藥物難治性顳葉癲癇患者致癇灶組織中高遷移率族蛋白B1表達與致癇灶切除術遠期預后的關系*

郭電渠，王新軍，楊如意，武躍輝，王 振，謝井偉，梁 博，周少龍，李曉輝

1)鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450004 2)鄭州大學第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052 3)洛陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科 洛陽 471000

藥物難治性顳葉癲癇患者致癇灶組織中高遷移率族蛋白B1表達與致癇灶切除術遠期預后的關系*

郭電渠1)，王新軍2)#，楊如意2)，武躍輝2)，王 振2)，謝井偉2)，梁 博2)，周少龍2)，李曉輝3)

1)鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450004 2)鄭州大學第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052 3)洛陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科 洛陽 471000

#通信作者，男，1965年7月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：藥物難治性癲癇的外科治療，E-mail：wangxj@zzu.edu.cn

難治性癲癇；遠期預后；高遷移率族蛋白B1

目的：探討高遷移率族蛋白B1(HMGB1)在藥物難治性顳葉癲癇患者致癇灶組織中的表達與致癇灶切除術遠期預后的關系。方法：選取行致癇灶切除術的藥物難治性顳葉癲癇患者80例，術中留取致癇灶組織標本；選取同期行顱內(nèi)減壓術的患者20例為對照，術中留取顱內(nèi)減壓的正常腦組織標本。免疫組化法檢測腦組織中HMGB1的表達水平?；颊咝g后隨訪2 a，分析預后影響因素。結果：癲癇患者致癇灶組織中HMGB1陽性表達率(100%)高于對照組(25%)(P<0.001)；患者術前癲癇病程>3 a[OR(95%CI)=3.999(1.535～10.417)]、致癇灶組織中HMGB1強陽性表達[OR(95%CI)=3.483(1.459～8.317)]是藥物難治性顳葉癲癇患者術后2 a癲癇控制不佳的獨立危險因素。結論：HMGB1可能成為藥物難治性顳葉癲癇發(fā)病機制、診療研究、預后評估的新靶點。

藥物難治性癲癇指經(jīng)兩種或兩種以上抗癲癇藥物正規(guī)治療2 a以上且血藥濃度處于有效范圍內(nèi)，仍不能完全控制癲癇的發(fā)作；在我國近600萬的癲癇患者中，20%～30%為藥物難治性癲癇[1-2]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)是一種廣泛存在于真核細胞內(nèi)的非組蛋白染色體結合蛋白[3],參與多種細胞生理過程。在細胞核內(nèi)，HMGB1參與穩(wěn)定核小體，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄；在細胞質(zhì)和細胞外，HMGB1與多種受體結合，如Toll樣受體4(toll-like receptor-4,TLR4)、TLR2和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)，參與炎癥反應、細胞分化、增殖、遷移以及抗腫瘤免疫反應等[4-6]。研究[7]表明，HMGB1-TLR4軸在小鼠急性癲癇發(fā)作的超早期及慢性癲癇模型中發(fā)揮重要作用。作者對藥物難治性顳葉癲癇患者致癇灶組織中HMGB1的表達及其與致癇灶切除術遠期預后的關系進行了探討。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年1月1日至2013年1月1日于鄭州大學第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科行致癇灶切除術的藥物難治性顳葉癲癇患者80例為癲癇組。納入標準：①患者術前均有典型癲癇發(fā)作癥狀，術前長程視頻腦電監(jiān)測、術中皮層腦電監(jiān)測均發(fā)現(xiàn)固定、局限的顳葉致癇灶。②用2種或2種以上一線抗癲癇藥物且血藥濃度處于有效范圍內(nèi)、治療2 a以上，癲癇仍不能完全控制且無手術禁忌者。③既往史、家族史、個人史及影像學檢查排除繼發(fā)性癲癇。80例中男44例，女36例，手術年齡7～66歲；致癇灶位于左顳葉者39例，位于右顳葉者41例；術前癲癇發(fā)作時間30 s～23 min，平均5 min；術前癲癇發(fā)作頻率1～12次/月，平均3次/月；癲癇發(fā)作類型為部分性發(fā)作17例，全身性發(fā)作35例，混合性發(fā)作28例；病程2～27 a，平均3 a。

選取同期于該院行顱內(nèi)減壓術的20例患者為對照組，患者均無癲癇病史，均因高血壓腦出血行顱內(nèi)減壓術，術中確認可留取非功能區(qū)腦組織。所有患者的腦組織留取均已獲該院倫理委員會批準及患者、家屬知情同意。

1.2 標本采集 癲癇組術中打開硬腦膜后在麻醉師配合下減輕麻醉劑量，對顳葉皮層進行腦電監(jiān)測確認致癇灶區(qū)域，手術切除，在保留足夠病理檢測標本前提下，留取直徑約1 cm的包括白質(zhì)、灰質(zhì)的腦組織標本塊3份；對照組術中亦留取直徑約1 cm的包括白質(zhì)、灰質(zhì)的非功能區(qū)腦組織標本塊3份；于凍存管內(nèi)液氮凍存，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存。

1.3 腦組織標本中HMGB1的檢測 兔抗人HMGB1單克隆抗體購自美國Sigma公司，羊抗兔二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒購自上海拜沃生物科技有限公司；Nikon熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。標本包埋后以3 μm厚連續(xù)切片，置于防脫劑預處理后的載玻片上，滴加HMGB1單克隆抗體(抗體稀釋度1:20)4 ℃過夜，PBS清洗后滴加生物素標記的二抗室溫孵育20 min，PBS清洗，加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液室溫孵育15 min，DAB顯色，沖洗，蘇木精復染，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照。結果判定：陽性細胞表現(xiàn)為細胞質(zhì)黃色著色。每張切片選擇免疫反應較強的區(qū)域，高倍(×400)視野下觀察5個不重復視野。計數(shù)陽性細胞及視野內(nèi)總細胞數(shù)，染色率=(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%；無陽性細胞計為0分，染色率≤25%為1分，25%～為2分，50%～為3分，>75%為4分。再依據(jù)染色程度評分：無染色為0分，淡黃色為1分，深黃色為2分。兩種評分相加為最終得分，0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～6分為強陽性。

1.4 癲癇組術后隨訪與療效評定 癲癇組患者出院后均遵醫(yī)囑規(guī)律口服抗癲癇藥物并定期復診，根據(jù)發(fā)作情況、腦電圖調(diào)整用藥。術后隨訪2 a，采用改良Engel分級標準進行預后評估：無影響功能的癲癇發(fā)作(除外術后早期的發(fā)作)為EngelⅠ級，僅有稀少的影響功能的癲癇發(fā)作為EngelⅡ級，癲癇發(fā)作得到相當改善為EngelⅢ級，改善不明顯為EngelⅣ級。

1.5 統(tǒng)計學處理 利用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學處理。兩組腦組織中HMGB1陽性表達率的比較采用精確概率法，不同臨床病理特征癲癇患者預后的比較采用χ2檢驗，采用logistic回歸分析篩選遠期預后的影響因素，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 兩組患者腦組織中HMGB1表達情況的比較

HMGB1免疫組化染色表現(xiàn)見圖1。癲癇組致癇灶腦組織中HMGB1強陽性表達44例，弱陽性表達36例；對照組強陽性表達1例，弱陽性表達4例。致癇灶組織中HMGB1陽性表達率(100%)明顯高于對照組(25%)(P<0.001)。

A：HMGB1陰性；B：HMGB1陽性；C：HMGB1強陽性。圖1 HMGB1的免疫組化染色表現(xiàn)(SP,×400)

2.2 不同臨床病理特征的癲癇患者遠期預后的比較 80例患者隨訪資料完整，其中術后2 a癲癇發(fā)作達到EngelⅠ級者56例，EngelⅡ～Ⅳ級者24例(EngelⅡ級12例，EngelⅢ級7例，EngelⅣ級5例)。遠期預后與術前癲癇發(fā)作時間、癲癇發(fā)作頻率、癲癇發(fā)作類型、病程、致癇灶腦組織中HMGB1的表達水平有關，而與患者性別、手術年齡、致癇灶位置無關，詳見表1。

2.3 癲癇患者遠期預后影響因素分析 以患者遠期預后為因變量，以患者性別、手術年齡、致癇灶位置、癲癇發(fā)作時間、癲癇發(fā)作頻率、癲癇發(fā)作類型、術前病程、致癇灶組織中HMGB1表達為自變量進行l(wèi)ogistic回歸分析，變量賦值見表2，回歸結果見表3。最終術前病程>3 a和致癇灶組織中HMGB1強陽性表達是藥物難治性顳葉癲癇患者術后2 a癲癇控制不佳的獨立危險因素。

表1 不同臨床病理特征的癲癇患者遠期預后的比較 例

表2 變量賦值表

表3 Logistic回歸結果

3 討論

近年來研究表明，HMGB1與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，如鼻咽癌[8]、黑色素瘤[9]、膠質(zhì)瘤[10-11]等。膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的高表達與癥狀性癲癇的發(fā)生關系密切[12]。Maroso等[7]研究表明癲癇模型小鼠腦組織中HMGB1高表達，HMGB1或其受體TLR4的拮抗劑可減輕癲癇發(fā)作程度。

該研究發(fā)現(xiàn)，藥物難治性顳葉癲癇患者致癇灶組織中HMGB1陽性表達率明顯高于正常腦組織，致癇灶組織中HMGB1表達水平與術后2 a預后關系密切，高表達者手術的遠期預后不佳，表明HMGB1可能在致癇灶形成、癲癇發(fā)作中起到重要作用。致癇灶組織中小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元變性后可釋放大量HMGB1，作用于細胞膜上的受體TLR4、RAGE，活化COX-2、NF-κB，介導炎癥反應；神經(jīng)元中HMGB1-TLR4炎癥反應通路可通過酪氨酸激酶調(diào)節(jié)的磷酸化作用引起Ca2+的大量釋放，導致神經(jīng)元細胞內(nèi)外離子失衡，形成異常放電，異常放電達到一定閾值就會出現(xiàn)癲癇發(fā)作[13]。HMGB1-TLR4介導的炎癥反應越強烈，越易產(chǎn)生密集異常腦電的發(fā)放與傳導，使得癲癇發(fā)作頻率增加，發(fā)作時間延長。

該研究還發(fā)現(xiàn)，術前病程>3 a是藥物難治性顳葉癲癇術后2 a癲癇控制不佳的獨立危險因素。有研究[14]報道，病程越長，患者術后預后越差，其原因可能為大量異常放電同步化時出現(xiàn)癲癇發(fā)作，這些異常放電會對致癇灶周圍及傳導通路周圍的正常神經(jīng)元產(chǎn)生干擾，久之會使致癇灶區(qū)域擴大甚至出現(xiàn)遠隔部位的新致癇灶，形成多灶性癲癇，其定位難度及手術難度增大，手術治療預后不佳。故建議藥物難治性顳葉癲癇患者宜早期手術以改善預后。

綜上所述，HMGB1作為一種炎癥因子，可能通過介導顱內(nèi)局部慢性炎癥參與癲癇發(fā)作，影響患者致癇灶切除術的遠期預后。HMGB1可能成為評估藥物難治性癲癇患者致癇灶切除術遠期預后的新指標，為難治性癲癇的發(fā)病機制、診療研究提供了新的方向。

[1]FARRELL K,WIRRELL E,WHITING S.The definition and prediction of intractable epilepsy in children[J].Adv Neurol,2006,97:435

[2]KWAN P,ARZIMANOGLOU A,BERG AT,et al.Definition of drug resistant epilepsy: consensus proposal by the ad hoc Task Force of the ILAE Commission on Therapeutic Strategies[J].Epilepsia,2010,51(6):1069

[3]ELLERMAN JE,BROWN CK,DE VERA M,et al.Masquerader:high mobility group box-1 and cancer[J].Clin Cancer Res,2007,13(10):2836

[4]TANG D,KANG R,ZEH HJ 3RD,et al．High-mobility group box 1 and cancer[J]．Biochim Biophys Acta,2010,1799(1/2):131

[5] SIMS GP,ROWE DC,RIETDIJK ST,et al．HMGB1 and RAGE in inflammation and cancer[J]．Annu Rev Immunol,2010,28:367

[6]YANG H,TRACEY KJ.Targeting HMGB1 in inflammation[J].Biochim Biophys Acta,2010,1799(1/2):149

[7]MAROSO M,BALOSSO S,RAVIZZA T,et al.Toll-like receptor 4 and high-mobility group box-1 are involved in ictogenesis and can be targeted to reduce seizures[J].Nat Med,2010,16(4):413

[8]WU D,DING Y,WANG S,et al.Increased expression of high mobility group box 1(HMGB1) is associated with progression and poor prognosis in human nasopharyngeal carcinoma[J].J Pathol,2008,216(2):167

[9]POSER I,GOLOB M,BUETTNER R,et al.Upregulation of HMG1 leads to melanoma inhibitory activity expression in malignant melanoma cells and contributes to their malignancy phenotype[J].Mol Cell Biol,2003,23(8):2991

[10]WANG XJ,ZHOU SL,FU XD,et al.Clinical and prognostic significance of high-mobility group box-1 in human gliomas[J].Exp Ther Med,2015,9(2):513

[11]王新軍,楊如意,周少龍,等.膠質(zhì)瘤相關性癲癇致癇灶組織中高遷移率族蛋白 B1的表達[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2015,50(5):634

[12]王新軍,楊如意,單嶠.等 膠質(zhì)瘤相關性癲癇瘤組織中高遷移率族蛋白B1表達與癇性發(fā)作[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2015,41(3):155

[13]IORI V,MAROSO M,RIZZI M,et al.Receptor for advanced glycation endproducts is upregulated in temporal lobe epilepsy and contributes to experimental seizures[J].Neurobiol Dis,2013,58(10):102

[14]LEE SA,YIM SB,LIM YM,et al.Factors predicting seizure outcome of anterior temporal lobectomy for patients with mesial temporal sclerosis[J].Seizure,2006,15(6):397

(2016-07-10收稿 責任編輯王 曼)

Correlation of HMGB1 expression in epileptogenic focus tissue from temporal lobe intractable epilepsy patients and postoperative long-term prognosis

GUODianqu1),WANGXinjun2),YANGRuyi2),WUYuehui2),WANGZhen2),XIEJingwei2),LIANGBo2),ZHOUShaolong2),LIXiaohui3)

1)DepartmentofNeurosurgery,theFirstPeople′sHospitalofZhengzhouCity,Zhengzhou450004 2)DepartmentofNeurosurgery,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)DepartmentofNeurosurgery,LuoyangCityCentralHospital,Luoyang，Henan471000

intractable epilepsy;long-term prognosis;high mobility group box 1

Aim: To explore the correlation of HMGB1 expression in epileptogenic focus tissue of temporal lobe intractable epilepsy patients and prognosis after resection of epileptogenic focus. Methods: The epileptogenic focus tissue from 80 temporal lobe intractable epilepsy patients undergoing resection of epileptogenic focus(experimental group) and the normal brain tissue from 20 patients undergoing intracranial decompression(control group) were collected to detect HMGB1 expression by immunohistological method. Epilepsy patients were followed up for 2 years after operation. Results: Positive expression rate of HMGB1 in experimental group(100%) was higher than that(25%) in control group(P<0.001). Course of preoperative epilepsy>3 years(OR=3.999,95%CI=1.535-10.417) and high expression of HMGB1 in epileptogenic focus tissue(OR=3.483,95%CI=1.459-8.317) were the independent factors impacting the prognosis of intractable epilepsy patients 2 years after operation.Conclusion: HMGB1 may become a new biomarker to study pathogenesis, diagnosis and treatment as well as evaluate prognosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.017

*河南省教育廳重點科技攻關項目 092102310090；鄭州市科技創(chuàng)新領軍人才項目 121PLJRC536

R742.1