRDR)DNA測序分析結果

2.2.1 目的基因KatG和inhA的擴增結果 用測序引物PCR分別擴增實驗菌株的基因組DNA，取5μL擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。49株分枝桿菌及H37Rv標準株全部擴增出KatG基因568 bp和531 bp片段長度，如圖1。inhA基因擴增出300 bp片段長度，如圖2所示。將可以觀察到陽性擴增條帶的樣本剩余部分送至生工基因公司測序。

M: 2000 mark; 1-5: strains; H37Rv: positive control; Empty: blank control.圖1 katG基因 IRDR 區(qū)域PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of isoniazid resistance-determining region

M: 500 mark; 1-5: strains; H37Rv: positive control; Empty: blank control圖2 InhA基因PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of inhA

2.2.2 目的基因KatG和inhA的測序分析 將DNA測序結果分別與GenBank上公布的結核分枝桿菌H37Rv基因KatG和inhA基因對應序列進行比較，50株分枝桿菌中異煙肼耐藥相關基因KatG存在3種突變類型，分別為第234位密碼子GCG突變?yōu)镚GG，氨基酸由丙氨酸(Ala)突變?yōu)楦拾彼?Gly),如圖3A所示；第315位密碼子AGC的突變,如圖3B所示；第463位密碼子CGG的突變，如圖3C所示。inhA基因存在3種突變類型，分別為inhA-8位T的突變，如圖3D所示；inhA-15位C的突變，如圖3E所示；inhA-152位G的突變,如圖3F所示。

A: KatG234 GCG→GGG,Ala→Gly; B: KatG315 AGC→ACC,Ser→Thr; C: KatG463 CGG→CTG,Arg→Leu; D: inhA T-8 C; E: inhA C-15 T; F: inhA-152 G→A 圖3 DNA序列比對結果Fig.3 DNA sequence alignment results

2.2.3 各菌株在異煙肼耐藥決定區(qū)的突變位點分析 將每株菌的測序結果與GenBank上公布的標準株H37Rv的KatG基因和inhA基因對應序列進行比對分析，結果見表5所示。

表5 不同株菌在異煙肼耐藥決定區(qū)的突變信息
Tab.5 Mutation information of different strains in isoniazid resistance-determining region

ThedrugsensitivitytestStrainsKatGmutationsInhAmutationsResistantstrains1234,463-153,4,5,6,8,25,26,28,30,33,36234,315,463/27234,315/29234,315,463-831234/32,34,35,38,39234,463-1537234,315,463-152Sensitivestrains2,7,9,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,40,41,42,43,45,46,47,48,49,50-234,463/10234,463-1544234,344,463/

2.2.4KatG基因和inhA基因各位點突變類型及密碼子變化 通過對49株分枝桿菌KatG基因突變位點分析發(fā)現(xiàn)，20株異煙肼耐藥株中出現(xiàn)了4種突變類型，分別為GCG 234 GGG 單位點突變(1株)；234、AGC 315 ACC雙位點突變(1株)；234、CGG 463 CTG雙位點突變(6株)；234、315、463三位點聯(lián)合突變(12株)；30株異煙肼敏感株中出現(xiàn)了3種突變類型，分別為234、463雙位點突變，234、358雙位點突變，234、344、463三位點聯(lián)合突變，見表6所示。

表6KatG基因突變位點分析
Tab.6 Analysis of mutations ofKatGgene

ThedrugsensitivitytestMutationsCodonchangesAminoacidchangeNo.ofstrainsThepercentage(%)Resistantstrains234GCG→GGGAla→Gly15234GCG→GGGAla→Gly315AGC→ACCSer→Thr15234GCG→GGGAla→Gly315AGC→ACCSer→Thr1260463CGG→CTGArg→Leu234GCG→GGGAla→Gly463CGG→CTGArg→Leu630Sensitivestrain234GCG→GGGAla→Gly463CGG→CTGArg→Leu2793.1234GCG→GGGAla→Gly13.4358GGC→AGCGly→Ser234GCG→GGGAla→Gly344ACG→CCGThr→Pro13.4463CGG→CTGArg→Leu

研究結果顯示，出現(xiàn)頻率最高的突變位點是KatG234、KatG463，幾乎每株菌都有這兩個突變位點的存在，這與文獻報道的結果一致[9]。而KatG315位點突變是在耐藥菌株中出現(xiàn)頻率較多的位點， 20株耐藥株中有13株存在KatG315位點的突變，占異煙肼耐藥株的65%，而敏感株中沒有該位點的突變，因此，KatG315的突變是異煙肼耐藥突變位點之一，可作為檢測菌株異煙肼耐藥的靶點之一，見圖4所示。

對49株分枝桿菌inhA基因進行突變位點分析發(fā)現(xiàn)，20株異煙肼耐藥株中存在3種突變類型，分別為-8 T→C(1株)，-15 C→T(6株) ，-152 G→A(1株)。29株異煙肼敏感株有1株存在inhA-15位C→T的突變；28株未檢測到inhA基因的突變，如表7所示。

圖4 katG各突變位點在敏感株及耐藥株中所占比例Fig.4 Mutations proportion of katG in sensitive strains and resistant strains

表7inhA基因突變位點分析
Tab.7 Analysis of mutations ofinhAgene

ThedrugsensitivitytestMutationsiteDNAbasechangeNo.ofstrainsThepercentage(%)Resistantstrains-8T→C15-15C→T630-152G→A15NoNo1260Sensitivestrains-15C→T13.4NoNo2896.6

inhA基因的DNA測序結果顯示，出現(xiàn)頻率最高的突變位點是inhA-15,在異煙肼耐藥株中占30%，在異煙肼敏感株中僅占5%；而inhA-8位點、inhA-152位點的突變在異煙肼耐藥株中各占5%，而敏感株中沒有這兩個突變位點的存在，因此，inhA-8、inhA-152、inhA-15的突變是異煙肼的耐藥突變位點，可作為檢測菌株異煙肼耐藥的靶點。見圖5所示。

圖5 inhA各突變位點在敏感株及耐藥株中所占比例Fig.5 Mutations proportion of inhA in sensitive strains and resistant strains

3 評估用HRM對結核分枝桿菌異煙肼耐藥性進行檢測的價值

3.1 以DNA測序檢測到突變判斷菌株耐藥性的效率 傳統(tǒng)比例法藥敏結果與基因突變結果進一步分析發(fā)現(xiàn)，20株異煙肼耐藥株中11株存在KatG基因的突變，6株存在inhA基因的突變，2株同時存在KatG基因和inhA基因的突變，1株不存在KatG基因或inhA基因中任何一個基因的突變。以DNA測序檢測到KatG基因第315位密碼子發(fā)生突變或inhA基因第-8位堿基發(fā)生突變?yōu)楫悷熾履退幍呐袛鄻藴省?/p>

經(jīng)卡方檢測分析，以比例法為標準，在異煙肼耐藥株中，耐藥突變的菌株占95%，耐藥未突變的菌株占5%。即用DNA測序法檢測異煙肼耐藥性的敏感性為95%，特異性為100%，異煙肼耐藥檢測的Kappa值為0.957，大于0.75，故而可認為兩種檢測方法的檢測結果具有高度一致性。見表8所示。

表8 傳統(tǒng)耐藥與基因突變之間的關系
Tab.8 Relationship between the traditional resistance and genetic mutations

ThesequencingresultsThedrugsensitivitytestResistanceSensitiveTotalSensitivitySpecificityPositivepredictiveNegativepredictiveKappaMutation1901995%100%100%96.7%0.957No12930Total202949

3.2 用高分辨率溶解曲線(HRM)檢測菌株耐藥突變的效率

3.2.1 目的基因KatG和inhA的HRM擴增 用針對耐藥突變發(fā)生頻率最多的KatG315位點、inhA基因-15位點設計的HRM檢測的特異性引物，對49株結核分枝桿菌臨床分離株進行HRM擴增，擴增片段長分別為123 bp和126 bp。獲得的擴增曲線和熔解峰型見圖6、圖7所示，不存在引物二聚體的峰及其他雜峰，顯示引物特異性較好。

圖6 KatG基因HRM擴增結果Fig.6 HRM amplification results of KatG

圖7 inhA基因HRM擴增結果Fig.7 HRM amplification results of inhA

3.2.2KatG基因和inhA基因突變位點的HRM分析 經(jīng)HRM分析，以標準株H37Rv為野生型敏感株對照，49株結核分枝桿菌KatG基因和inhA基因突變位點檢測獲得的HRM分析曲線見圖8和圖9。

經(jīng)DNA測序確定，HRM檢測區(qū)不僅存在耐藥突變位點，還存在跟耐藥不相關的突變位點，因此本實驗以HRM檢測到KatG基因和inhA在檢測區(qū)存在基因突變?yōu)楫悷熾履退幍呐袛鄻藴?，來評價HRM檢測基因突變的效率。

經(jīng)卡方檢測分析，以DNA測序結果為標準，19株DNA測序結果顯示存在基因突變的菌株，HRM檢測出了18株；30株DNA測序結果顯示不存在基因突變的菌株(29株敏感株和1株未發(fā)生基因突變的耐藥株)，HRM檢測出了24株。即用HRM檢測基因突變的敏感性為94.7%，特異性為80%，兩者方法檢測基因突變的Kappa值為0.713，小于0.75，大于0.4，故而可認為兩種檢測方法的檢測結果具有中度一致性。見表9所示。

圖8 KatG315位點HRM分析曲線圖Fig.8 HRM analysis of KatG315 locus

圖9 inhA-15位點HRM分析曲線圖Fig.9 HRM analysis of inhA-15 locus

3.3 評估高分辨率溶解曲線(HRM)檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的應用價值 以HRM檢測到突變?yōu)榫昴退幍呐袛鄻藴?，以比例法藥敏結果為參照，HRM檢測結果顯示，檢出24株發(fā)生了基因突變，包括19株耐藥株和5株敏感株；25株未發(fā)生基因的突變，包括24株敏感株和1株耐藥株。

經(jīng)卡方檢測分析， HRM檢測的敏感性為95%，特異性為82.76%，異煙肼耐藥檢測的Kappa值為0.754，大于0.75，故而可認為兩種檢測方法的檢測結果具有高度一致性。見表10所示。

表9 HRM檢測基因突變的效率
Tab.9 HRM detection efficiency of genetic mutations

HRMThesequencingresultsMutationNoTotalSensitivitySpecificityPositivepredictiveNegativepredictiveKappaMutation1862494.7%80%75%96%0.713No12425Total193049

表10 HRM檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的效率
Tab.10 HRM detection efficiency of isoniazid-resistance

4 討 論

我國是WHO認定的27個耐多藥/廣泛耐藥結核病高負擔國家之一?；瘜W療法是控制結核病流行的主要方法，在結核病治療中發(fā)揮著重要作用，但由于不規(guī)范的治療、導致耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)。由于人口流動性增大及艾滋病流行等因素的影響，耐多藥及廣泛耐藥性結核病的感染人數(shù)越來越多。使結核桿菌耐藥株流行趨勢不斷上升，導致結核病的防控面臨巨大挑戰(zhàn)[8]，嚴重威脅人類的生命健康。異煙肼是酰肼類化學合成藥物，其作用主要是通過抑制結核桿菌分枝菌酸的生物合成，造成細胞壁破損而起到抑菌作用。作為有效的抗菌藥物，異煙肼不僅對結核桿菌有抑制作用，對溶血性鏈球菌、肺炎球菌、沙門氏菌、流行性感冒病毒等都有抵抗作用[9]。該藥除了做為抗結核病的首選藥物外，在治療百日咳、急性痢疾、腸炎、麥粒腫、沙門氏菌感染、上呼吸道病毒感染、多發(fā)性硬化的動作性震顫、白癜風、甚至遺傳性舞蹈病方面都有明顯療效，從而使異煙肼的臨床使用范圍擴大，耐藥現(xiàn)象也越來越普遍[9]。異煙肼耐藥與其基因組中katG、inhA、kasA、oxy-ahpC、ndh、efpA、furA、iniA等基因突變有關[10]；其中50%～70%的結核桿菌異煙肼耐藥株katG基因存在突變，25%的的結核桿菌異煙肼耐藥株與inhA基因突變有關。katG基因編碼的產(chǎn)物是過氧化氫酶-過氧化物酶，其作用是活化異煙肼，使其發(fā)揮作用，當KatG基因發(fā)生突變以后，會導致過氧化氫酶活性的喪失，達不到活化異煙肼的作用，進而導致結核分枝桿菌對異煙肼產(chǎn)生耐藥性。而inhA基因是烯酰基還原酶編碼基因，編碼的產(chǎn)物烯酰基載體蛋白還原酶，是異煙肼的作用靶點，與結核分枝桿菌的耐藥性密切相關[11]?？傮w上，高達80%的結核桿菌異煙肼耐藥的耐藥相關基因突變發(fā)生在katG和inhA這兩個基因。

對于異煙肼耐藥結核病的診斷領域，傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基藥敏檢測法，由于耗時長，費用高，已不能滿足耐藥結核病早發(fā)現(xiàn)、早治療的迫切需求。由于結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的產(chǎn)生與異煙肼耐藥相關基因的突變存在直接的關系，因此，衍生出一些基因診斷方法。如：PCR-SSCP法、PCR-DNA測序法、PCR-基因芯片法、熒光PCR熔解曲線法等[12]。近十多年來，這些方法在結核桿菌異煙肼耐藥性檢測中起到了較好的輔助診斷作用；同時，在臨床應用實踐中也發(fā)現(xiàn)了不足之處。例如，PCR-SSCP法檢測雖然耗時短，但是其操作復雜，結果判讀容易受到電泳條件、以及凝膠染色條件的影響，而不易判斷，不易在基層推廣。PCR-DNA測序法雖然結果較準確，但DNA測序耗時長，費用高，不易在邊遠地區(qū)推廣。PCR-基因芯片法假陽性、假陰性影響其檢測結果，且儀器價格高，操作條件要求較高，推廣受限[13]。

本實驗使用的方法高分辨率熔解曲線法，是在對異煙肼耐藥相關基因突變進行DNA測序檢測的基礎上，針對耐藥突變發(fā)生頻率最高的部位設計高分辨率熔解曲線檢測基因突變的特異性引物，對實驗菌株進行HRM檢測。

分析DNA測序結果發(fā)現(xiàn)，katG基因出現(xiàn)最多的突變是234位、315位、463位，而65%的異煙肼耐藥與KatG315位點的突變有關。40%的異煙肼耐藥株與inhA基因的突變有關，inhA基因出現(xiàn)最多的突變?yōu)?15位。用DNA測序方法分析菌株異煙肼耐藥性，結果顯示敏感性為95%、特異性為100%。雖然該方法檢測菌株耐藥性的敏感性及特異性較好，但這種方法耗時長，檢測費用大，尤其在邊遠地區(qū)不易推廣使用。以DNA測序結果為參照，用HRM檢測結核分枝桿菌基因突變的敏感性為94.7%、特異性為80%。分析其特異性較低的原因，主要與檢測過程中假陽性結果的增多有關，這可能是因為熒光熔解曲線檢測技術本身很靈敏，假陽性的出現(xiàn)可能與實驗操作過程存在一定的關系。以比例法藥敏結果為參照，以HRM檢測到突變?yōu)榫昴退幍呐袛鄻藴?，HRM檢測菌株異煙肼耐藥的敏感性為95%；特異性為82.76%。通過HRM方法獲得的結果直觀，易于判斷；耗材便宜，耗時短，在獲得結核分枝桿菌臨床分離株的基礎上，只需2～3 d即可獲得菌株耐藥性信息，而傳統(tǒng)的比例法藥敏實驗獲得菌株耐藥信息至少需要一個月的時間，所以在一定程度上對結核桿菌異煙肼耐藥性檢測起到較好的輔助診斷作用。但katG基因和inhA基因之外的其他基因突變導致的異煙肼耐藥，可能是影響HRM檢測敏感性的主要原因。另外，katG基因和inhA基因中異煙肼耐藥突變熱點區(qū)的同義突變，可能是影響HRM檢測特異性的主要原因。

總的來說，高分辨率熔解曲線分析技術與傳統(tǒng)的藥敏實驗相比，在結核分枝桿菌異煙肼耐藥性檢測中可作為較好的輔助診斷，可盡快為設計耐藥結核病的臨床治療方案提供依據(jù)。

[1] Hua CL,Song XH,Ping JZ,et al. The research of drug resistance ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Chin J Disinfect,2013,30(7): 626-627. (in Chinese)

花春玲,孫曉穗,平靜珍,等. 結核分枝桿菌的耐藥性研究[J]. 中國消毒學雜志,2013,30(7)：626-627.

[2] The survey technical steering group of National tuberculosis epidemiological sampling. The National tuberculosis epidemiological sampling survey report in the year 2000[J]. Chin J Prey Phthisiol,2002,24(2): 65-108. (in Chinese)

全國結核病流行病學抽樣調(diào)查技術指導組. 2000年全國結核病流行病學抽樣調(diào)查報告[J]. 中國防癆雜志,2002,24(2):65-108.

[3] Danaviah S,Sacks JA,Kumar KP,et al. Immunohistological characterization of spinal TB granulomas from HIV-negative and-positive patients[J]. Tuberculosis,2013,93(4): 432-441.

[4] Viader-Salvadó JM,Luna-Aguirre CM,Reyes-Ruiz JM,et al. Frequency of mutations inrpoBand codons 315 and 463 of katG in rifampin-and/or isoniazid-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from northeast Mexico[J]. Microbial Drug Resist,2003,9(1): 33-38.

[5] Fan HY,Zhang H,Li AY. The technology research progress ofMycobacteriumtuberculosisdrug resistance of formation mechanism and drug sensitivity testing technology about isoniazid and rifampicin[J]. Hebei Med J,2009,31(8): 999-1001. (in Chinese)

范懷玉,張宏,李愛英. 結核分枝桿菌對異煙肼和利福平的耐藥性形成機制及藥物敏感性檢測技術研究進展[J]. 河北醫(yī)藥,2009,31(8):999-1001.

[6] Wiedemann B,Heisig A,Heisig P. Uncomplicated urinary tract infections and antibiotic resistance—epidemiological and mechanistic aspects[J]. Antibiotics,2014,3(3): 341-352.

[7] Scarpellini P,Carrera P,Cichero P,et al. Detection of resistance to isoniazid by denaturing gradient-gel electrophoresis DNA sequencing inMycobacteriumtuberculosisclinical isolates[J]. New Microbiologica,2003,26(4): 345-351.

[8] Rong QJ,Lyu HX,Song AH. Rapid detection onkatGgene mutation ofMycobacteriumtuberculosisusing genetic microarray and the correlation between mutation and isoniazid resistance[J]. Chin J Zoonoses,2011,27(3): 233-237. (in Chinese)

戎奇吉,呂火祥,孫愛華. 基因芯片快速檢測結核分枝桿菌katG基因突變及其與異煙肼耐藥相關性[J].中國人獸共患病學報,2011,27(3):233-237.

[9] Yan H,Zhang SB. Isoniazid clinical new uses[J]. Heilongjiang Med,1991(3): 44-45. (in Chinese)

延紅,張樹本. 異煙肼臨床新用途[J].黑龍江醫(yī)學,1991(3):44-45.

[10] Wang HY,Liu ZM,Zheng JL,et al. Research of the relationship between isonazid-resistance andKatGgene change[J]. Qilu J Med Lab Sci,2005,16(5): 31-33. (in Chinese)

王海英,劉志敏,鄭建禮,等. 結核桿菌異煙肼表型耐藥與katG基因突變相關性研究[J]. 齊魯醫(yī)學檢驗; 2005,16(5):31-33.

[11] Marahatta SB,Gautam S,Dhital S,et al. katG (SER 315 THR) gene mutation in isoniazid resistantMycobacteriumtuberculosis[J]. Kathmandu Univ Med J,2011,9(33): 19-23.

[12] Gupta A,Prakash P,Singh SK,et al. Rapid genotypic detection of rpoB andkatGgene mutations inMycobacteriumtuberculosisclinical isolates from Northern India as determined by MAS-PCR[J]. J Clin Lab Analysis,2013,27(1): 31-37.

[13] Yang L,Ming-Quan SU,Cheng XD,et al. Study on rapid detection ofkatG,rpoB,rpsLgenomic mutations ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Chin J Hlth Lab Technol,2009.

Rapid detection of isoniazid resistance in clinicalMycobacteriumtuberculosisisolates by high-resolution melting curve analysis

YANG Cai-hong1,YANG Min2,YU Lu3,BAO Hai-yang1, WU Chang-xin3,CAO Xu-dong3,CHEN Chuang-fu1

(1.SchoolofAnimalSciencesandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China; 2.SchoolofLifeScience,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China; 3.MedicalSchool,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China)

We detected the isoniazid resistance in clinicalMycobacteriumtuberculosisisolates by high-resolution melting (HRM) curve analysis and assessed the application value of the assay. The isoniazid resistance of 49M.tuberculosisisolates preserved in laboratory was analyzed by the drug sensitivity test (traditional proportion method). Further analysis was made on the sequencing of the isoniazid resistance determining region in these test strains,and their mutation sites were screened. Specific primers used in the HRM curve analysis were designed based on the screened mutation sites,DNA mutations were assayed in the isoniazid-resistant gene determining region by the HRM curve analysis,and an assessment was made of the detection efficiency of the assay in isoniazid resistance inM.tuberculosis. Results of the drug sensitivity test (proportion method) showed that,of the 49 test strains,there were 20 isoniazid-resistant strains,29 isoniazid-sensitive strains. Results of the sequencing analysis showed that: 1)KatGgene had four mutation patterns,i.e.,point mutations at site 234,at sites 234 and 315,at sites 234 and 463,and at sites 234,315 and 463; 2) there were three mutations were detected ininhAgene,i.e.,mutations in inhA-8,-15 and-152. Analysis of gene mutation in drug-resistant strains found that of the 20 isoniazid-resistant strains,11 (55%) were mutated at codon 315 ofKatGgene; 6 (30%) were mutated ininhA-15 (4/20),-8 (1/20) and-153 (1/20) ofinhAgene; two (10%) were mutated at codon 315 ofKatGgene and ininhA-15; in one strain (5%),no mutation was detected inKatGandinhAgenes. Through the gene mutation detection,the sensitivity and specificity of isoniazid resistance inM.tuberculosiswere 95% and 100%,respectively. Results of HRM curve analysis of drug-resistance gene mutations in test strains showed gene mutations were present in 18 strains and absent in 24 ones; referring to DNA sequencing results,the sensitivity and specificity of the assay were 94.7% and 80%,respectively. Judged by mutations as drug-resistance via the HRM curve analysis,19 resistant and 24 sensitive strains were tested. With the drug sensitivity test results by the proportion method as controls,the sensitivity and specificity of the assay were 95% and 82.76%,respectively. Use of the HRM curve in the detection of resistance ofM.tuberculosisto isoniazid is characterized by good sensitivity and short time consuming,and has certain value in the rapid diagnosis of isoniazid-resistant tuberculosis.

Mycobacteriumtuberculosis; high-resolution melting (HRM) curve; DNA sequencing; drug resistance; isoniazid

Chen Chuang-fu,Email: ccf-xb@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.05.004

“十二五”國家科技重大專項(No.2013ZX10003003-002),國家自然科學基金項目(No.31060333)

陳創(chuàng)夫，Email:ccf-xb@163.com；

1.石河子大學動物科技學院，石河子 832003； 2.石河子大學生命科學學院，石河子 832003; 3.石河子大學醫(yī)學院，石河子 832002

S855.2

A

1002-2694(2017)05-0403-10

2016-07-25 編輯：劉岱偉

Supported by the National Science and Technology Major Project of the 12th Five-Year Plan: "Prevention and Control of Severe Infectious Diseases Like AIDS and Viral Hepatitis" (No. 2013ZX10003003-002) and the National Natural Science Foundation of China (No. 31060333)