清腦和血方治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的藥效作用及其初步機制研究

徐燕芳 卞銀燕 王天游 俞文華 董曉巧

清腦和血方治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的藥效作用及其初步機制研究

徐燕芳1卞銀燕2王天游2俞文華3董曉巧3

目的觀察清腦和血方對大鼠腦膠質(zhì)瘤的藥效作用，并初步探討其作用機制。方法Wistar大鼠45只，采用腦立體定位注射鼠源性C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞（C6細(xì)胞）建立大鼠膠質(zhì)瘤模型；將成模大鼠隨機分為模型組、順鉑組、清腦和血方組，每組10只；另設(shè)10只大鼠為空白對照組。連續(xù)給藥25天，檢測各組大鼠血清白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-10、腫瘤壞死因子（TNF）-α、干擾素（IFN）-γ水平；依次剝離腦組織與膠質(zhì)瘤組織，稱重，計算瘤重占腦組織重百分比；HE染色觀察膠質(zhì)瘤組織病理；免疫印跡法檢測膠質(zhì)瘤組織中環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的表達情況。結(jié)果與模型組比較，清腦和血方組大鼠的瘤重[（0.0121±0.0050）g比（0.0779±0.0390）g]、瘤重占腦組織重百分比[（0.49±0.0075）%比（3.07±0.0176）%]、血清中IL-2[（91.14±10.33）pg/mL比（160.42±15.98）pg/mL]、IL-10[（49.58±6.79）pg/mL比（92.17±7.71）pg/mL]含量均明顯降低（P＜0.01）；血清IFN-γ[（198.54± 11.83）pg/mL比（111.53±17.50）pg/mL]、TNF-α[（209.41±21.82）pg/mL比（119.00±20.21）pg/mL]含量明顯升高（P＜0.01）。結(jié)論清腦和血方能夠明顯抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的顱內(nèi)生長，其作用機制可能與調(diào)節(jié)機體免疫因子水平，抑制腫瘤相關(guān)蛋白CREB的表達有關(guān)。

大鼠；腦膠質(zhì)瘤；清腦和血方；C6細(xì)胞；CREB

腦膠質(zhì)瘤是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，多呈浸潤性生長和惡性病變，手術(shù)難以根除，治療十分困難[1]。惡性腦膠質(zhì)瘤病死率位居所有腫瘤第三位，其平均存活時間僅為36～48周，兩年生存率為8%～12%[2]，5年內(nèi)生存率不足5%[3-4]。目前腦膠質(zhì)瘤的臨床治療以手術(shù)切除為主，輔以化療、放療、免疫及基因治療等綜合治療，但治療效果仍不理想。化療是腦膠質(zhì)瘤治療的重要方法之一，可以明顯提高患者的平均存活率并延長生存期[5-6]。烷化劑是腦膠質(zhì)瘤臨床應(yīng)用最廣泛的化療藥物，但由于其毒副反應(yīng)大，難以改善患者生存質(zhì)量，仍無法滿足臨床需求[7]。清腦和血方由筆者在臨床經(jīng)典方的應(yīng)用實踐中總結(jié)精煉而成，由桃核承氣湯合四物湯加天麻、蛇六谷、生山楂、蟬衣組成。體外實驗發(fā)現(xiàn)該方對鼠源性C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞有一定抑制作用，但該方的體內(nèi)實驗尚未見報道。本實驗擬采用腦立體定位注射法建立大鼠膠質(zhì)瘤模型，對清腦和血方抗膠質(zhì)瘤的藥效作用及其機制進行初步探討，旨在為清腦和血方的臨床推廣提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物與細(xì)胞健康SPF級雄性Wistar大鼠45只，體質(zhì)量（190±10）g，購于上海西普爾必凱實驗動物有限責(zé)任公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2013-0016；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心屏障系統(tǒng)內(nèi)，動物使用SYXK許可證號為（浙）2013-0184。室溫（23±2）℃，相對濕度60%～70%，12h光照，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)普通飼料喂食。鼠源性C6細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑中藥均購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠；順鉑（江蘇豪森，批號150503）；DMEM培基（Hyclone，批號NAG7440）；CREB抗體（Abcam，批號GR50483-33）；IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α ELISA試劑盒（杭州樂峰生物科技有限公司，批號CK-E306 35R）。

1.3 儀器腦立體定向儀（美國Stoelting）；微量注射器（瑞士Hamilton）；血球計數(shù)板（德國Marienfeld）；低溫高速離心機（美國Beckman），AP280組織包埋機（德國Microm），HM 335E型輪轉(zhuǎn)切片機（德國Microm），自動染色機（德國Leica），DMI 3000B顯微鏡（德國Leica），電泳儀（美國Bio-rad）。

2 實驗方法

2.1 藥物制備清腦和血方藥物組成：桃仁15g，桂枝6g，制大黃15g，芒硝、生草各6g，當(dāng)歸15g，赤芍20g，川芎10g，生地40g，天麻9g，蛇六谷15g，生山楂30g，蟬衣6g。按上述比例配制，加10倍量水提取2次，每次1.5h，合并兩次藥液后旋蒸濃縮，得到浸膏，使用前加水配置，濃度為折合生藥量4.1g/mL。

2.2 C6細(xì)胞準(zhǔn)備C6細(xì)胞復(fù)蘇后，在接種前至少傳代1次，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時（2/3培養(yǎng)瓶底長滿）收集細(xì)胞（于收集細(xì)胞前24h更換培養(yǎng)液）。收集細(xì)胞時用0.01mol/L PBS洗滌1次，再用0.25%胰酶消化，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞收縮變圓，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，再加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，800r/min離心4min，血球計數(shù)制備2.5×107/mL細(xì)胞懸液，備用。

2.3 模型構(gòu)建Wistar大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉后，固定于大鼠腦立體定向儀，頭部固定于立體定向架，剪去頭頂部毛發(fā)并消毒種植部位。確定接種靶點后打開顱骨，用25μL微量注射器接種混勻的細(xì)胞懸液（2.5×107/mL，2.5×105個細(xì)胞/只，體積10μL），硬膜下進針3mm，退1mm，顱內(nèi)注射速度為2μL/min，注射完畢留針5min后再拔針。骨孔用骨蠟封閉，縫合傷口，單籠飼養(yǎng)。

2.4 動物分組與給藥45只雄性Wistar大鼠，分為空白對照組10只，造模組35只，造模組按照2.2與2.3中方法構(gòu)建大鼠膠質(zhì)瘤模型，造模過程中大鼠共死亡5只。將造模成功的30只大鼠隨機分為模型對照組、順鉑組、清腦和血方組，每組10只。術(shù)后第3天開始給予藥物干預(yù)：順鉑組腹腔注射順鉑稀釋液0.2mL/只,劑量為1mg/（kg·d），清腦和血方組灌胃清腦和血湯劑1mL/100g,劑量為4.1g/（kg·d），模型對照組與空白對照組灌胃等量生理鹽水，均連續(xù)給藥25天。

2.5 觀察指標(biāo)（1）一般體征觀察：術(shù)后每天觀察各組大鼠的一般情況，每周測量大鼠體質(zhì)量并記錄。（2）術(shù)后存活率記錄：觀察并記錄各組大鼠28天內(nèi)存活情況。（3）瘤重與瘤重占腦重百分比測定：給藥期間大鼠有死亡征兆或已經(jīng)死亡時，取血，并立即取出全腦，稱重；剝離瘤組織，再稱重；28天后，麻醉處死所有大鼠，同樣進行上述操作，測定各組大鼠的瘤重與瘤重占腦重百分比。（4）血清炎性因子表達檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）檢測各組大鼠血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ含量，操作步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明進行。（5）腫瘤組織病理檢測：每組取部分大鼠的全腦組織，置于10%中性甲醛中，石蠟包埋后切成3～5μm的切片，經(jīng)HE染色在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織病理變化情況。（6）腫瘤組織CR-EB表達檢測：采用Western Blot法檢測，每組取部分大鼠的腫瘤組織，空白對照組取部分腦組織，提取總蛋白，進行蛋白定量，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，進行免疫反應(yīng)，掃膜，曝光。

表1 四組膠質(zhì)瘤大鼠體質(zhì)量比較（g，）

表1 四組膠質(zhì)瘤大鼠體質(zhì)量比較（g，）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05

組別空白對照組模型組順鉑組清腦和血方組鼠數(shù)10 10 10 10 0天236.1±6.1 238.5±5.2 239.9±8.2 235.5±9.5 7天260.25±9.7 270.1±7.2 266.2±5.1 269.9±9.2 14天284.4±9.7 268.8±30.1* 282.7±10.4 288.8±11.3 21天293.7±14.7 258.1±38.7* 241.4±14.9** 272.9±21.9 28天301.4±16.2 246.3±27.2** / 280.0±27.6△

3 實驗結(jié)果

3.1 清腦和血方對膠質(zhì)瘤大鼠一般體征的影響空白對照組大鼠精神狀況良好，毛發(fā)有光澤，行動自如、反應(yīng)靈敏、抓惹激怒程度尚可，無明顯豎毛，拱背，蜷縮現(xiàn)象，兩便正常；其余各組大鼠反應(yīng)逐漸變得遲鈍、倦怠，活動減少，抓惹激怒程度明顯不及空白對照組，毛發(fā)雜亂泛黃無光澤，且豎毛，拱背，蜷縮現(xiàn)象較為明顯，尿量少，大便稀，術(shù)后精神萎靡。術(shù)后7天開始，各組大鼠生存狀態(tài)逐漸變差，并逐漸出現(xiàn)不同程度的偏癱或癱瘓，嚴(yán)重程度模型組>順鉑組>清腦和血方組。

術(shù)前各組大鼠體質(zhì)量無顯著差異；術(shù)后14天，模型組大鼠體質(zhì)量顯著輕于空白對照組（P＜0.05），并持續(xù)到28天。術(shù)后21天，與模型組比較，順鉑組大鼠體質(zhì)量無顯著差異（P>0.05）；與空白對照組比較，順鉑組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01），狀態(tài)極差被處死。術(shù)后28天，與模型組比較，清腦和血方組大鼠體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05），且與空白對照組比較，體質(zhì)量無顯著差異（P>0.05）。見表1。

3.2 清腦和血方對膠質(zhì)瘤大鼠術(shù)后存活率的影響術(shù)后28天內(nèi)，空白對照組大鼠生長良好，無死亡情況；模型組大鼠死亡7只，清腦和血方組死亡5只；順鉑組術(shù)后21天內(nèi)已死亡7只，第21天余下3只狀態(tài)極差，當(dāng)即處死。

3.3 清腦和血方對膠質(zhì)瘤大鼠瘤重和瘤重占腦重百分比的影響與模型組比較，順鉑組大鼠瘤重、瘤重占腦重百分比無顯著差異（P>0.05），清腦和血組大鼠瘤重、瘤重占腦重百分比均顯著降低（P＜0.01）。見表2。

表2 清腦和血方對膠質(zhì)瘤大鼠瘤重、瘤重占腦重百分比比較（）

表2 清腦和血方對膠質(zhì)瘤大鼠瘤重、瘤重占腦重百分比比較（）

注：與模型組比較，△P＜0.01

組別空白對照組模型組順鉑組清腦和血方組鼠數(shù)10 10 10 10瘤重（g）0 0.0779±0.0390 0.0525±0.0370 0.0121±0.0050△瘤重占腦重百分比（%）0 3.07±0.0176 2.80±0.0202 0.49±0.0075△

3.4 清腦和血方對膠質(zhì)瘤大鼠血清IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α含量的影響與空白對照組比較，其余各組大鼠血清IL-2、IL-10含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），IFN-γ和TNF-α含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，清腦和血方組和順鉑組的IL-2、IL-10含量均顯著降低（P＜0.01），IFN-γ、TNF-α含量均顯著升高（P＜0.01）；且清腦和血方組的效果優(yōu)于順鉑組（P＜0.05）。見表3。

3.5 清腦和血方對膠質(zhì)瘤大鼠腦組織病理的影響

模型組瘤體積最大，浸潤至皮層最為明顯；清腦和血方組瘤體積變小，且顏色變淺，界線模糊，可見清腦和血方對抑制膠質(zhì)瘤生長有一定作用。順鉑組膠質(zhì)瘤浸潤至皮層仍然較為明顯。見圖1（插頁）。

表3 四組膠質(zhì)瘤大鼠血清IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α含量比較（pg/mL）

表3 四組膠質(zhì)瘤大鼠血清IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α含量比較（pg/mL）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與順鉑組比較，#P<0.05

組別空白對照組模型組順鉑組清腦和血方組鼠數(shù)10 8 7 8 IL-2 70.94±10.45 160.42±15.98** 114.92±9.72△91.14±10.33△#IL-10 30.89±5.88 92.17±7.71** 62.28±4.23△49.58±6.79△#IFN-γ 218.96±20.07 111.53±17.50** 173.76±10.62△198.54±11.83△#TNF-α 281.16±40.22 119.00±20.21** 195.82±12.87△209.41±21.82△#

3.6 清腦和血方對膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤組織環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding p-rotein，CREB）表達的影響Western Blot結(jié)果顯示，空白對照組大鼠腦組織中CREB呈一定水平量表達，與空白對照組的（5.05±0.58）%比較，模型組為（11.40±1.37）%、順鉑組為（11.35±1.18）%、清腦和血方組為（10.75±0.52）%，腫瘤組織中CREB的表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，順鉑組腫瘤組織中CREB的表達水平無明顯變化，清腦和血方組腫瘤組織中CREB的表達水平略有降低。見圖2（插頁）。

4 討論

腦膠質(zhì)瘤亦稱神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，由神經(jīng)上皮組織衍化而來，具有發(fā)病率高、病死率高、治愈率低的特點。腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，占腦內(nèi)腫瘤的40%～50%[8]。2012年，中國腫瘤登記報告[5]指出中國腦及中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤死亡率為3.87/10萬，位列十大高病死率腫瘤之第9位。手術(shù)切除是當(dāng)前最主要的臨床治療手段。但是由于該腫瘤惡性程度高，其生長常以單個瘤細(xì)胞的侵襲和局部浸潤為主，因此使得瘤組織和周邊正常腦組織界線模糊，手術(shù)中難以區(qū)分從而不能完全切除，術(shù)后易復(fù)發(fā)[9]?；熓悄X膠質(zhì)瘤治療的重要手段之一，可以明顯提高患者的生存狀態(tài)，并延長生命周期[10]。由于腫瘤周邊血腦屏障以及血瘤屏障的存在，常規(guī)水溶性化療藥物療效受到限制，并且隨著化療藥物劑量的增大，常出現(xiàn)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)甚至全身毒副作用。

中醫(yī)以整體觀念，辨證論治，調(diào)動患者自身的調(diào)節(jié)機制，以達治愈疾病的目的[11]。清腦和血方是本課題組成員在臨床經(jīng)典方的應(yīng)用實踐中總結(jié)精煉而成的經(jīng)驗方，由桃核承氣湯合四物湯加天麻、蛇六谷、生山楂、蟬衣而成。桃核承氣湯出自張仲景《傷寒論》，原治下焦蓄血證，腦瘤用之，是取上病則取其下之意。補血名方四物湯養(yǎng)血和血，可逐血痹，善治營血虧虛、血行不暢等證。桃核承氣湯與四物湯二方合用，可下腦絡(luò)之瘀毒，且攻邪不傷正，更有攻補兼施之妙。加上天麻、蛇六谷、生山楂、蟬衣，諸藥合用，以養(yǎng)血和血、平肝通絡(luò)、逐瘀抗癌。本實驗采用Wistar大鼠建立腦膠質(zhì)瘤模型，對大鼠進行給藥干預(yù)后，觀察大鼠情況，從而探討清腦和血方對腦膠質(zhì)瘤的抑制作用。

實驗結(jié)果表明，造模后，與空白對照組大鼠比較，模型組大鼠體征狀態(tài)最差，體質(zhì)量持續(xù)減輕、死亡率高；瘤量和瘤重占腦重百分比最大，體積最大，腫瘤浸潤皮層最嚴(yán)重；血清IL-2、IL-10含量顯著升高，IFN-γ和TNF-α含量顯著降低（P<0.01）；腫瘤組織中CREB表達水平顯著升高。順鉑組大鼠體征狀態(tài)較差，死亡率最高（P<0.01），瘤重和瘤重占腦重百分比無明顯變化，腫瘤浸潤皮層仍較嚴(yán)重；腫瘤組織中CREB的表達水平無明顯變化，血清IL-2、IL-10含量顯著降低，IFN-γ和TNF-α含量顯著升高。而給予清腦和血方干預(yù)后，大鼠體征狀態(tài)改善，體質(zhì)量略有增加，生命周期略有延長，瘤重與瘤重占腦重百分比均顯著降低，腫瘤浸潤皮層明顯減輕，與模型組比較，血清IL-2、IL-10含量顯著降低，IFN-γ和TNF-α含量顯著升高，腫瘤組織中CREB的表達水平略有降低。

近年研究[12-13]顯示，環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CREB可以與CRE基因特異性結(jié)合，結(jié)合后CRE的下游基因轉(zhuǎn)錄活性會大大提高，并且它可以通過cAMP信號通路、Ca2+-Ca-MK、RAS/ERK、PI3K/AKt等多種磷酸化信號通路實現(xiàn)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的功能。CREB的這種活性在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用。鄭克彬等[14]臨床試驗顯示，CREB在不同分化程度的腦膠質(zhì)瘤組織中均存在過表達現(xiàn)象，與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)，腫瘤惡性程度越高，CREB的相對表達量也就越高，提示CREB參與腫瘤的進展。本實驗結(jié)果與該研究相吻合，模型組大鼠腫瘤組織中CREB明顯高表達，而給予清腦和血方干預(yù)后，CREB的表達水平略有降低。

因順鉑不易透過血腦屏障，故順鉑并未對膠質(zhì)瘤顯示出較好的藥效作用，如若使用臨床一線的膠質(zhì)瘤化療藥物替莫唑胺，實驗結(jié)果將更具說服力，故陽性藥物的選擇是本實驗的不足之處。

綜上所述，清腦和血方能夠明顯抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的顱內(nèi)生長，改善大鼠體征狀態(tài)，其作用機制可能與調(diào)節(jié)機體免疫因子水平、抑制腫瘤相關(guān)蛋白CREB的表達有關(guān)。

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（收稿：2016-12-03修回：2017-01-16）

Therapeutic Effects of QingnaoHexue Formula on Treatment of Glioma in Rats and Its Preliminary Mechanism

XU Yanfang1,BIAN Yinyan2,WANG Tianyou2,YU Wenhua3,DONG Xiaoqiao3.
1 The First Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of Internal Medicine, Lin'an Hospital of TCM,Lin'an(311300),China;3 Department of Neurosurgery,Hangzhou First People's Hospital, Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effects of QingnaoHexueformula（QNHXf）on rat glioma and to discuss the preliminary mechanism.MethodsC6 glioma cells was injected into Wistar rat brain with stereotaxic technique to build rat glioma model,then the model rats were randomly divided into 3 groups:model group,cisplatin group,and QNHXf group,with 10 rats in each group;another 10 healthy Wistar rats served as control group.The drugs were continuously dosing for 25days,then the rats were sacrificed to obtain brain tissue and the tumor and the blood samples. The brain tissue and tumor tissue were weighted for calculation of the ratio of tumor weight to brain weight and were observed for pathological changes with HE staining and the expression of CREB in tumor tissue with Western blot;the blood samples were used to detect the levels of IL-2,IL-10,TNF-α,and IFN-γ.ResultsThe tumor weight（0.0121± 0.0050g）,the ration of tumor weight to brain weight（0.49%±0.0075%）,the serumlevel of IL-2（91.14±10.33pg/mL）, IL-10（49.58±6.79pg/mL）in QNHXf groupwere significantlylower than those in model group（0.0779±0.0390g,3.70% ±0.0176%,160.42±15.98pg/mL,92.17±7.71pg/mL,all P<0.05）,while the serum level ofIFN-γ（198.54±11.83pg/mL）and TNF-α（209.41±21.82pg/mL）were significantly higher（111.53±17.50pg/mL,119.00±20.21pg/mL;all P<0.01）.ConclusionQNHXf can inhibit the growth of C6 glioma cells in the brain of rats.Its mechanism may be related to regulating immunologic factorsand inhibiting the expression of tumor associated protein CREB.

rats;glioma;QingnaoHexueformula;C6 cell;CERB

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2013ZB098）；浙江省自然科學(xué)基金（No.Y17H270003）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（杭州310053）；2浙江省臨安市中醫(yī)院內(nèi)科（臨安311300）；3杭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科（杭州310006）

董曉巧，Tel：13588172841；E-mail：dxqhyy@163.com