溴氰菊酯對中華絨螯蟹主要免疫指標的影響

洪宇航

（西昌學院動物科學學院，四川 西昌 615000）

溴氰菊酯對中華絨螯蟹主要免疫指標的影響

洪宇航

（西昌學院動物科學學院，四川 西昌 615000）

為揭示溴氰菊酯對中華絨螯蟹免疫功能的影響，測定了在不同濃度溴氰菊酯（0、0.19、0.30、0.41、0.52 μg/L）條件下中華絨螯蟹總血細胞數(shù)量（THC）、吞噬活性、酚氧化酶（PO）活性、酸性磷酸酶（ACP）活性和堿性磷酸酶（AKP）活性5項主要免疫指標的變化情況。結(jié)果表明，溴氰菊酯對中華絨螯蟹免疫有顯著影響，低濃度處理（0.19、0.30 μg/L）引起THC 藥后6 h和12 h出現(xiàn)極顯著上升，隨后逐漸恢復；而高濃度處理（0.41、0.52 μg/L）則在藥后24 h后持續(xù)下降，藥后96 h極顯著低于對照。各濃度處理均對血細胞吞噬活性有抑制效應(yīng)，且隨著濃度升高抑制效果越強。0.52 μg/L處理PO活性藥后6 h出現(xiàn)極顯著上升，隨后逐漸下降，藥后96 h處理間無顯著差異；而ACP活性、AKP活性藥后6 h出現(xiàn)明顯下降，各時間段均極顯著低于對照。

溴氰菊酯；中華絨螯蟹；免疫功能；毒性作用

溴氰菊酯屬擬除蟲菊酯類殺蟲劑，是農(nóng)藥敵殺死的有效成分，由于其廣譜、高效、低毒和低殘留等特點，在世界范圍內(nèi)被廣泛使用［1］。隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，溴氰菊酯的使用量不斷增加，其主要通過農(nóng)田排水、地表徑流等途徑進入水體，對水生生物產(chǎn)生危害。溴氰菊酯對哺乳動物屬于中等毒性，但對魚類和甲殼動物毒性很強［2］。目前，關(guān)于溴氰菊酯對水生生物的毒性研究已有很多，但主要集中對魚類、貝類和小型甲殼動物［3-8］的毒性研究，而對于蝦蟹類則少見報道。

中華絨螯蟹（Erochier sinensis）又稱河蟹、大閘蟹，是我國重要的經(jīng)濟水產(chǎn)品種。隨著市場需求量的增加及養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，其質(zhì)量安全問題越來越受到人們的關(guān)注。由于溴氰菊酯的廣泛使用，存在對中華絨螯蟹養(yǎng)殖水體污染的潛在危害。關(guān)于溴氰菊酯對中華絨螯蟹的毒性研究，目前僅見國內(nèi)有一例報道［9］。但其主要研究了溴氰菊酯對不同生長階段中華絨螯蟹的急性毒性作用，而對其生理及免疫機能的影響并未關(guān)注。

因此，本試驗通過設(shè)置不同濃度梯度溴氰菊酯水體，研究其對中華絨螯蟹主要免疫指標，包括總血細胞數(shù)量（THC），血細胞吞噬活性，酚氧化酶（PO）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）活性的影響，初步探究了溴氰菊酯脅迫下中華絨螯蟹的免疫應(yīng)答情況，為后續(xù)免疫機理的研究以及生產(chǎn)中溴氰菊酯的規(guī)范使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年10月在西昌學院動物科學學院循環(huán)水養(yǎng)殖間進行，中華絨螯蟹成蟹采自江蘇省常州市金壇區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站養(yǎng)殖場。試驗前循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)1周以上。挑選健康無病、大小均一的中華絨螯蟹雌雄各半用于試驗，平均體重113（±12.8）g。將中華絨螯蟹放入125 cm×60 cm×60 cm水族箱中，每個水族箱加入經(jīng)充分曝氣的自來水50 L，并在箱底放置經(jīng)消毒處理的PVC管作為遮蔽物。

溴氰菊酯乳劑購自德國拜耳作物科學有限公司，溴氰菊酯有效含量為25 g/L，溶劑丙酮（分析純）購自成都科龍化工試劑廠。將溴氰菊酯乳劑加入丙酮配制成25 μg/L儲備液待用。

1.2 試驗設(shè)計

參考溴氰菊酯在中華絨螯蟹成蟹毒性試驗中的安全濃度和96 h半致死濃度，以及生產(chǎn)中溴氰菊酯在養(yǎng)殖水體中的殘留濃度。試驗設(shè)溴氰菊酯0.19、0.30、0.41、0.52 μg/L 4個濃度處理，另設(shè)空白對照及只添加丙酮的溶劑對照。每個處理3次重復，每個重復10只中華絨螯蟹，置于水族箱中。試驗采用96 h半靜水法，每24 h換水1次，提前配制相同濃度溴氰菊酯溶液以保證試驗濃度不變。光暗周期比12∶12，試驗期間每天上午8：00和下午19：00投喂人工配合飼料，并于投餌后3 h清除殘餌和糞便。試驗期間每24 h測定水溫和水質(zhì)指標，保證水溫為20（±2）℃，pH為 7.2～7.8，溶氧＞5 mg/L，氨氮＜0.5 mg/L，亞硝酸鹽＜0.15 mg/L。分別于藥后6、12、24、48、96 h觀察河蟹存活情況，每個水族箱任意選取3只取血淋巴用于免疫指標的檢測。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 THC檢測 于中華絨螯蟹第五步足基膜處抽取血淋巴100 μL，1∶1加入抗凝劑（0.1 mol/L葡萄糖，0.14 mol/L氯化鈉，30 mmol/L檸檬酸，10 mmol/L EDTA，pH4.6）混勻，立即用血球計數(shù)板進行血細胞計數(shù)，每個樣品計數(shù)重復3次取平均值。

1.3.2 吞噬活性 吞噬活性檢測參照Xian 等［10］的方法進行改良?？鼓?000 r/min 離心5 min，去上清，加入生理鹽水（NaCl 496 mmol/L，KCl 10 mmol/L，CaCl216 mmol/L，NaHCO36 mmol/L，MgSO4·6H2O 12 mmol/L，MgCl2·6H2O 8 mmol/L，HEPES 20 mmol/L）后緩慢吹打使細胞重懸浮，血細胞計數(shù)調(diào)整細胞密度至1×106個/mL。細胞懸液每1mL加入稀釋后的熒光乳膠微球（粒徑1 μm，激發(fā)波長470 nm，Sigma，美國）10 μL，混勻后接種至24孔細胞培養(yǎng)板（Corning，美國），黑暗條件下在恒溫培養(yǎng)箱中28℃孵育1 h。熒光倒置顯微鏡（Leica DM i8，德國）下鏡檢拍照，吞噬活性用吞噬熒光乳膠微球的血細胞占血細胞總數(shù)的比例來表示。

1.3.3 PO活性 抽取中華絨螯蟹血淋巴至2 mL 離心管，立即放入4℃冰箱4 h以上。11000 r/min 4℃高速冷凍離心30 min，小心收集上清液即為血清，4℃保存待用。PO活性測定參考Ashida［11］的方法，將50 μL 3 g/L L-dopa、50 μL血清以及50 μL PBS緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）加入96孔板中，在室溫下混勻孵育20 min，Bio-Rad iMark 酶標儀490 nm波長下讀取起始和10 min時的光密度值（OD490），以10 min內(nèi)每分鐘光密度值增加0.001為1個酶活力單位計算。

1.3.4 ACP活性 制備血清，ACP活性測定方法遵照ACP活性檢測試劑盒說明書（南京建成生物科技有限公司），Bio-Rad iMark 酶標儀520 nm波長下測定96孔板各孔吸光度，以每100 mL血清在37℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位。

1.3.5 AKP 活性 制備血清，AKP活性測定方法遵照AKP活性檢測試劑盒說明書（南京建成生物科技有限公司），Bio-Rad iMark 酶標儀520 nm波長下測定96孔板各孔吸光度，以每100 mL血清在37℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS V20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用Levene法進行方差齊性檢驗，不滿足齊性方差時對數(shù)據(jù)進行反正弦或者平方根處理，采用ANOVA對試驗結(jié)果進行方差分析，LSD和Duncan 法進行多重比較，在GraphPad Prism 5軟件上繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 溴氰菊酯對中華絨螯蟹THC的影響

中華絨螯蟹正常THC約為7.14（±0.32× 106）個/mL，各時間點空白對照與溶劑處理無顯著差異，表明溴氰菊酯溶劑對中華絨螯蟹血細胞數(shù)量并無影響。而0.19 μg/L和0.13 μg/L溴氰菊酯處理藥后6 h出現(xiàn)極顯著升高，藥后12 h達到頂峰，隨后逐漸下降，至藥后48 h與對照無顯著差異。0.41 μg/L和0.52 μg/L溴氰菊酯處理THC藥后6 h也略有上升，但隨后持續(xù)下降，藥后24 h極顯著低于對照，且隨著濃度增加，下降趨勢愈加明顯（圖1）。

2.2 溴氰菊酯對中華絨螯蟹吞噬活性的影響

中華絨螯蟹血細胞分為大顆粒細胞、小顆粒細胞和透明細胞3類。本試驗結(jié)果表明，3類細胞均具有吞噬功能，其中透明細胞吞噬能力最強，其次是大顆粒細胞，小顆粒細胞僅見少量吞噬。由圖2可見，空白對照和溶劑處理各時間點血細胞吞噬活性均無顯著差異，表明溶劑對其吞噬能力并無影響。各濃度處理較對照均呈下降趨勢，并隨著濃度升高降低越明顯。其中高濃度處理（0.41 μg/L和0.52 μg/L）藥后6 h即顯著低于對照。至藥后96 h，0.19 μg/L處理較藥后48 h有所回復，吞噬比例為11.34（± 1.33）%，但仍顯著低于對照。0.52 μg/L處理僅為6.36（±0.69）%，與對照差異極顯著。

圖1 不同濃度溴氰菊酯對中華絨螯蟹THC的影響

圖2 不同濃度溴氰菊酯對中華絨螯蟹吞噬活性的影響

2.3 溴氰菊酯對中華絨螯蟹PO活性的影響

藥后對照與溶劑處理PO活性無顯著差異，表明溶劑對中華絨螯蟹血清PO活性并無影響。除最高濃度0.52 μg/L處理外，其余各濃度處理藥后與對照無顯著差異，但0.30、0.41 μg/L處理藥后6 h出現(xiàn)略微升高，隨后逐漸下降的現(xiàn)象。最高濃度0.52 μg/L處理藥后6 h極顯著高于其他濃度處理，藥后12 h升至最高，隨后逐漸下降，直至藥后96 h與對照無顯著差異（圖3）。

圖3 不同濃度溴氰菊酯對中華絨螯蟹PO活性的影響

2.4 溴氰菊酯對中華絨螯蟹ACP活性的影響

從圖4可以看出，對照與溶劑處理ACP活性藥后并無顯著差異。0.19 μg/L和0.30 μg/L處理藥后與對照也無顯著差異。0.41 μg/L處理出現(xiàn)略微持續(xù)下降，藥后96 h顯著低于對照。而0.52 μg/L處理藥后6 h就出現(xiàn)明顯下降，隨后均顯著低于對照。

圖4 不同濃度溴氰菊酯對中華絨螯蟹ACP活性的影響

2.5 溴氰菊酯對中華絨螯蟹AKP活性的影響

試驗結(jié)果（圖5）表明，對照與溶劑處理ACP活性無顯著差異。除0.19 μg/L處理外，各濃度處理較對照明顯下降。但0.30 μg/L和0.41 μg/L處理藥后12 h逐漸恢復，至藥后96 h與對照無顯著差異。而0.52 μg/L處理則持續(xù)處于較低水平，藥后均極顯著低于對照。

圖5 不同濃度溴氰菊酯對中華絨螯蟹AKP活性的影響

3 討論

溴氰菊酯作為高效低毒低殘留的農(nóng)藥，被廣泛應(yīng)用于防治各種農(nóng)作物的害蟲。關(guān)于溴氰菊酯對水生生物的研究，目前國內(nèi)外有很多報道，但主要集中在魚類，而關(guān)于甲殼動物的報道較少。魏華等［12］研究了溴氰菊酯對克氏原螯蝦的毒性效應(yīng)，藥后96 h LC50為0.0993 μg/L，安全濃度為5.62 ng/L，證實其對克氏原螯蝦毒性極強；龔瑞忠等［13］通過在野外稻田進行溴氰菊酯對鯉魚和日本沼蝦的毒性試驗表明，溴氰菊酯對日本沼蝦藥后3 h LC50為0.41 μg/L，大于對鯉魚的危害。姜輝等［14］通過對菊酯類農(nóng)藥對水田生物影響的總結(jié)，認為大多數(shù)菊酯類農(nóng)藥對魚類藥后96 h LC50要比蝦類高1～2個數(shù)量級。因此，生產(chǎn)中存在利用低濃度溴氰菊酯作為治療魚類寄生蟲病，并用于殺滅魚塘中甲殼類的情況［15］。大量使用溴氰菊酯隨著農(nóng)田排水或雨水沖淋，對中華絨螯蟹以及其他經(jīng)濟甲殼類養(yǎng)殖水體產(chǎn)生較大安全影響。蔡道基等［16］通過稻田施用溴氰菊酯，并模擬下雨將農(nóng)田水排入魚塘，測定了池塘水體及底泥中溴氰菊酯的殘留，結(jié)果表明，溴氰菊酯排入池塘中4 h后濃度可達0.41 μg/L，隨后迅速降解，14 h后不再檢出。耿雪冰［9］研究表明，溴氰菊酯對中華絨螯蟹成蟹和幼蟹藥后48 h LC50分別為0.65、0.42 μg/L，安全濃度分別為0.46、0.19 μg/L，屬于高毒農(nóng)藥。但是他并沒有研究溴氰菊酯對于中華絨螯蟹免疫功能的影響。因此，本研究參照溴氰菊酯對中華絨螯蟹的急性毒性結(jié)果以及在水體中的殘留情況，設(shè)置5個濃度梯度，測定包括安全濃度以下不同濃度溴氰菊酯對中華絨螯蟹主要免疫指標的影響，為后續(xù)研究及溴氰菊酯的安全使用提供理論依據(jù)。

中華絨螯蟹作為甲殼類動物，其先天性免疫主要依靠血淋巴完成。其中，血細胞在免疫應(yīng)答中發(fā)揮主要作用，常被用于衡量甲殼類動物免疫水平指標之一［17］。本試驗結(jié)果表明，在溴氰菊酯暴露初期，各濃度處理THC均呈現(xiàn)一定上升，低濃度處理（0.19、0.30 μg/L）尤為明顯。而高濃度處理（0.41、0.52 μg/L）藥后12 h出現(xiàn)下降，至藥后96 h顯著低于對照。說明在低濃度條件下，溴氰菊酯會激發(fā)中華絨螯蟹免疫應(yīng)答，增加血細胞數(shù)量。而較高濃度條件下則會對免疫機能產(chǎn)生抑制，表現(xiàn)為THC降低并保持在較低水平。在Cu2+對斑節(jié)對蝦毒性研究中［10］，低濃度Cu2+（0.05、0.5 mg/L）下斑節(jié)對蝦THC出現(xiàn)上升，而高濃度（1.5、3.5 mg/L）下則造成THC顯著下降，與本試驗的結(jié)果相符。此外，Pimp?o等［18］研究顯示，在溴氰菊酯0.1 mg/kg 濃度下藥后4 h便可使多棘鈎鯰白細胞水平顯著上升，證實低濃度溴氰菊酯可以引起多棘鈎鯰的免疫應(yīng)答。此外，鄭惠東［19］通過溴氰菊酯對真鯛肝胰臟組織及細胞DNA損傷的研究指出，溴氰菊酯對真鯛肝胰臟組織和細胞DNA均可產(chǎn)生不同程度的損傷，且損傷程度與毒物濃度具有高度線性關(guān)系。因此，血細胞數(shù)量的大量下降可能跟其DNA嚴重損傷有關(guān)。這也間接證實本研究關(guān)于高濃度溴氰菊酯顯著降低中華絨螯蟹THC的結(jié)論。

血細胞被認為是甲殼動物的主要吞噬細胞，在異物入侵過程中起到至關(guān)重要的防御作用［20］。一般來說，甲殼動物細胞可以分為大顆粒細胞、小顆粒細胞和透明細胞3類。目前，多數(shù)研究表明透明細胞是甲殼動物血細胞中的主要吞噬細胞［21］。例如在艾氏濱蟹血細胞功能的研究中，發(fā)現(xiàn)只有透明細胞對酵母菌有吞噬能力［22］。Johansson等［23］研究也表明，小龍蝦的透明細胞起到主要的吞噬功能。但在有關(guān)圣保羅對蝦和螳螂蝦的研究中表明，大顆粒細胞和小顆粒細胞分別是其主要的吞噬細胞［24-25］。本研究通過對血細胞接種熒光乳膠微粒證實中華絨螯蟹3類細胞均有一定吞噬能力，其中透明細胞是主要吞噬細胞。這同Lv 等［26］對中華絨螯蟹血細胞吞噬功能研究的結(jié)果相同。此外，溴氰菊酯各濃度處理均能引起中華絨螯蟹血細胞吞噬活性的降低，并呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)關(guān)系，隨著濃度升高吞噬活性降低越明顯。至藥后48 h各濃度處理均顯著低于對照。Xian 等［10］研究指出，較高濃度Cu2+處理下斑節(jié)對蝦血細胞吞噬活性被嚴重抑制，這與本試驗結(jié)果相似，表明即使低濃度溴氰菊酯（低于安全濃度）也可以顯著影響中華絨螯蟹血細胞吞噬活性，直至藥后96 h仍處于較低水平。吳楠等［27］研究發(fā)現(xiàn)即使在溴氰菊酯0.005 μg/L濃度下也會對克氏原螯蝦產(chǎn)生細胞毒性，細胞色素氧化酶活性被顯著抑制。因此，我們推測溴氰菊酯對甲殼類動物較強的細胞毒性是造成血細胞數(shù)量下降從而引起其吞噬活性顯著降低的主要原因。

中華絨螯蟹體液中不具有免疫球蛋白，酚氧化酶（PO）作為其體液免疫主體之一是抵御外界不利環(huán)境的第一道防線，與機體的免疫有直接的關(guān)系［28］。本試驗結(jié)果表明，高濃度溴氰菊酯會引起中華絨螯蟹血淋巴PO活性藥后6 h即明顯上升，至藥后12 h達到最高隨后下降，藥后96 h基本恢復至正常水平。這與陸宏達等［29］報道的不同刺激造成中華絨螯蟹機體PO活性增強的結(jié)果相似。此外，Xian等［10］研究表明，0.5 mg/L Cu2+作用下斑節(jié)對蝦血淋巴PO活性會有所上升，藥后6 h明顯升高隨后降低。因此，我們推測溴氰菊酯藥后6 h即可激活中華絨螯蟹酚氧化酶系統(tǒng)，引起PO活性顯著上升。具體的激活時間點以及激活方式有待進一步研究。

ACP、AKP是甲殼動物體內(nèi)一組重要的水解酶，在甲殼動物免疫應(yīng)答中起到重要作用。本試驗結(jié)果表明高濃度溴氰菊酯可以明顯降低中華絨螯蟹血淋巴ACP、AKP活性持續(xù)至藥后96 h。其中，AKP活性受影響更大，最低濃度0.19 μg/L處理也會引起顯著降低。這與Zhao 等［30］在組織胺對中華絨螯蟹免疫影響研究中，不同濃度組織胺注射后6 h均引起中華絨螯蟹血清中ACP和AKP活性顯著下降的結(jié)論相同。

綜上所述，溴氰菊酯對中華絨螯蟹THC、吞噬活性、PO活性、ACP活性、AKP活性等主要免疫指標有明顯影響，呈現(xiàn)出濃度-效應(yīng)關(guān)系。即使是在安全濃度以下的各濃度（0.19、0.30、0.41 μg/L）均對其免疫功能有明顯抑制作用。因此，雖然溴氰菊酯在生產(chǎn)中由于施藥濃度較低、降解較快等特點不易達到中華絨螯蟹的致死濃度，但仍會對其免疫功能造成影響。水體中殘留溴氰菊酯可長時間持續(xù)影響中華絨螯蟹免疫功能，尤其在高溫季節(jié)水質(zhì)惡化，會增大病害發(fā)生的風險。因此，我們建議在中華絨螯蟹養(yǎng)殖水體周邊應(yīng)避免使用溴氰菊酯農(nóng)藥。

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（責任編輯 崔建勛）

Effects of deltamethrin on main immune parameters of Chinese mitten crab，Eriochier sinensis

HONG Yu-hang
（Animal Science Faculty，Xichang College，Xichang 615000，China）

In this research，the effects of deltamethrin on immune parameters were revealed by dectecting the changes of total hemocytes count （THC），phagocytic activity，phenoloxidase（PO） activity，acid phosphatase（ACP） activity and alkaline phosphatase（AKP） activity in hemolymph of Chinese mitten crab under different concentrations of deltamethrin（0，0.19，0.30，0.41，0.52 μg/L） exposure. The results showed that deltamethrin had evident effects on immune parameters of Chinese mitten crab，THC increased after 6 h and 12 h exposure to low concentrations of deltamethrin including 0.19 μg/L and 0.30 μg/L，and then decreased to normal level at 96 h. On the contrary，high concentration （0.41μg/L and 0.52μg/L） exposure declined the THC after 24 h，which was significantly lower than that of control group at 96 h. The phagocytic activity decreased under each concentration and the higher concentration made a higher inhibition of phagocytic activity. After exposure to 0.52μg/L deltamethrin，PO activity increased significantly at 6 h and then decreased gradually till 96 h，which had no significant difference among each group. However，both ACP and AKP activity decreased at 6 h exposure to 0.52μg/L deltamethrin and was significantly lower than those of control at each time point.

deltamethrin；Eriochier sinensis；immunity function；toxicity

S948

A

1004-874X（2017）03-0151-07

2017-01-04

四川省教育廳科研一般項目（17ZB0405）

洪宇航（1987-），男，碩士，助教，E-mail：hongyuhang1987@126.com

洪宇航.溴氰菊酯對中華絨螯蟹主要免疫指標的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2017，44（3）：151-157.