茶油中皂苷的指紋圖譜及抗脂質(zhì)過氧化的研究

聶 韡，賀義昌，朱培林，龔 斌

(江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013)

茶油中皂苷的指紋圖譜及抗脂質(zhì)過氧化的研究

聶 韡，賀義昌，朱培林，龔 斌

(江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013)

采用雙溶劑萃取法提取茶油中的皂苷類成分，建立其HPLC指紋圖譜，測(cè)定其抗脂質(zhì)過氧化活性，并考察共有峰與抗脂質(zhì)過氧化活性之間的相關(guān)性。茶油皂苷HPLC指紋圖譜的最佳色譜條件為：SunFire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：234 nm；柱溫：30 ℃。用“相似度評(píng)價(jià)軟件(2004A)”處理分析，建立茶油皂苷的HPLC指紋圖譜，確立了7個(gè)共有峰，10批次的茶油皂苷樣品相似度較好。測(cè)定茶油皂苷的抗脂質(zhì)過氧化活性，其中來自吉安市安?？h、上饒市弋陽(yáng)縣、九江市武寧縣的茶油皂苷抗脂質(zhì)過氧化活性最強(qiáng)，來自景德鎮(zhèn)市浮梁縣的茶油皂苷抗脂質(zhì)過氧化活性最弱。相關(guān)性分析的結(jié)果表明，峰3、峰5、峰7與抗脂質(zhì)過氧化活性具有顯著的正相關(guān)性，總皂苷含量與抗脂質(zhì)過氧化活性也呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性。

茶油；茶皂苷；指紋圖譜；抗脂質(zhì)過氧化

茶油是指山茶科植物油茶(Camelliaoleifera)的成熟種子經(jīng)壓榨而得的食用油，是我國(guó)特有的木本油脂，具有預(yù)防心血管疾病、抗氧化清除自由基等功效，非常適用于心臟病、血管硬化、高血壓等病人食用[1]。茶油中含有多種功能性成分，如多酚[2]、山茶皂苷[3]、黃酮[4]、角鯊烯[5]、維生素E[6]、無機(jī)元素[7]等。茶皂苷作為茶油的主要功能性成分之一，根據(jù)美國(guó)國(guó)家醫(yī)藥中心試驗(yàn)證實(shí)，茶皂苷具有溶血栓、降低膽固醇和抗癌的作用，能防止血管硬化所導(dǎo)致的多種心腦血管疾病[8]。本文對(duì)茶油中皂苷類成分進(jìn)行了提取，并對(duì)其進(jìn)行了指紋圖譜的分析和抗脂質(zhì)過氧化活性的測(cè)定及相關(guān)性研究，以期為茶油的進(jìn)一步研究開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶油樣品來自江西省不同地區(qū)油茶基地(詳見表1)；茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Aladdin Chemistry Co.,Ltd.。乙腈(HPLC級(jí)，F(xiàn)isher公司)；維生素C、2-硫代巴比妥酸、磷酸二氫鉀、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大豆卵磷脂、石油醚、乙醇、甲酸購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠；三氯乙酸、鹽酸、七水合硫酸亞鐵、氯化鉀購(gòu)自西隴化工有限公司；水為娃哈哈純凈水。

Waters 2695高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)，Empower色譜工作站；紫外可見分光光度計(jì) UV-1800(日本島津公司)；CP214型分析天平(奧豪斯儀器有限公司)；超聲清洗器(潔康超聲波有限公司)；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮公司)。

表1 10批茶油樣品來源信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試品溶液的制備 稱取20 g茶油待測(cè)樣品于錐形瓶中，加入100 mL石油醚，再加入50 mL 30%的乙醇，將稱取好的樣置于超聲波提取器中提取30 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中靜置10 min分液，將上層液重新倒入錐形瓶中。重復(fù)提取2次，將收集液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干，用60 ℃超純水定容至2 mL。

1.2.2 茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品的制備 準(zhǔn)確稱取茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，用30%乙醇溶解，并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

1.2.3 茶油中茶皂苷指紋圖譜分析 SunFire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)：含0.2%甲酸水溶液(B)梯度洗脫(0～25 min，10% A；25～60 min，10%～15% A；60～80 min，15% A)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：234 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL。數(shù)據(jù)處理應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A)分析和繪制茶油皂苷的HPLC指紋圖譜。

1.2.4 脂質(zhì)過氧化活性測(cè)定 于10 mL具塞玻璃管中依次加入1 000 μL(0.3 mg/mL)大豆卵磷脂緩沖體系，250 μL樣品溶液，1 500 mL PBS緩沖溶液，250 mL FeSO4-Vc溶液，混合均勻，置于37 ℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)1 h，取出玻璃管后向各個(gè)管中加入2 mL TCA-TBA-HCl溶液，100 ℃水浴加熱15 min，迅速冷卻，倒入10 mL離心管中，4 000 r/min，離心10 min，于532 nm處測(cè)定吸光值。陽(yáng)性對(duì)照Vc溶液濃度為10 mg/mL[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶油中茶皂苷的指紋圖譜分析條件的確定

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取適量茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于石英比色皿中，使用紫外-可見分光光度計(jì)在200 nm～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。由圖1可知，茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品溶液在226 nm處有最大吸收，因此，選擇226 nm作為茶油中茶皂素指紋圖譜分析的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品紫外光譜掃描圖(200～600 nm)

2.1.2 流動(dòng)相的確定 根據(jù)茶油皂苷的性質(zhì)，比較了甲醇-水、乙腈-水兩種流動(dòng)相體系，結(jié)果表明，流動(dòng)相中的甲醇在226 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下存在末端吸收，基線噪音較大，因此選擇乙腈-水作為分離茶油皂苷的流動(dòng)相體系。另外，由于茶油皂苷的結(jié)構(gòu)中具有酸性基團(tuán)，因此水相中加入適量酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值至酸性，能夠使圖譜中的各個(gè)色譜峰達(dá)到更好的分離，且峰形更好。通過篩選，最后確定茶油皂苷指紋圖譜分析的流動(dòng)相為乙腈-水(含0.2%甲酸)梯度洗脫。

2.2 茶油中茶皂苷指紋圖譜分析方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取1號(hào)茶油樣品20 g，按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品，按照“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，考察儀器的精密度。結(jié)果顯示，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.9%，相對(duì)峰面積的RSD值均小于<4.1%，說明該方法精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取1號(hào)茶油樣品20 g，按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品，分別于0 h、1 h、4 h、8 h、12 h、24 h按照“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，考察樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.7%，相對(duì)峰面積的RSD值均小于<5.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取1號(hào)茶油樣品20 g，共6份，按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，考察試驗(yàn)的重復(fù)性。結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.1%，相對(duì)峰面積的RSD值均小于<8.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3 茶油皂苷指紋圖譜的建立

2.3.1 指紋圖譜的采集 精密稱取10批次的茶油樣品20.0 g，分別按照“1.2.1”項(xiàng)下方法制備茶油皂苷的供試品，采用“1.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行HPLC測(cè)定，得到各批次茶油皂苷的HPLC指紋圖譜及其對(duì)照?qǐng)D譜。

圖2 茶油皂苷對(duì)照指紋圖譜

圖3 10批茶油皂苷指紋圖譜

2.3.2 共有峰的確定 根據(jù)測(cè)定結(jié)果，10批次樣品的指紋圖譜的色譜峰，有7個(gè)色譜峰在各批次茶油皂苷提取物的指紋圖譜中均出現(xiàn)，因此標(biāo)定該7個(gè)色譜峰為共有峰，運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A)進(jìn)行指紋圖譜數(shù)據(jù)分析，采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，其中7號(hào)峰在10批樣品的指紋圖譜中均為主要成分之一且分離度良好，因此將其確定為參照峰。

2.3.3 對(duì)照指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 將10批茶油皂苷樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)，利用中位數(shù)法，以S5號(hào)樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜，以此作為茶油皂苷的對(duì)照指紋圖譜，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，其計(jì)算結(jié)果見表2。10批樣品的相似度計(jì)算結(jié)果均大于0.9，說明不同來源的茶油樣品中皂苷類成分組成具有較好的一致性。

表2 10批茶油皂苷樣品相似度分析結(jié)果

2.4 抗脂質(zhì)過氧化活性測(cè)定

取不同來源的茶油樣品，按照上述“1.2.5”方法測(cè)定不同來源茶油中茶皂苷的抗脂質(zhì)過氧化活性，結(jié)果見表3。由表中數(shù)據(jù)可見，不同來源的茶油中的皂苷類成分均呈現(xiàn)出不同程度的抗脂質(zhì)過氧化活性，其中來自吉安市安福縣、上饒市弋陽(yáng)縣、九江市武寧縣的茶油皂苷抗脂質(zhì)過氧化活性最強(qiáng)，來自景德鎮(zhèn)市浮梁縣的茶油皂苷抗脂質(zhì)過氧化活性最弱。

表3 不同來源茶油皂苷的脂質(zhì)過氧化活性結(jié)果

2.5 茶油皂苷指紋圖譜共有峰含量與抗脂質(zhì)過氧化活性的雙變量相關(guān)性分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，分析不同來源茶油中皂苷類成分指紋圖譜共有峰與抗脂質(zhì)過氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的Pearson相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表4。

表4 苯乙醇苷含量與抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)

注：*P<0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；**P<0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

雙變量相關(guān)分析是研究變量之間密切程度的一種統(tǒng)計(jì)方法，2個(gè)因素之間的關(guān)系越密切，其相關(guān)系數(shù)越大。結(jié)果表明，峰3、峰5、峰7與抗脂質(zhì)過氧化活性具有顯著的正相關(guān)性(P<0.01)；總皂苷含量與抗脂質(zhì)過氧化活性也呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性(P<0.01)，但是抗脂質(zhì)過氧化活性是不同物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果，僅僅通過簡(jiǎn)單的相關(guān)分析不能準(zhǔn)確、全面的反映二者之間的關(guān)系，在今后的研究中還需進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

3 結(jié) 論

(1)茶油中皂苷提取方法的確定：茶油中的主要成分為脂肪酸，為油狀液體，本文作者在提取茶油中的皂苷時(shí)先采用了簡(jiǎn)單的乙醇萃取的方法，但在乙醇萃取部位經(jīng)濃縮干燥后一直有油狀物殘留，而后改用雙溶劑萃取，同時(shí)加入石油醚和乙醇，使油脂類成分進(jìn)入石油醚層，極性大的皂苷類物質(zhì)進(jìn)入乙醇層，從而達(dá)到較好地分離效果，乙醇層經(jīng)濃縮干燥后可得到白色粉末狀固體，便于進(jìn)一步的分析測(cè)定。

(2)茶油具有很好的抗氧化活性，其中脂質(zhì)過氧化與機(jī)體衰老、腫瘤、心腦血管疾病有密切關(guān)系，本文對(duì)茶油中的一類活性物質(zhì)——皂苷進(jìn)行指紋圖譜及抗脂質(zhì)過氧化的研究，結(jié)果證明來自不同區(qū)域的茶油樣品中的皂苷類成分均呈現(xiàn)了一定的抗脂質(zhì)過氧化活性，且與其指紋圖譜進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析表明，指紋圖譜中的共有峰均與抗脂質(zhì)過氧化活性呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，進(jìn)一步證明皂苷類成分是茶油具有抗脂質(zhì)過氧化活性的重要組成之一。

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Study on Fingerprints and Anti-lipoperoxidant of Saponins in Tea Oil

Nie Wei，He Yichang，Zhu Peilin，Gong Bin

(Jiangxi Academy of Forestry，Nanchang 330013，China)

Saponins from tea oil was extracted by double solvent extraction，their HPLC fingerprint and anti lipoperoxidation activity were analysed，and the correlation between common peak and activity was investigated.The best chromatographic condition：sunfire C18column(4.6 mm×250 mm，5 μm)，acetonitrile-0.2% formic acid solution gradient elution by flow volume of 1.0 mL/min，column temperature at 30 ℃ and the detection wavelength at 234 nm.The similarity analyzed with “Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Chinese Materia Medica 2004A”，As a result，there were 7 common peaks，and the similarity degrees of 10 batches of the samples was more than 0.9，showing that all the samples from different origins are of good consistency.The result of anti lipoperoxidation activity suggests that the saponins of tea oil from Anfu of Jian，Yiyang of Shangrao and Wuning of Jiujiang were better than others.The results of correlation analysis showed that peak 3，peak 5，peak 7 and total saponin content had a significant positive correlation with the anti lipoperoxidation activity.

tea oil；saponins；fingerprints；anti-lipoperoxidant

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.02.003

2016-08-11

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20133BAB20007)。

作者簡(jiǎn)介：聶韡(1982—)，女，博士，副研究員，研究方向?yàn)橹兴幓钚猿煞痔崛〖百|(zhì)量評(píng)價(jià)。E-mail：nw1025@hotmail.com

Q946

A

1006-9690(2017)02-0009-04