基于GC-MS的灰葡萄孢菌代謝組分析

胡志宏，常旭念，代 探，吳嘉純，劉鵬飛

(中國農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，北京 100193)

基于GC-MS的灰葡萄孢菌代謝組分析

胡志宏，常旭念，代 探，吳嘉純，劉鵬飛*

(中國農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，北京 100193)

對農(nóng)作物重要病害灰霉病的致病菌——灰葡萄孢菌進行了代謝組提取溶劑、衍生化時間和溫度等前處理條件以及內(nèi)標物篩選優(yōu)化。結(jié)果表明，以水楊苷作為內(nèi)標物，試驗條件下以甲醇-水(80∶20)為提取溶劑，按照4.0 mL/0.1 g菌絲的劑量進行提取，采用N,O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺和甲氧基胺鹽酸鹽在37 ℃和6 h條件下進行衍生化，可實現(xiàn)多種代謝物衍生產(chǎn)物收率和穩(wěn)定性的最優(yōu)化?；移咸焰呔z代謝組的檢測獲得了210個峰，其中50種代謝物與NIST 2008的匹配度達到80%以上，主要為氨基酸類、醇類、有機酸類、糖類等代謝物，并通過標準品對部分代謝物進行了定性。典型的17種代謝物在1.0～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.98，檢出限為0.02～10.0 ng/mL，定量下限為0.1～34.0 ng/mL。方法精密度分析結(jié)果顯示89.05%代謝物的相對標準偏差為0.01%～16.8%。所建立的方法適合于絲狀真菌的代謝組檢測，可為農(nóng)業(yè)和醫(yī)學領域開展微生物代謝組研究提供參考。

灰葡萄孢菌；代謝組；樣品前處理；硅烷化

農(nóng)田十大病害之一灰霉病致病菌灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)寄主范圍廣且變異能力強，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重的危害[1]，對其常用的殺菌劑極易產(chǎn)生抗藥性，需不斷開發(fā)新型殺菌劑以有效控制該病害的田間危害。近年來，代謝組學的發(fā)展為揭示有機體的生命信息帶來了新的機遇[2-4]。病原菌的代謝組研究對揭示病原菌不同生長發(fā)育過程的代謝信息[5]，探索病原菌侵染植物過程相關(guān)的代謝物[6]及代謝途徑，分析潛在的藥物靶標等具有重要意義。

有關(guān)醫(yī)學樣本、植物樣本和微生物樣本代謝組的分析方法，國內(nèi)外已有不少報道[7-10]，核磁共振(NMR)[11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)[13]等分析平臺被廣泛應用于這一研究領域，各項技術(shù)互為補充[14]，揭示了更為全面的生物樣品的代謝組信息[15]。對病原菌代謝組的解析可提供其不同生長發(fā)育階段密切相關(guān)的代謝信息[15-16]，而GC-MS憑借其高分離能力及化合物數(shù)據(jù)庫資源在代謝組分析中表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。在采用代謝組信息解釋生物學現(xiàn)象之初，科研工作者面臨的一個重要問題即如何對生物樣本的代謝組進行準確的定性和定量[17]。已有文獻[18]認為在N,O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSTFA)衍生化反應體系中，反應時間對不同類別的代謝物反應收率存在較大影響，且內(nèi)標物對儀器和試驗方法的校準具有重要作用。此外，一般認為提取溶劑的極性決定了可提取代謝物的極性范圍[19]。

關(guān)于灰葡萄孢菌代謝組研究方面，目前國內(nèi)外對該病原微生物本身的代謝組研究鮮有報道，相關(guān)文獻多為通過分析灰葡萄孢菌侵染的寄主植物的代謝組(如葡萄[6]以及模式植物擬南芥[20]等)，進而研究病原與寄主互作關(guān)系?；贕C-MS的B.cinerea代謝組檢測尚缺乏系統(tǒng)可靠的方法，且前期研究顯示，常被用作內(nèi)標的核糖醇[21]由于背景干擾不宜用于B.cinerea代謝組分析。本文對B.cinerea菌絲的代謝組的提取、衍生化、GC-MS檢測方法的影響因素進行研究，以期建立適用于絲狀真菌的代謝組檢測方法，進而為微生物深入研究及應用提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

無菌操作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；20 ℃恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰勒斯特儀器公司)；分析天平(北京市丹佛儀器有限公司)；渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；真空離心濃縮儀(湖南赫西儀器裝備有限公司)；球磨儀(Restsch公司)；超低溫冰箱(Thermo公司)；離心機(Sorvall公司)；GC-MS儀(6890N/5973，安捷倫公司)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

甲醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；水(Milli-Q純水儀制備)；N,O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSTFA，含1 %TMS)、吡啶、甲氧基胺鹽酸鹽(分析純，Sigma-Aldrich公司)；1，3-丙二醇、核糖醇、肌醇、水楊苷、D-葡萄糖、D-果糖、D-吡喃甘露糖、L-丙氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、絲氨酸、L-天冬氨酸、L-纈氨酸、L-葡萄糖酸、DL-蘋果酸、檸檬酸、十六烷酸、硬脂酸、琥珀酸、延胡索酸標準品購于Sigma-Aldrich公司。

B.cinereaS28，采自沈陽農(nóng)大試驗田，寄主為番茄，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司鑒定，經(jīng)核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)及核蛋白編碼基因(G3PDH、HSP60和RPB2)鑒定為B.cinerea[22]。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng)與收集 采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)B.cinerea菌株3 d后，用0.5 cm打孔器沿著菌落外沿制取菌餅，用挑針挑取菌餅并接到鋪有玻璃紙的固體PDA培養(yǎng)基平板上，19.5～20.5 ℃條件下培養(yǎng)3 d。用干凈的解剖刀刮取玻璃紙上生長的菌絲培養(yǎng)物，去除接種的菌餅，稱取(100.0±0.5) mg收集于2 mL離心管中，將裝有菌絲的離心管迅速置于液氮中速凍3～5 min滅活，置于-80 ℃冰箱保存。

通過梳理中共十二大以來黨的文獻資料可以看出，中國特色社會主義的內(nèi)涵主要是從建設道路、建設事業(yè)、理論體系、政治旗幟等方面被加以闡釋的。

1.2.2 代謝組提取及衍生化方法 取保存的菌絲樣品，采用球磨儀以30次/s的頻率研磨2 min進行破碎處理，得菌絲粉末，加入2 mL提取溶劑(提取溶劑在-20 ℃保存30 min以上，冰上操作)[6]，渦旋振蕩1 min后，繼續(xù)超聲提取20 min。將提取獲得的代謝組溶液在12 000 r/min下離心15 min，準確移取0.6 mL上清液至離心管中，45 ℃抽真空離心干燥8 h以上至質(zhì)量恒定。

衍生化包括肟化和硅烷化兩步反應：準確吸取100 μL衍生化試劑甲氧基胺鹽酸鹽溶液(溶解于吡啶中，濃度為20 mg/mL)加入已離心干燥的樣品管中，封口，超聲20 min，渦旋1 min，稍微離心，30 ℃衍生化反應2 h；再加入100 μL衍生化試劑BSTFA至樣品管中，封口，超聲20 min，渦旋1 min，稍微離心，37 ℃衍生化反應6 h。獲得的衍生化樣品在12 000 r/min下離心15 min，吸取160 μL至GC自動進樣瓶中，4 ℃保存并于48 h內(nèi)檢測。

1.2.3 提取溶劑及劑量的選擇 分別用強、中、弱3種極性溶劑提取菌絲代謝組，即：I組為甲醇水(80∶20，體積比，下同)，Ⅱ組為甲醇-乙酸乙酯(50∶50)，Ⅲ組為乙酸乙酯。提取劑量按照4.0 mL對(100.0±0.5) mg的菌絲培養(yǎng)物進行代謝組的提取和檢測，比對不同溶劑對B.cinerea菌絲代謝組提取范圍的影響。

1.2.4 衍生化溫度及時間對代謝組分析的影響 在硅烷化反應過程中，分別在37，50，70 ℃條件下，經(jīng)過2，3，4，6，8，10 h衍生化反應后檢測，考察了反應溫度和時間對代謝物衍生化產(chǎn)物峰面積的影響。

1.2.5 內(nèi)標物質(zhì)的選擇 根據(jù)文獻報道選擇4種常用于代謝組GC-MS檢測的內(nèi)標物質(zhì)：1，3-丙二醇[23]、核糖醇[21]、肌醇[24]和水楊苷[25]，分別添加提取溶劑進行菌絲代謝組提取分析，與不加內(nèi)標的樣品比對，以菌絲中不存在的內(nèi)標物作為B.cinerea分析的內(nèi)標物。

1.2.6 GC-MS檢測條件 Agilent Technologies 6890N氣相色譜儀，Agilent Technologies 5973質(zhì)譜儀。檢測條件為：HP-5MS毛細管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；進樣體積1 μL；載氣流速1 mL/min；離子源和傳輸線溫度分別為230 ℃和280 ℃；氦氣為載氣，恒流模式；質(zhì)譜EI電離源70 eV，全掃描范圍m/z20～650，頻率0.2 s/scan；溶劑延遲時間5.5 min。色譜柱梯度升溫程序：65 ℃保持2 min，以5 ℃/min速率升至185 ℃，以1 ℃/min升至200 ℃，以15 ℃/min升至280 ℃，保持25 min。

1.2.7B.cinerea代謝組的定性分析 采用GC-MS數(shù)據(jù)分析軟件(增強型ChemStation MSD ChemStation E.02.01.1177)對GC-MS檢測數(shù)據(jù)進行保留時間和峰面積數(shù)據(jù)的導出。在典型樣品檢測TIC圖譜中，選取1個特征離子峰和2個參考離子峰作為定性離子，并以特征離子峰作為定量離子，編輯所有代謝物信息，并對代謝物進行峰面積積分。

1.2.8 代謝組分析方法學考察 以衍生化試劑20 mg/mL甲氧基胺鹽酸鹽吡啶溶液-BSTFA(1∶1)配制0.001，0.01，0.1，1.0，10，100 μg/mL的17種標準品系列溶液分別進行測定，以定量離子峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸，檢測各代謝物的線性范圍，進一步進行濃度梯度稀釋，以信噪比S/N=3的濃度作為檢出限。以各代謝物與內(nèi)標物質(zhì)的相對峰面積計算6次重復間的相對標準偏差，以考察方法的重現(xiàn)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

采用極性不同的提取溶劑Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取B.cinerea菌絲代謝組(實驗步驟參見“1.2.3”)，經(jīng)衍生化和GC-MS檢測獲得不同溶劑提取后的總離子流圖。結(jié)果顯示，經(jīng)溶劑Ⅰ提取獲得210個峰，溶劑Ⅱ獲得127個峰，溶劑Ⅲ獲得72個峰。通過定性分析，溶劑Ⅱ和Ⅲ提取到的代謝物譜完全包含于提取溶劑Ⅰ中。實驗結(jié)果表明，以極性最強的甲醇-水溶劑獲得代謝物質(zhì)的數(shù)目最多，遠大于乙酸乙酯提取到的代謝物數(shù)量，且可以覆蓋甲醇-乙酸乙酯和乙酸乙酯兩種溶劑提取到的代謝物譜。

通過NIST譜庫檢索，由甲醇-水提取到的B.cinerea代謝組主要成分為糖類、氨基酸類、有機酸類、醇類、酯類等物質(zhì)。而乙酸乙酯提取代謝組的總離子流圖上缺少的物質(zhì)主要是氨基酸類和糖類物質(zhì)，可能因為乙酸乙酯對氨基酸類和糖類物質(zhì)的提取效果差。有學者[26]采用不同配比的甲醇、水、氯仿來提取葡萄果實的代謝組，發(fā)現(xiàn)甲醇-氯仿-水(40∶40∶20)的提取效果最好，與本研究采用的甲醇水溶劑體系的極性略有差異。

2.2 衍生化溫度與時間對代謝組分析的影響

在不同時間和溫度組合的衍生化條件下，GC-MS檢測到的大部分代謝物隨溫度和反應時間變化表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律。結(jié)果顯示，在37 ℃反應溫度下，2～4 h內(nèi)隨著衍生化時間的增加，大部分代謝物的衍生產(chǎn)物含量逐漸增加，而反應4～10 h內(nèi)相對含量變化不顯著，這與文獻[18]報道結(jié)果一致。如氨基酸類纈氨酸(L-Valine)、異亮氨酸(L-Isoleucine)、脯氨酸(L-Proline)、甘氨酸(Glycine)和蘇氨酸(L-Threonine)，醇類的阿拉伯糖醇(Arabitol)，有機酯類的甘油磷酸酯(Phosphoglyceride)，糖類的葡萄糖(D-Glucose)，有機酸類的丁二酸(Butanedioic acid)衍生化產(chǎn)物的峰面積變化均小于1%。50 ℃和70 ℃反應條件下，大部分物質(zhì)在反應2 h后達到平衡，代謝物相對含量趨于穩(wěn)定，但部分代謝物在衍生化反應4～10 h后產(chǎn)物含量仍不穩(wěn)定。50 ℃條件下異亮氨酸上調(diào)了12%，硬脂酸(Octadecanoic acid)上調(diào)了37%；70 ℃條件下異亮氨酸上調(diào)了25%，硬脂酸上調(diào)了53%，脯氨酸下調(diào)了39%，葡萄糖下降了18%。因此，37 ℃下大部分代謝物在6 h后即可達到反應平衡，且產(chǎn)物較穩(wěn)定。因此，本實驗采用37 ℃衍生化6 h。

2.3 內(nèi)標物質(zhì)的選擇

經(jīng)GC-MS檢測，在本實驗條件下，1，3-丙二醇、核糖醇、肌醇和水楊苷衍生化產(chǎn)物的出峰時間分別為9.27，24.75，34.80，45.90 min。分別提取每一種標準物質(zhì)和菌絲代謝組的質(zhì)譜特征離子進行比對，其中1，3-丙二醇衍生化產(chǎn)物的特征離子m/z為75，105，133；核糖醇衍生化產(chǎn)物的特征離子m/z為217，103，147；肌醇衍生化產(chǎn)物的特征離子m/z為313，217，305；水楊苷衍生化產(chǎn)物的特征離子m/z為361，147，217。結(jié)果顯示，B.cinerea代謝組樣品中，1，3-丙二醇、核糖醇和肌醇均被檢出，而水楊苷的保留時間附近未檢出干擾峰，因此選擇水楊苷作為B.cinerea代謝組GC-MS檢測的內(nèi)標物質(zhì)。

2.4 線性范圍、檢出限及定量下限

以衍生化試劑20 mg/mL甲氧基胺鹽酸鹽吡啶溶液-BSTFA(1∶1)配制濃度為0.001～100 μg/mL的17種標準品系列溶液分別進行測定，以定量離子峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x，μg/mL)進行線性回歸(見表1)。結(jié)果表明，17種標準品在1.0～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2≥0.983 5)，各標準品的檢出限為0.02～10.0 ng/mL，定量下限為0.1～34.0 ng/mL，該方法顯示了較高的靈敏度。

表1 17種代謝物的標準曲線、檢出限及定量下限Table 1 Calibration curves，LODs and LOQs of 17 metabolites

圖1 B.cinerea代謝組典型總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram from metabolome of B.cinerea

2.5 重現(xiàn)性分析

通過GC-MS檢測獲得了B.cinerea的菌絲代謝組，其典型色譜圖如圖1所示。共檢出210個峰，其中與NIST 2008匹配度≥80%的代謝物有50個。主要包含氨基酸類11個、醇類3個、糖類8個、烷烴類2個、有機酸類14個、有機酯類2個、其它類別10個等物質(zhì)。通過比對相同檢測條件下樣品與標準物質(zhì)的保留時間和質(zhì)譜特征離子定性了17種代謝物。這些代謝物的化學類別、中英文名稱、保留時間、與NIST 2008匹配度及其特征離子等詳細信息見表2。

采用優(yōu)化的代謝組檢測方法，對B.cinerea做6次重復檢測定性分析后，進行代謝組重現(xiàn)性分析。結(jié)果顯示，該方法的重現(xiàn)性較好，89.05%的代謝物的相對標準偏差(RSD)為0.01%～16.8%。有學者基于GC-MS對人體血漿代謝組進行研究，對32種典型代謝物進行重現(xiàn)性分析，其RSD為3.7%～28.9%[27]。研究結(jié)果表明所建立的方法優(yōu)于文獻報道。

表2 B.cinerea菌絲代謝組信息Table 2 Information about metabolome of B.cinerea mycelium

(續(xù)表2)

ChemicalclassesCompoundRetentiontime(min)Matchquality(%)Characteristicions(m/z)aMonoethanolamine(乙醇胺)12 56096174，175，147Spiro[benzofuran?2(3H)，1′?[3]cyclohexene]?2′，3?di?one，4′，6，6′?trimethoxy?4?methyl?47 21190318，220，181Uridine(尿苷)44 49195217，103，218

a:the characteristic ions of derivative products，*:metabolites confirmed with standards(a表中所列為各代謝物衍生化產(chǎn)物特征離子，*標注的代謝物經(jīng)過標準品驗證)

3 結(jié) 論

本文對B.cinerea菌絲樣品的前處理及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法進行了研究，對B.cinerea菌絲代謝組的提取、衍生化條件等進行了優(yōu)化，并篩選了適合于B.cinerea菌絲代謝組GC-MS檢測分析的內(nèi)標物質(zhì)。此外，在鋪有玻璃紙的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)B.cinerea菌絲，有效扣除了培養(yǎng)基基質(zhì)對B.cinerea代謝組分析的影響，所建方法對微生物中主要代謝物種類如糖、氨基酸、醇、有機酸、烷烴、酯等均可檢出。方法學考察結(jié)果表明，該方法靈敏度高且重現(xiàn)性良好，可以滿足代謝組學研究高通量、高靈敏度和重現(xiàn)性的要求，適合于包括B.cinerea在內(nèi)的絲狀真菌的代謝組學研究，可為殺菌劑作用于灰霉菌代謝組機制研究、灰霉菌侵染寄主生物標志物研究提供基礎，并為農(nóng)業(yè)和醫(yī)學領域開展微生物代謝組相關(guān)研究提供了參考。

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Application of GC-MS inBotrytiscinereaMetabolome Analysis

HU Zhi-hong，CHANG Xu-nian，DAI Tan，WU Jia-chun，LIU Peng-fei*
(College of Plant Protection，China Agricultural University，Beijing 100193，China)

The pretreatment conditions，including extraction solvent，derivatization time and temperature，as well as internal standard were optimized for metabolome analysis ofBotrytiscinerea(B.cinerea)，an important pathogenic fungus that could induce a severe grey mold on plants.The results showed that，using salicin as the internal standard，a mixture of methanol and water(80∶20) with a dosage of 4.0 mL for 0.1 g of mycelium as extraction reagent，a silylation of N，O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with methoxylamine for 6 h of derivation at 37 ℃ was the optimal for most kinds of metabolites in derivatives yield and stability.InB.cinereahypha metabolome，210 peaks were detected by GC-MS， and the metabolome was identified as a group of metabolites including mainly amino acids，alcohols，organic acids，sugars and others.Among the metabolites，50 of them were identified by NIST 2008 with a match quality of 80% or more, and part of them by standards.As a result，typical 17 metabolites obtained good linearities in the range of 1.0-100 μg/mL with correlation coefficients more than 0.98.The limits of detection and limits of quantitation were in the range of 0.02-10.0 ng/mL and 0.1-34.0 ng/mL，respectively.Investigation on the reproducibility of the optimal method suggested that the RSD for 89.05% metabolites detected were in the range of 0.01%-16.8%.The good reproducibility implied that the method established was suitable for the metabolome detection of mycelial fungi,and could provide a good reference for microorganism metabolomics research in the field of agricultural and medical science.

Botrytiscinerea；metabolomics;sample pretreatment;silylation

2016-09-06；

2017-01-22

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(201303025)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.009

O657.63；Q939.51

A

1004-4957(2017)05-0633-07

*通訊作者：劉鵬飛，博士，副教授，研究方向：植物病理學與殺菌劑藥理學，Tel：010-62731226，E-mail：pengfeiliu@cau.edu.cn