前列腺癌組織緊密連接蛋白-4表達及與生化復(fù)發(fā)的關(guān)系

張春霆 劉全啟 徐禮臻 余謙 羅榮利 陳良佑 楊慶 朱再生

前列腺癌組織緊密連接蛋白-4表達及與生化復(fù)發(fā)的關(guān)系

張春霆 劉全啟 徐禮臻 余謙 羅榮利 陳良佑 楊慶 朱再生

目的探討緊密連接蛋白-4（Claudin-4）在前列腺癌中的表達及與前列腺癌生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。方法應(yīng)用S-P法檢測79例前列腺癌和45例前列腺增生組織Claudin-4表達狀況，分析其與前列腺癌臨床病理特點之間的關(guān)系，對前列腺癌隨診結(jié)果采用Kaplan-Meier生存分析5年前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)與Claudin-4表達之間的關(guān)系；結(jié)果前列腺癌組織和前列腺增生組織Claudin-4表達陽性率分別為64.56%（51/79）和33.33%（15/45），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.01）。Claudin-4陽性表達在前列腺癌TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期分別為46.34%和84.21%，在Gleason評分＜7分≥7分患者分別為57.14%和72.97%，兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。隨訪60個月內(nèi)生化復(fù)發(fā)45例，復(fù)發(fā)率為56.96%，生化復(fù)發(fā)的患者中Claudin-4表達陽性39例，Claudin-4表達陰性6例，兩組間生化復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計意義（P<0.01）。前列腺癌患者PSA結(jié)果進行Kaplan-Meier生存分析顯示Claudin-4陽性患者5年生化復(fù)發(fā)率高于陰性表達患者。結(jié)論前列腺癌組織Claudin-4表達增高，其異常表達與前列腺癌臨床分期和Gleason評分及5年生化復(fù)發(fā)相關(guān)，聯(lián)合檢測Claudin-4可能有助于前列腺癌預(yù)后評估。

前列腺癌；Claudin-4；免疫組化；生化復(fù)發(fā)

前列腺癌已成為危害我國男性健康的疾病之一，前列腺癌起病隱匿，病因未明，多種因素參與前列腺癌的發(fā)生進展。緊密連接蛋白-4（Claudin-4）在多種腫瘤組織中異常表達[1-4]，但在前列腺癌中的表達狀況及與前列腺癌生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系報道較少。本研究對Claudin-4在前列腺癌中的表達狀況及與前列腺癌臨床病理關(guān)系和5年生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料提取2005年1月—2015年8月浙江大學(xué)金華醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除或活檢證實的前列腺癌患者79例，年齡52～82歲，中位年齡68歲，平均病程（2.0±0.75）年。前列腺癌按照2002年AJCC的TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期38例。分化程度按照Gleason系統(tǒng)，所有病理標(biāo)本經(jīng)有經(jīng)驗的病理醫(yī)師再次證實。所提取的標(biāo)本收取前患者無內(nèi)分泌治療、放療及化療。收集同期前列腺增生患者45例，年齡51～83歲，中位年齡69歲，平均病程（2.0±0.5）年。兩組患者年齡、一般資料、病程無明顯差異，兩組資料有可比性（P>0.05）。

1.2 實驗方法采用Claudin-4兔抗人多克隆抗體和DAB顯色劑（均購自北京中杉金橋生物有限公司，批號140706）。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶染色法（S-P法）。嚴(yán)格按試劑盒說明書進行實驗，石蠟包埋標(biāo)本，3μm厚組織連續(xù)切片，抗原微波修復(fù)，過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶活性。依次加一抗（1：100工作濃度）、生物素標(biāo)記的二抗和酶標(biāo)鏈霉親和素，37℃孵育20min，DAB顯色，顯微鏡下觀察，以PBS液替代一抗作陰性對照，用已知Claudin-4陽性的前列腺癌切片作陽性對照。

1.3 結(jié)果判定所有結(jié)果均由兩位有經(jīng)驗病理醫(yī)師進行雙盲讀片顯示結(jié)果，所有切片進行染色細胞數(shù)和染色強度觀察，Claudin-4定位于細胞膜，陽性顆粒呈藍色。高倍鏡下染色強度和陽性細胞所占比例進行測定現(xiàn)陽性顆粒數(shù)目，5個高倍視野下染色細胞計數(shù)所占比例分為5級：<5%為0分，～25%為1分，～50%為2分，～75%為3分，>75%為4分。再按染色強度分為3級：弱染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分。每切片得分=染色細胞分?jǐn)?shù)×染色強度分?jǐn)?shù)，<2分為陰性，≥2分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計數(shù)資料率的比較采用χ2或fish確切概率法，隨訪臨床資料采用Kaplan-Meier生存分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Claudin-4表達Claudin-4主要分布在前列腺上皮細胞膜，在胞質(zhì)和胞核上表達少，見圖1（封二）。

2.2 Claudin-4蛋白表達與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系Claudin-4蛋白在前列腺癌中呈現(xiàn)高表達，在79例前列腺癌中Claudin-4蛋白陽性表達51例，陽性表達率為64.56%，在45例前列腺增生組織中陽性表達為15例，陽性率33.33%。Claudin-4蛋白表達陽性率與Gleason分級有關(guān)，在Gleason評分≤7分和＞7分患者中的陽性表達率分別為57.14%（24/ 42）和72.97%（27/37）；在前列腺癌TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者Claudin-4蛋白表達率分別為46.34%（19/41）和84.21%（32/38），Claudin-4蛋白表達隨著分化程度加深呈現(xiàn)表達率上升（P<0.05），見表l。

表1 79例前列腺癌患者Claudin-4表達與臨床病理及5年生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系（例）

2.3 Claudin-4蛋白表達與隨訪前列腺癌患者5年生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系79例前列腺癌患者60個月PSA隨訪中，60個月內(nèi)生化復(fù)發(fā)45例，復(fù)發(fā)率為56.96%，生化復(fù)發(fā)患者中Claudin-4表達陽性39例；Claudin-4表達陰性28例中60個月生化復(fù)發(fā)6例，生化復(fù)發(fā)率為21.43%，見表1。兩組間生化復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.007）。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果可見Claudin-4陽性表達的前列腺癌患者復(fù)發(fā)高于Claudin-4表達陰性者，見圖2（封二）。

3 討論

Claudins蛋白是構(gòu)成緊密連接的重要組成部分。Claudins在多種上皮來源的惡性腫瘤中存在異常表達，并且與這些腫瘤發(fā)生和發(fā)展以及生存率有關(guān)[5-7]。研究顯示，Claudins表達存在差異，Claudins家族中與腫瘤有關(guān)蛋白在同一組織中有的表達上調(diào)，有的則是表達下調(diào)或缺失，例如，Claudin-3和Claudin-4在卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌中呈現(xiàn)高表達，Claudin-7在乳腺癌和頭頸部腫瘤中表達下降，但是在胃癌中高表達[8-10]，我們前期基因篩查發(fā)現(xiàn)Claudin-4在前列腺癌中表達增高，因此，進一步研究它是否與前列腺癌發(fā)生、進展及臨床病理相關(guān)以及與前列腺癌5年生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。

本實驗中應(yīng)用免疫組化方法對前列腺癌Claudin-4表達狀況進行了研究，結(jié)果顯示，在前列腺癌中Claudin-4陽性表達率64.56%，在增生的前列腺組織中Claudin-4陽性表達率33.33%，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示Claudin-4在前列腺癌中異常表達可能與前列腺癌發(fā)生有關(guān)；國外研究[11]顯示，緊密連接蛋白在腫瘤中的作用使E-鈣黏蛋白表達減少，引起B(yǎng)-catenin在細胞內(nèi)聚集，B-catenin/Tif信號通路激活，導(dǎo)致腫瘤細胞黏附力下降，易脫離原發(fā)灶，致周圍間質(zhì)、血管、淋巴管及廣泛轉(zhuǎn)移。國內(nèi)張曉波等[12]對雄激素依賴性和非依賴性前列腺癌細胞差異表達膜蛋白表達差異進行了研究，對前列腺癌細胞株LNCaP和PC-3中膜蛋白進行Western印跡檢測、串聯(lián)質(zhì)譜分析等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Claudin-4在LNCaP和PC-3細胞存在明顯差異，陽性表達率分別為34.3%和72.4%，推測Claudin-4異常表達可能在雄激素非依賴性前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用；Meng等[13]對睪酮缺乏后小鼠前列腺內(nèi)免疫炎癥因子變化狀況與前列腺疾病進行研究，發(fā)現(xiàn)睪酮通過調(diào)節(jié)前列腺內(nèi)Claudin-4膜蛋白的表達，進而影響前列腺中炎癥因子繼發(fā)的前列腺疾病，包括前列腺癌；但是在前列腺癌中Claudin-4是否存在上述機制，Claudin-4蛋白表達增高如何參與前列腺癌發(fā)生進展以及轉(zhuǎn)移的過程，尚無充分的證據(jù)報道。

本研究還對前列腺癌分化程度和臨床分期與Claudin-4蛋白陽性表達之間的關(guān)系進行比較，發(fā)現(xiàn)在Gleason評分＜7分和≥7分患者中Claudin-4蛋白陽性表達率分別為57.14%（24/42）和72.97%（27/ 37），在前列腺癌Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期Claudin-4蛋白表達率分別為46.34%（19/41）和84.21%（32/38），表明它的異常表達可能參與了前列腺癌的進展和異常分化；文獻報道中對卵巢癌研究中發(fā)現(xiàn)Claudin-4轉(zhuǎn)錄因子通過甲基化調(diào)節(jié)減低組蛋白酶H3乙?；饔茫墒菇M蛋白酶H3失活，促進腫瘤進展[14]。Claudin-4也可經(jīng)蛋白激酶PKC8作用于189蘇氨酸／194絲氨酸位點，使其發(fā)生磷酸化作用而表達下降，并由細胞膜轉(zhuǎn)至細胞漿。使得緊密連接蛋白出現(xiàn)松散破壞[15]。因此推測前列腺癌進展中Claudin-4異常表達可能經(jīng)多種調(diào)節(jié)途徑，引起緊密連接骨架蛋白結(jié)構(gòu)破壞，細胞極性和滲透性改變，瘤細胞侵襲力增加，促進腫瘤進展。

本研究發(fā)現(xiàn)Claudin-4異常表達與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，隨訪中C1audin-4陽性表達與前列腺癌5年生化復(fù)發(fā)之間存在相關(guān)性，但是Claudin-4在前列腺癌發(fā)生進展中確切的作用機制以及以哪種作用方式參與了前列腺癌的發(fā)生進展，尚需要進一步研究。

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（收稿：2016-06-22修回：2016-11-03）

Relationships of Expressionof Claudin-4 and Biochemical Recurrence in Prostate Cancer

ZHANG Chunting, LIU Quanqi,XU Lizhen,YU Qian,LUO Rongli,CHEN Liangyou,YANG Qing,ZHU Zaisheng.Department of Urology,Zhejiang University Jinhua Hospital,Jinhua(321000),China

ObjectiveTo investigate the expression of Claudin-4 in prostate cancer tissue and its relationship with biochemical recurrence of prostate cancer.MethodsS-P method was used to detect the expression of Claudin-4 in 79 cases with prostate cancer and 45 cases with benign prostatic hyperplasia,then the relationship between its expression withthe clinical and pathological features was analyzed.Kaplan-Meier survival analysis was used to analyze 5-year biochemical recurrence in patients and the follow-up results was assessed with the expression of Claudin-4.ResultsThe positive rate of Claudin-4 expression in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia was64.56%（51/79）and 33.33%（15/45）,respectively,with a significant different between them（P<0.01）.The positive expression rates of Claudin-4 in tissues at TNM stage I～II and III～IV were 46.34%and 84.21%and intissues from the Gleason score<7 and≥7 were 57.14%and 72.97%,both with a significant difference（P<0.05）.In a follow-up of 60 months,45 cases hadbiochemical recurrence,with a recurrence rate of 56.96%;among them,39 cases had positive expression of Claudin-4,4 cases with negative Claudin-4 expression;the difference in recurrence rate was statistically significant（P<0.01）.Kaplan-Meier survival analysis showed that Claudin-4-positive expression patients had a higher 5-year biochemical recurrence rate than patients with Claudin-4 negative expression.Conclusion

Claudin-4 expression was increased in prostate cancer,the increase was related to the clinical stage and Gleason score and biochemical recurrence of prostate cancer.Detection of Claudin-4 may contribute to prognosis of prostate cancer.

prostate cancer;Claudin-4;immunohistochemistry;biochemical recurrence

浙江省金華市科技計劃項目（No.2013-3-043）

浙江大學(xué)金華醫(yī)院泌尿外科（金華321000）

朱再生，Tel：18267028028；E-mail：zaishengzhu@126.corn