• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人腦挫裂傷早期HMGB1的表達(dá)變化特征

    2017-06-07 10:30:20賈利云姚安會(huì)李經(jīng)綸王本瀚
    關(guān)鍵詞:胞漿挫裂傷人腦

    賈利云 姚安會(huì) 李經(jīng)綸 劉 偉 王本瀚△

    1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng) 453000 2)解放軍第153中心醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450042 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450001

    人腦挫裂傷早期HMGB1的表達(dá)變化特征

    1,2)賈利云3)姚安會(huì)2)李經(jīng)綸2)劉 偉2)王本瀚2)△

    1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng) 453000 2)解放軍第153中心醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450042 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450001

    目的 探討人腦挫裂傷早期HMGB1表達(dá)的變化特征。方法 收集人腦挫裂傷后不同時(shí)間點(diǎn)挫裂傷組織的標(biāo)本(正常組、6 h、12 h、24 h、72 h),4%多聚甲醛固定,冰凍切片,然后進(jìn)行免疫熒光染色,統(tǒng)計(jì)分析各時(shí)間點(diǎn)HMGB1的表達(dá)情況;同時(shí)將HMGB1與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN進(jìn)行共標(biāo),觀察人腦挫裂傷后早期神經(jīng)元損傷過(guò)程中從核內(nèi)向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移的情況。結(jié)果 正常人腦組織的HMGB1表達(dá)主要集中在細(xì)胞核內(nèi),與正常組相比較,人腦挫裂傷組在傷后HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)于12 h開(kāi)始下降(P<0.05),并持續(xù)至72 h;而HMGB1從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿內(nèi)的數(shù)目從6 h即開(kāi)始增加(P<0.05),隨時(shí)間增加HMGB1也隨之大量轉(zhuǎn)移到胞漿中,在人腦挫裂傷后24 h 達(dá)到高峰(P<0.05)。人腦挫裂傷后早期,HMGB1主要表達(dá)在神經(jīng)元中(P>0.05),腦挫裂傷后神經(jīng)元的數(shù)目逐漸減少(P<0.05),而HMGB1從神經(jīng)元核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿的比例在6 h明顯增加(P<0.05),于24~72 h達(dá)到高峰(P<0.05)。結(jié)論 人腦挫裂傷后早期神經(jīng)元死亡或凋亡數(shù)目明顯增加,HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也在損傷后減少;而HMGB1神經(jīng)元從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿的比例升高;HMGB1可能參與了腦挫裂傷后神經(jīng)元的死亡或凋亡。

    顱腦損傷;HMGB1;神經(jīng)元

    隨著現(xiàn)代化的進(jìn)程,交通及建筑業(yè)的發(fā)展,顱腦損傷的發(fā)生率越來(lái)越高,創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是世界各地衛(wèi)生保健系統(tǒng)亟待解決的重大難題,已成為威脅人們健康的主要原因之一[1-2]。高遷移率組蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)為19世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一種在細(xì)胞核內(nèi)廣泛存在、序列高度保守的非組蛋白[3]。HMGB1最初只作為一種核內(nèi)蛋白研究其在細(xì)胞核內(nèi)的功能,包括參與核小體的構(gòu)建與功能、DNA的重組修復(fù)和復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控等[4]。Wang等[5]首先發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞受到內(nèi)毒素等刺激后可以釋放HMGB1到細(xì)胞外,并作為一種炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。釋放到胞外的HMGB1不僅可以參與各種炎癥性疾病,而且在腫瘤、病毒性疾病、創(chuàng)傷、再灌注損傷等的病理過(guò)程中也起著重要作用。HMGB1可以由壞死細(xì)胞的被動(dòng)釋放或炎癥細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞)的主動(dòng)釋放[6]。研究發(fā)現(xiàn),TBI 后HMGB1 由壞死和損傷的神經(jīng)細(xì)胞釋放。釋放的HMGB1與細(xì)胞膜表面受體,如RAGE、Toll樣受體等模式識(shí)別受體結(jié)合,進(jìn)而激活免疫細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì),一方面介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡;另一方面,通過(guò)多種復(fù)雜的病理生理機(jī)制,對(duì)腦組織造成二次損傷,形成惡性循環(huán)[7-8]。以往關(guān)于HMGB1在腦挫裂傷后的研究多基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),而且多集中在腦挫裂傷后炎癥反應(yīng)的形成機(jī)制方面。對(duì)人腦挫裂傷后早期HMGB1的表達(dá)變化,尤其是損傷后早期神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)特點(diǎn)的研究甚少。為此,我們通過(guò)收集人腦挫裂傷后不同時(shí)間點(diǎn)手術(shù)標(biāo)本,分析人腦挫裂傷早期HMGB1的表達(dá)情況。

    1 資料和方法

    1.1 一般資料 納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)顱腦CT 證實(shí)為腦挫裂傷,年齡30~60 歲且需手術(shù)治療的患者40 例。排除年齡較大或較小、存在其他器官?gòu)?fù)合傷患者8 例,32例患者納入實(shí)驗(yàn)樣本,其中男25例,女7例,年齡30~40 歲,平均31.34歲,標(biāo)本均為挫裂傷腦組織中心約3 cm 范圍內(nèi)的腦組織;正常腦組織5例(腦腫瘤手術(shù)暴露過(guò)程中行額極或顳極切除的腦組織),腦挫裂傷6 h組6例,腦挫裂傷12 h組8例,腦挫裂傷24 h組8例,腦挫裂傷72 h組5例。實(shí)驗(yàn)經(jīng)解放軍153醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)證通過(guò),且均征得患者家屬同意,并簽署知情同意書(shū)。

    1.2 組織制備 將標(biāo)本取出后,用4%多聚甲醛(pH=7.4,4 ℃)固定。然后置于含25%蔗糖的0.1 mol/L PB溶液中,4 ℃保存,直至標(biāo)本沉底。用恒冷箱切片機(jī)(Leica,CM1900)行連續(xù)矢狀切片,片厚16 μm,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 主要試劑與儀器 一抗:兔抗人HMGB1單克隆抗體(Abcam,美國(guó));小鼠抗人NeuN單克隆抗體(Millipore,美國(guó));小鼠抗人GFAP單克隆抗體(Millipore,美國(guó));山羊抗人Iba-1單克隆抗體(Abcam,美國(guó));二抗:山羊抗兔FITC(中杉金橋,中國(guó));山羊抗鼠TRITC(中杉金橋,中國(guó));驢抗山羊CY3(Beyotime,中國(guó));驢抗兔Alexa Fluor 488(Molecular Probes,美國(guó));DAPI(Solarbio,中國(guó));熒光顯微鏡:Olympus BX51。

    1.4 免疫熒光染色 HMGB1與DAPI共標(biāo):取一套切片入無(wú)triton含1%胎牛血清的封閉液室溫封閉30 min,然后用0.01%的PBS(pH 7.4)浸洗3次,每次5 min。加入兔抗人HMGB1(1:200,Abcam)孵育,室溫過(guò)夜(16~24 h),0.01%的PBS清洗3次,每次5 min,然后加入相應(yīng)含有FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:200)的二抗及DAPI(1:1 000)。37 ℃室溫避光2 h。之后用0.01%的PBS清洗后以50%甘油溶液封片;顯微鏡觀察并照片。HMGB1與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN或星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP或小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1進(jìn)行雙標(biāo):取一套切片分A、B、C3組,入無(wú)triton含1%胎牛血清的封閉液室溫封閉30 min,然后用0.01%的PBS(pH 7.4)浸洗3次,5 min/次。A組加入兔抗人HMGB1(1:200,Abcam)和小鼠抗人NeuN(1:50,Millipore)孵育;B組加入兔抗人HMGB1(1:200,Abcam)和小鼠抗人GFAP(1:200,Millipore)孵育;C組加入兔抗人HMGB1(1:200,Abcam)和山羊抗人Iba-1(1:200,Abcam)孵育。室溫過(guò)夜(16~24 h),0.01%的PBS清洗3次,5 min/次,然后A組加入相應(yīng)含有FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:200)及含有TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1:200)的二抗及DAPI(1: 1 000);B組加入相應(yīng)含有FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:200)及含有TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (1:200)的二抗及DAPI(1:1 000);C組加入相應(yīng)含有Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗兔IgG(1:200)及含有CY3標(biāo)記的驢抗山羊IgG(1:200)的二抗及DAPI(1:1 000)。37 ℃室溫避光2 h。用0.01%的PBS清洗后以50%甘油溶液封片,并用熒光顯微鏡BX-51觀察,隨即選取4個(gè)視野進(jìn)行照相。

    1.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 表達(dá)HMGB1的細(xì)胞:HMGB1與細(xì)胞標(biāo)記物NeuN、GFAP或Iba-1及細(xì)胞核標(biāo)記物DAPI三者共標(biāo)的細(xì)胞;從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):HMGB1同時(shí)存在于核內(nèi)及胞漿內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。選擇每張切片免疫反應(yīng)較強(qiáng)的區(qū)域,視野(×200)下觀察4個(gè)不重復(fù)視野,計(jì)數(shù)HMGB1染色細(xì)胞。計(jì)算表達(dá)在胞核中的HMGB1的細(xì)胞數(shù)、胞漿中的HMGB1細(xì)胞數(shù)、胞核胞漿共同表達(dá)HMGB1的細(xì)胞數(shù)。

    2 結(jié)果

    2.1 人腦挫裂傷后早期HMGB1的表達(dá) 通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)腦挫裂傷組織進(jìn)行HMGB1與DAPI共標(biāo)染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組比較,HMGB1陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)于人腦挫裂傷后12 h開(kāi)始下降(P<0.05),并持續(xù)下降至72 h(P<0.05);而HMGB1從細(xì)胞核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)移的比例在人腦挫裂傷后6 h 明顯增加(P<0.05),并逐漸升高,于人腦挫裂傷后24 h達(dá)到高峰(P<0.05),于72 h表達(dá)有所下降(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

    2.2 人腦挫裂傷后早期HMGB1的表達(dá)主要在神經(jīng)元 于各時(shí)間點(diǎn),進(jìn)行HMGB1與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN或星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP或小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1免疫熒光染色;對(duì)表達(dá)HMGB1的神經(jīng)元數(shù)目與總HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),人腦挫裂傷早期HMGB1主要表達(dá)在神經(jīng)元,各組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

    圖1 人腦挫裂傷后HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及轉(zhuǎn)移至胞漿內(nèi)比例(免疫熒光染色,×200) 1A、1B、1C:正常組;2A、2B、2C:腦挫裂傷6 h;3A、3B、3C:腦挫裂傷12 h;4A、4B、4C:腦挫裂傷24 h;5A、5B、5C:腦挫裂傷72 h(A、B、C分別為DAPI、HMGB1、Merge;注:HMGB1染為綠色,DAPI染為藍(lán)色);6A:HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖,與正常組比較,*P<0.05;6B:HMGB1轉(zhuǎn)移至胞漿陽(yáng)性細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)圖,與正常組比較,*P<0.05,與前一組比較,#P<0.05

    圖2 人腦挫裂傷后HMGB1表達(dá)的細(xì)胞分布(免疫熒光染色,×200) A為人腦挫裂傷后24 h NeuN與HMGB1共標(biāo)(HMGB1染為綠色,NeuN染為紅色);B為人腦挫裂傷后24 h GFAP與HMGB1共標(biāo)(HMGB1染為綠色,GFAP染為紅色);C為人腦挫裂傷后24 h Iba-1與HMGB1共標(biāo)(HMGB1染為綠色,Iba-1染為紅色);D人腦挫裂傷后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元表達(dá)HMGB1的比例

    2.3 HMGB1在神經(jīng)元表達(dá)的特點(diǎn) 將人腦挫裂傷后早期不同時(shí)間點(diǎn)的組織切片進(jìn)行HMGB1、NeuN及DAPI的免疫熒光染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn),人腦挫裂傷后神經(jīng)元的數(shù)目逐漸減少(P<0.05);而HMGB1從神經(jīng)元核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)移的比例在傷后6 h明顯增加(P<0.05),并逐漸升高,于人腦挫裂傷后24~72 h達(dá)到高峰(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

    圖3 人腦挫裂傷后不同時(shí)間點(diǎn)HMGB1神經(jīng)元表達(dá)情況(免疫熒光染色,×200) 1A、1B、1C:正常組;2A、2B、2C:腦挫裂傷后6 h;3A、3B、3C:腦挫裂傷12 h;4A、4B、4C:腦挫裂傷24 h;5A、5B、5C:腦挫裂傷72 h(A為HMGB1與DAPI共標(biāo),B為NeuN與DAPI共標(biāo),C為三者M(jìn)erge共標(biāo);注:HMGB1染為綠色;NeuN染為紅色;DAPI染為藍(lán)色);箭頭所示:HMGB1轉(zhuǎn)移至胞漿外,神經(jīng)元與其共標(biāo)。6A:神經(jīng)元HMGB1陽(yáng)性統(tǒng)計(jì)圖,與正常組比較,*P<0.05;6B:神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞中HMGB1轉(zhuǎn)移至胞漿比例統(tǒng)計(jì)圖,與正常組比較,*P<0.05,與前一組比較,#P<0.05

    3 討論

    HMGB1是一個(gè)普遍存在且高度保守的蛋白,在細(xì)胞內(nèi),HMGB1能與DNA結(jié)合,通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)架構(gòu)發(fā)揮調(diào)控翻譯,修復(fù)和重組的作用[9-10]。最近研究表明、HMGB1可以被氧化而發(fā)揮多種作用,包括亞細(xì)胞定位、調(diào)控DNA、細(xì)胞因子、調(diào)控免疫等多種作用[4]。雖然HMGB1主要存在細(xì)胞內(nèi),但在細(xì)胞受到刺激、細(xì)胞死亡、凋亡,組織缺氧及缺血/再灌注時(shí),HMGB1可以被釋放到胞漿及細(xì)胞外[9]。早期大量研究表明,TBI可引起細(xì)胞壞死、凋亡、炎癥反應(yīng)等多種病理生理變化[11]。Wang等通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),HMGB1參與了蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡。鄧必高等[12]研究發(fā)現(xiàn),異丙酚可以影響大鼠內(nèi)毒素腦損傷后的HMGB1表達(dá)。黃海英等[13]研究表明,通過(guò)臍帶血檢測(cè)HMGB1可以對(duì)在妊娠高血壓產(chǎn)婦的新生兒腦損傷程度進(jìn)行判斷。我們的研究發(fā)現(xiàn),HMGB1在人腦挫裂傷后早期從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿的比例逐漸增高,于傷后24 h達(dá)到高峰。Gao等[14]研究發(fā)現(xiàn),HMGB1在小鼠腦挫裂傷后6 h表達(dá)明顯下降,而在2 d后其表達(dá)恢復(fù)至正常水平。而我們的研究同樣發(fā)現(xiàn),HMGB1在人腦挫裂傷后6 h表達(dá)開(kāi)始下降,然而其下降一直維持至72 h。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn),人腦挫裂傷后早期HMGB1主要表達(dá)在神經(jīng)元,且隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)元的數(shù)目在明顯下降,而HMGB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至胞漿的比例卻明顯增高。HMGB1作為致炎因子在顱腦損傷后的病理變化中起重要作用,顱腦損傷后,細(xì)胞水腫、缺氧、炎癥反應(yīng)、壞死、凋亡等多種病理變化均可促使HMGB1的轉(zhuǎn)移及釋放,而釋放的HMGB1又可以參與到顱腦損傷的繼發(fā)性損傷中[14-15]。我們推測(cè)HMGB1參與了人腦挫裂傷后早期神經(jīng)元的凋亡或死亡,其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

    [1] Helmick KM,Spells CA,Malik SZ,et al.Traumatic brain injury in the US military:epidemiology and key clinical and research programs[J].Brain Imaging Behav,2015,9(3):358-366.

    [2] Voss JD,Connolly J,Schwab KA,et al.Upda-te on the Epidemiology of Concussion/Mild Traumatic Brain Injury[J].Curr Pain Heada-che Rep,2015,19(7):32.

    [3] Read CM,Cary PD,Crane-Robinson C,et al.Solution structure of a DNA-binding domain from HMG1[J].Nucleic Acids Res,1993,21(15):3 427-3 436.

    [4] Gougeon ML,Melki MT,Saidi H.HMGB1,an alarmin promoting HIV dissemination and latency in dendritic cells[J].Cell Death Differ,2012,19(1):96-106.

    [5] Wang H,Bloom O,Zhang M,et al.HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice[J].Science,1999,285(5 425):248-251.

    [6] Scaffidi P,Misteli T,Bianchi ME.Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation[J].Nature,2002,418(6 894):191-195.

    [7] Okuma Y,Liu K,Wake H,et al.Glycyrrhizin inhibits traumatic brain injury by reducing HMGB1-RAGE interaction[J].Neuropharmacology,2014,85:18-26.

    [8] Stahel PF.Expression of HMGB1 and RAGE in rat and human brains after traumatic brain injury[J].J Trauma Acute Care Surg,2012,73(3):782-783.

    [9] Harris HE,Andersson U,Pisetsky DS.HMGB1:a multifunctional alarmin driving autoimmune and inflammatory disease[J].Nat Rev Rheumatol,2012, 8(4):195-202.

    [10] Ueda T,Yoshida M.HMGB proteins and transcriptionalregulation[J].Biochim Biophys Acta,2010,1 799(1/2): 114-118.

    [11] Park E,Bell JD,Baker AJ.Traumatic brain injury:can the consequences be stopped?[J].CMAJ,2008,178(9): 1 163-1 170.

    [12] 鄧必高,但伶,李煒,等.異丙酚對(duì)大鼠內(nèi)毒素腦損傷蛋白質(zhì)絡(luò)氨酸激酶和高遷移率族蛋白B-1表達(dá)的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2014,24(29):29-33.

    [13] 黃海英,陳尚明,劉永華,等.NSE和HMGB1在妊娠高血壓病產(chǎn)婦的新生兒腦損傷中的診斷價(jià)值[J].江蘇醫(yī)藥,2016,42(1):44-46.

    [14] Gao TL,Yuan XT,Yang D,et al.Expression of HMGB1 and RAGE in rat and human brains after traumatic brain injury[J].J Trauma Acute Care Surg,2012,72(3):643-649.

    [15] Zou JY,Crews FT.Release of neuronal HMGB1 by ethanol through decreased HDAC activity activates brain neuroimmune signaling[J].PLoS One,2014,9(2):e87 915.

    (收稿2016-12-27)

    The features of HMGB1 expression in early traumatic brain injury

    LiuLeizhen*,JiaLiyun,YaoAnhui,LiJinglun,LiuWei,WangBenhan

    *XinxiangMedicalCollege,Xinxiang453000,China

    Objective To explore the features of high-mobility group box 1(HMGB1)expression in early traumatic brain injury(TBI).Methods We collected traumatic brain tissues induced by traumatic brain injury at different time point(6 h,6 h,12 h,24 h and 72 h)and normal brain tissues which were fixed by 4% paraformaldehyde.After performing frozen section and using immunofluorescent staining,we statistically analyzed the expression of HMGB1.At the same time,we observed the transferring situation from cell nucleus to cytoplasm in the process of early traumatic brain injury by marking HMGB1 and neuronal specific marker(NeuN).Results HMGB1 expression of normal brain tissues was concentrated in nucleus.The number of HMGB1 positive cells in traumatic brain tissues was decreased at 12 h(P<0.05),which lasted to 72 h.The number of HMGB1 transferring from cell nucleus to cytoplasm was increased at 6 h(P<0.05)and reach the peak at 24 h after traumatic brain injury(P<0.05),which showed that with the prolonged time,the more number of HMGB1 transferred to cytoplasm.In early traumatic brain injury,HMGB1 mainly expressed in neurons(P>0.05)which were decreased gradually(P<0.05).We also found the number of HMGB1 transferring from nucleus to cytoplasm was significantly increased at 6 h(P<0.05),and peaked at 24~72 h(P<0.05).Conclusion The number of neurons’ death or apoptosis was decreased after TBI in human,and number of HMGB1 positive cells was also decreased.The ratio of HMGB1 transferring from nucleus into cytoplasm was significantly increased.HMGB1 may participate in the neurons’ death or apoptosis.

    Traumatic brain injury;High mobility group box 1;Neuron

    全軍青年基金項(xiàng)目(14QNP029)

    R-332

    A

    1673-5110(2017)09-0017-05

    △通訊作者:王本瀚,E-mail:wangbenhan@sina.com

    猜你喜歡
    胞漿挫裂傷人腦
    人腦擁有獨(dú)特的紋路
    針對(duì)雙額腦挫裂傷的治療策略的研究
    CT“李琦島征”和“黑洞征”對(duì)腦挫裂傷血腫擴(kuò)大的預(yù)測(cè)價(jià)值*
    讓人腦洞大開(kāi)的建筑
    讓人腦洞大開(kāi)的智能建筑
    高齡老年抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎性腎衰竭患者1例報(bào)道
    胞漿小滴、過(guò)量殘留胞漿與男性生育之間的關(guān)系
    肺組織胞漿菌病一例
    Sox2和Oct4在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及意義
    2013年全國(guó)175家臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體的比對(duì)分析
    国产伦一二天堂av在线观看| 精品久久久久久久久亚洲| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲欧洲国产日韩| 一级毛片久久久久久久久女| 久久精品国产亚洲网站| 日韩视频在线欧美| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美人与善性xxx| а√天堂www在线а√下载| 色综合亚洲欧美另类图片| 22中文网久久字幕| 国产一区二区三区av在线 | 99热网站在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 午夜a级毛片| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久久久伊人网av| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲av成人av| 成年女人看的毛片在线观看| 看免费成人av毛片| 色综合色国产| 小说图片视频综合网站| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 全区人妻精品视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 观看美女的网站| videossex国产| 国产精品一区www在线观看| 热99re8久久精品国产| 男人狂女人下面高潮的视频| 国内精品宾馆在线| 成人亚洲欧美一区二区av| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲在线自拍视频| 中文资源天堂在线| 亚洲经典国产精华液单| 悠悠久久av| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品久久久久久精品电影| 国产av不卡久久| 乱人视频在线观看| 欧美激情在线99| 男人的好看免费观看在线视频| 最近的中文字幕免费完整| 精品日产1卡2卡| av在线亚洲专区| 久久久午夜欧美精品| 国产一区二区激情短视频| 午夜免费激情av| 级片在线观看| 日本黄大片高清| 日韩三级伦理在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 天堂中文最新版在线下载 | 午夜老司机福利剧场| 在线播放国产精品三级| 成人亚洲欧美一区二区av| 色综合亚洲欧美另类图片| 午夜福利在线观看吧| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产免费男女视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 黄色视频,在线免费观看| 美女 人体艺术 gogo| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品野战在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 国产黄a三级三级三级人| 国产黄a三级三级三级人| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲成av人片在线播放无| 波野结衣二区三区在线| 桃色一区二区三区在线观看| 国产久久久一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 波野结衣二区三区在线| 男人舔奶头视频| 久久久成人免费电影| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日韩一区二区三区影片| 少妇熟女欧美另类| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品久久久久久久久免| 麻豆国产av国片精品| 亚州av有码| 中文字幕av成人在线电影| 久久热精品热| 亚洲精品自拍成人| 免费看a级黄色片| 国产真实伦视频高清在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 哪个播放器可以免费观看大片| 成年女人永久免费观看视频| 精品久久国产蜜桃| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品精品国产色婷婷| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产成人a∨麻豆精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产精品久久视频播放| 91麻豆精品激情在线观看国产| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | av卡一久久| 国产中年淑女户外野战色| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产激情偷乱视频一区二区| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲乱码一区二区免费版| 91麻豆精品激情在线观看国产| 乱人视频在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 直男gayav资源| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 免费观看精品视频网站| av福利片在线观看| 99久久精品热视频| 亚洲无线在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 午夜激情福利司机影院| 中文在线观看免费www的网站| 中出人妻视频一区二区| 亚洲在线自拍视频| 观看免费一级毛片| 欧美人与善性xxx| 岛国毛片在线播放| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲精品成人久久久久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久久久久久午夜电影| 性欧美人与动物交配| 高清在线视频一区二区三区 | 亚洲最大成人av| 精品欧美国产一区二区三| 晚上一个人看的免费电影| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 免费看光身美女| 国内精品美女久久久久久| 美女国产视频在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美xxxx性猛交bbbb| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲丝袜综合中文字幕| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲人成网站在线观看播放| a级一级毛片免费在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产成人a∨麻豆精品| av视频在线观看入口| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久国产乱子免费精品| 此物有八面人人有两片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产毛片a区久久久久| 麻豆成人av视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产高清三级在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 高清在线视频一区二区三区 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| av专区在线播放| 亚洲经典国产精华液单| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产精品一区二区性色av| 久久久久久久久久黄片| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲一区高清亚洲精品| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲电影在线观看av| 黄片wwwwww| 欧美性感艳星| a级毛色黄片| 老女人水多毛片| 色综合色国产| 欧美bdsm另类| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 欧美日韩乱码在线| 欧美成人一区二区免费高清观看| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲在线自拍视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 波多野结衣巨乳人妻| 女同久久另类99精品国产91| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久久久久久久大av| 一边亲一边摸免费视频| 国产高清有码在线观看视频| a级毛色黄片| 亚洲人成网站在线观看播放| 日本免费一区二区三区高清不卡| 丰满人妻一区二区三区视频av| 六月丁香七月| 中文字幕制服av| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 成人毛片60女人毛片免费| 五月玫瑰六月丁香| 一本一本综合久久| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产不卡一卡二| 国内精品宾馆在线| 看十八女毛片水多多多| 欧美精品国产亚洲| 成人亚洲精品av一区二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 成人漫画全彩无遮挡| 国产久久久一区二区三区| av在线蜜桃| 综合色av麻豆| 天堂网av新在线| 中文欧美无线码| 国产亚洲av嫩草精品影院| kizo精华| 99热只有精品国产| 久久久国产成人精品二区| 在线a可以看的网站| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 99久久人妻综合| 日韩人妻高清精品专区| 一区二区三区免费毛片| 欧美+日韩+精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产乱人视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产高清三级在线| 少妇丰满av| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产老妇女一区| 深爱激情五月婷婷| 亚洲国产精品国产精品| 免费av不卡在线播放| 久久这里只有精品中国| 国产亚洲精品久久久com| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日韩国内少妇激情av| 中文欧美无线码| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲精品456在线播放app| 特级一级黄色大片| 国产一区二区在线观看日韩| 好男人视频免费观看在线| 日本三级黄在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 看非洲黑人一级黄片| 一夜夜www| 成熟少妇高潮喷水视频| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| a级毛色黄片| 国产免费男女视频| 久久精品国产清高在天天线| 校园春色视频在线观看| 久久国产乱子免费精品| 日韩 亚洲 欧美在线| av天堂中文字幕网| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲18禁久久av| 欧美极品一区二区三区四区| 国产 一区精品| 久久久久网色| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 色吧在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲美女视频黄频| 中出人妻视频一区二区| 深夜a级毛片| 三级毛片av免费| 亚洲中文字幕日韩| 丝袜美腿在线中文| 日本熟妇午夜| or卡值多少钱| 在线国产一区二区在线| 国产成人福利小说| 青春草视频在线免费观看| 日日撸夜夜添| 日本三级黄在线观看| 美女大奶头视频| 久久人人爽人人片av| 国产午夜福利久久久久久| 性插视频无遮挡在线免费观看| 尾随美女入室| or卡值多少钱| 欧美潮喷喷水| 国产精品免费一区二区三区在线| 青春草国产在线视频 | 少妇的逼好多水| 人妻久久中文字幕网| 日韩一本色道免费dvd| 精品久久久久久久末码| 乱码一卡2卡4卡精品| 日本黄色视频三级网站网址| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 在线国产一区二区在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 在线观看美女被高潮喷水网站| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲色图av天堂| av免费在线看不卡| 男人的好看免费观看在线视频| 免费搜索国产男女视频| 校园春色视频在线观看| 亚洲成人av在线免费| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国模一区二区三区四区视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 99久久精品国产国产毛片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲国产精品国产精品| 日韩欧美精品v在线| 人妻少妇偷人精品九色| 身体一侧抽搐| 最近手机中文字幕大全| av福利片在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产成人一区二区在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产激情偷乱视频一区二区| АⅤ资源中文在线天堂| 成人美女网站在线观看视频| 我的女老师完整版在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| av国产免费在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 插逼视频在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 内射极品少妇av片p| 精品久久国产蜜桃| 日韩大尺度精品在线看网址| 五月玫瑰六月丁香| 国产色爽女视频免费观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 少妇熟女欧美另类| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 可以在线观看的亚洲视频| 日本黄色视频三级网站网址| 国产成人影院久久av| 婷婷亚洲欧美| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久久久久久久久成人| 免费看美女性在线毛片视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产一区二区激情短视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 在线免费观看的www视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| eeuss影院久久| 国产亚洲欧美98| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲电影在线观看av| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲经典国产精华液单| 国产成人a∨麻豆精品| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 麻豆成人av视频| 综合色av麻豆| 午夜免费男女啪啪视频观看| 九九热线精品视视频播放| 精品久久久噜噜| 亚洲欧洲国产日韩| 高清毛片免费看| 少妇被粗大猛烈的视频| 99久久成人亚洲精品观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲综合色惰| 国内精品久久久久精免费| 国产av不卡久久| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 少妇的逼水好多| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 欧美一区二区亚洲| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 99久久人妻综合| 亚洲综合色惰| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲最大成人av| 麻豆成人av视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 色综合色国产| 午夜福利视频1000在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久精品夜色国产| 深夜a级毛片| 中文字幕免费在线视频6| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲av.av天堂| 成人美女网站在线观看视频| 丰满乱子伦码专区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 欧美日韩乱码在线| 网址你懂的国产日韩在线| 嫩草影院入口| 日本黄大片高清| 51国产日韩欧美| 久久人人精品亚洲av| 精品日产1卡2卡| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产在线精品亚洲第一网站| 丰满乱子伦码专区| 欧美日韩国产亚洲二区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 岛国毛片在线播放| 校园人妻丝袜中文字幕| а√天堂www在线а√下载| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 九九热线精品视视频播放| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 午夜福利在线观看吧| 日本黄大片高清| 美女 人体艺术 gogo| 国产真实伦视频高清在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 天天躁日日操中文字幕| 免费黄网站久久成人精品| 国产乱人偷精品视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产精品一二三区在线看| 大型黄色视频在线免费观看| 国产人妻一区二区三区在| 看十八女毛片水多多多| 一级毛片久久久久久久久女| 乱码一卡2卡4卡精品| 精华霜和精华液先用哪个| 又爽又黄无遮挡网站| 日韩精品青青久久久久久| 毛片女人毛片| 国产精品一区二区在线观看99 | 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 午夜爱爱视频在线播放| 91久久精品电影网| 黄色欧美视频在线观看| 男人舔奶头视频| 一本一本综合久久| 夫妻性生交免费视频一级片| 免费看美女性在线毛片视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 97超视频在线观看视频| 国产v大片淫在线免费观看| av天堂在线播放| 成人av在线播放网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 在线观看美女被高潮喷水网站| 99riav亚洲国产免费| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 97热精品久久久久久| 国产精品不卡视频一区二区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 女人被狂操c到高潮| 日本五十路高清| 国产麻豆成人av免费视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日韩亚洲欧美综合| 一级黄色大片毛片| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲第一区二区三区不卡| 日韩高清综合在线| 欧美最新免费一区二区三区| 久久久久九九精品影院| 亚洲国产高清在线一区二区三| 男人的好看免费观看在线视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 91久久精品国产一区二区三区| 色5月婷婷丁香| 深爱激情五月婷婷| 赤兔流量卡办理| 黄色视频,在线免费观看| 一个人看视频在线观看www免费| 最近中文字幕高清免费大全6| 特级一级黄色大片| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久久久久久久久成人| 观看美女的网站| 亚洲最大成人中文| 综合色av麻豆| 日韩欧美在线乱码| 激情 狠狠 欧美| 亚洲国产精品合色在线| 青青草视频在线视频观看| 久久久久国产网址| 亚洲国产精品成人综合色| av福利片在线观看| 久久久色成人| 欧美+亚洲+日韩+国产| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产亚洲5aaaaa淫片| 夜夜夜夜夜久久久久| 村上凉子中文字幕在线| 最近的中文字幕免费完整| 日韩av不卡免费在线播放| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 色哟哟哟哟哟哟| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美区成人在线视频| 夜夜爽天天搞| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 国内精品一区二区在线观看| av在线播放精品| 尾随美女入室| 深爱激情五月婷婷| 18+在线观看网站| 黄色视频,在线免费观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 舔av片在线| 欧美高清成人免费视频www| 男女边吃奶边做爰视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 一级毛片久久久久久久久女| 免费观看在线日韩| 久久草成人影院| 久久久久久久久久黄片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美色视频一区免费| 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美最黄视频在线播放免费| 夜夜爽天天搞| av天堂在线播放| 最近最新中文字幕大全电影3| 免费看美女性在线毛片视频| 日本黄大片高清| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 三级经典国产精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲综合色惰| 亚洲,欧美,日韩| 99久久精品国产国产毛片| av免费观看日本| 成人一区二区视频在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 在线天堂最新版资源| 国产一级毛片在线| 国产精品三级大全| h日本视频在线播放| 最近的中文字幕免费完整| 日日撸夜夜添| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品一区www在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 91精品一卡2卡3卡4卡| 给我免费播放毛片高清在线观看| 美女大奶头视频| 日韩一区二区视频免费看| 久久午夜福利片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 天堂网av新在线| 久久韩国三级中文字幕| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国内精品久久久久精免费| 色播亚洲综合网| 日本五十路高清| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 毛片一级片免费看久久久久| 免费看a级黄色片| 成人综合一区亚洲| 亚洲高清免费不卡视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久久精品大字幕| 国产精品久久久久久av不卡| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 成人综合一区亚洲| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产成人a∨麻豆精品| 日本与韩国留学比较| 欧美最黄视频在线播放免费| videossex国产| 美女大奶头视频| 久久久久久久久中文| 一本一本综合久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久久久久久久久成人| 国产成人aa在线观看| 99热只有精品国产| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久精品久久久久久久性|