蘿卜硫素對結(jié)直腸癌SW620細胞增殖、凋亡及遷移的影響*

羅真真，張 震，喬亞敏，陳新峰，黃 嵐，張 毅

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物治療中心 鄭州 450052 3)河南省腫瘤免疫治療工程技術(shù)研究中心 鄭州 450052 4)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

蘿卜硫素對結(jié)直腸癌SW620細胞增殖、凋亡及遷移的影響*

羅真真1,2,3)，張 震1,2,3)，喬亞敏1,2,3)，陳新峰1,2,3)，黃 嵐1,2,3)，張 毅1,2,3,4)#

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物治療中心 鄭州 450052 3)河南省腫瘤免疫治療工程技術(shù)研究中心 鄭州 450052 4)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

#通信作者，男，1964年4月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤免疫學、腫瘤干細胞和生物細胞治療，E-mail：yizhang@zzu.edu.cn

蘿卜硫素;結(jié)直腸癌;SW620細胞；STAT3;NF-κB;MMP

目的：觀察蘿卜硫素(SFN)對結(jié)直腸癌SW620細胞增殖、凋亡及遷移的影響，并探討其可能的作用機制。方法：采用CCK-8法檢測0、5、10、15、20 μmol/L SFN處理48、72 h對SW620細胞增殖能力的影響，采用流式細胞術(shù)檢測0、5、10、15、20 μmol/L SFN處理24、48 h對SW620細胞凋亡的影響，采用細胞劃痕實驗觀察20 μmol/L SFN處理24 h對SW620細胞遷移的影響，并采用Western blot法檢測細胞中STAT3、NF-κB、p-STAT3、p-NF-κB及MMP-2、MMP-9蛋白的表達。結(jié)果：隨著SFN濃度的升高，SW620細胞增殖受到抑制，細胞凋亡率升高(P<0.05)。同時20 μmol/L SFN可明顯減弱SW620細胞的遷移能力，降低p-STAT3、p-NF-κB與MMP-2及MMP-9蛋白的表達(P<0.05)。結(jié)論：SFN抑制SW620細胞增殖、促進其凋亡的機制可能與降低p-STAT3、p-NF-κB的表達有關(guān)，抑制侵襲及轉(zhuǎn)移的機制可能與其降低MMP-2及MMP-9蛋白的表達有關(guān)。

結(jié)直腸癌是最常見的胃腸道腫瘤，其5 a生存率較低，發(fā)現(xiàn)時大多已處于晚期，且復發(fā)率較高[1]。目前常用的化療藥物如5-FU和絲裂霉素等臨床療效尚不能令人滿意，且伴有很強的毒副作用，嚴重影響患者生活質(zhì)量[2]。因此，開發(fā)療效確切且毒副作用較小的新藥迫在眉睫。植物類抗腫瘤藥物如姜黃素、蘿卜硫素(sulfraphane，SFN)等，以其抗腫瘤效果明確、毒副反應少、可增強機體的抗病能力以及減少術(shù)后復發(fā)、轉(zhuǎn)移等優(yōu)點逐漸引起人們的關(guān)注[3-4]。SFN亦稱萊菔硫烷，提取自西蘭花、芥藍、北方圓紅蘿卜等十字花科植物。有研究[5]表明，SFN具有很強的抗癌防癌作用，它在體外能夠抑制腫瘤細胞的增殖，引起腫瘤細胞的凋亡和細胞阻滯，誘導人體內(nèi)的Ⅱ相代謝酶，同時抑制Ⅰ相代謝酶的產(chǎn)生，最終通過多種酶體系排出致癌物和自由基等有害成分。然而,SFN抗癌作用機制目前尚未完全了解。作者通過體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌SW620細胞株，觀察SFN對SW620細胞增殖、凋亡及遷移能力的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SW620細胞購于中國科學院細胞所；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購于Gibco公司；SFN、胰蛋白酶、膜連蛋白-異硫氫酸熒光素(Annexin V-FITC)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自美國Sigma公司；STAT3、p-STAT3、NF-κB、p-NF-κB、MMP-2、MMP-9、β-actin抗體購于CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng) SW620細胞采用含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔2 d傳代1次，選取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的SW620細胞，以5×104mL-1的密度接種至96孔板，每孔100 μL。貼壁后分別加0、5、10、15、20 μmol/L 的SFN，每個藥物濃度組設5個復孔。分別培養(yǎng)48及72 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，避光孵育2 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長450 nm處測定光密度值，取均值，表示細胞增殖能力。實驗重復3次。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的SW620細胞，以4.0×105mL-1密度接種于12孔板,每孔1 mL。貼壁后分別加入濃度為0、5、10、15、20 μmol/L的SFN，分別培養(yǎng)24及48 h后，胰蛋白酶消化細胞，1 500 r/min離心，棄上清。 PBS重懸細胞，離心洗滌2次，加入200 μL Binding Buffer和1 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min。上機前再加入PI染液2 μL，立即上機檢測，計算細胞凋亡率。實驗重復5次。

1.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取對數(shù)生長期的SW620細胞，以5×105個/孔接種于6孔板，加入2 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后細胞長滿單層，用10 μL槍頭在中間劃一橫線，分2組，分別加入20 μmol/L SFN和同等體積DMSO(對照組)，0、24 h后分別觀察照相，使用圖像處理軟件測量劃痕寬度。劃痕愈合度=(0 h 劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復5次。

1.6 Western blot法檢測凋亡及侵襲相關(guān)蛋白的表達 取對數(shù)生長期的SW620細胞，調(diào)整細胞密度至4.0×105mL-1，接種于6孔板，總體積2 mL。待細胞貼壁后，分2組，分別加入20 μmol/L SFN和同等體積DMSO(對照組)。培養(yǎng)24 h后，收集懸浮及貼壁的細胞，加入細胞裂解液，提取蛋白，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液。使用BCA法檢測蛋白濃度，加入4×Loading Buffer蛋白上樣緩沖液，煮沸 10 min后上樣，每孔上樣量保證為30 μg。使用含體積分數(shù)5% BSA的TBS將一抗(STAT3、p-STAT3、NF-κB、p-NF-κB、MMP-2、MMP-9、β-actin)稀釋至合適濃度，4 ℃過夜，二抗封閉孵育1 h，TBST 清洗3次，每次 5 min,ECL發(fā)光液孵育后，應用凝膠成像系統(tǒng)拍照，以目的蛋白與β-actin灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析以及LSD-t檢驗比較不同濃度的SFN處理不同時間細胞增殖能力、凋亡率的差異，采用兩獨立樣本t檢驗比較對照組和20 μmol/L SFN處理組劃痕愈合度以及STAT3、p-STAT3、NF-κB、p-NF-κB、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度SFN對SW620細胞增殖能力的影響 結(jié)果見表1。由表1可知，作用48和72 h，隨SFN濃度的增加，SW620細胞增殖能力均呈降低的趨勢。

表1 SFN對SW620細胞增殖能力的影響

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05;#：與5 μmol/L組相比，P<0.05;△:與10 μmol/L組相比，P<0.05。

2.2 不同濃度SFN對SW620細胞凋亡的影響

結(jié)果見表2。由表2可知，作用24 h和48 h，隨SFN濃度的增加，SW620細胞凋亡率呈升高的趨勢。

表2 SFN對SW620細胞凋亡率的影響 %

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05；#：與5 μmol/L組相比，P<0.05；△：與10 μmol/L組相比，P<0.05;☆:與15 μmol/L組相比，P<0.05。

2.3 SFN對SW620細胞遷移能力的影響 20 μmol/L SFN處理組劃痕愈合度為(32.681±4.620)%，較對照組[(67.271±5.531)%]明顯降低(t=10.734,P<0.001)。

2.4 SFN對SW620細胞凋亡及侵襲相關(guān)蛋白表達的影響 20 μmol/L SFN處理細胞24 h后，SW620細胞STAT3、NF-κB的表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，p-STAT3、p-NF-κB、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平較對照組下降。結(jié)果見圖1及表3。

1：對照組；2：20 μmol/L SFN處理組。圖1 SFN對SW620細胞凋亡及侵襲相關(guān)蛋白表達水平的影響

表3 2組細胞中STAT3、p-STAT3、NF-κB、p-NF-κB、MMP-2與MMP-9蛋白的表達

3 討論

Hanahan等[6]總結(jié)和提出了腫瘤十大特征，包括細胞無限增殖，抑制細胞死亡，誘導血管生成以及激活侵襲和轉(zhuǎn)移，炎癥促進腫瘤等。與其他人源性腫瘤的研究結(jié)果[7-8]相似，該實驗結(jié)果表明SFN可有效促進結(jié)直腸癌SW620細胞凋亡，抑制其增殖及遷移能力。

此外，該研究結(jié)果還顯示SFN可顯著降低結(jié)直腸癌細胞中STAT3和NF-κB的磷酸化水平，抑制STAT3及NF-κB信號通路。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，STAT3具有信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活雙重作用，通過介導炎癥因子的過表達并抑制腫瘤特異性免疫應答，誘導腫瘤發(fā)生發(fā)展。而NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與機體免疫應答、炎癥反應，并調(diào)控多種功能基因的表達。此外，異?；罨腘F-κB既可導致細胞周期調(diào)節(jié)失控，還可通過上調(diào)促細胞存活基因和抗凋亡基因表達，從而保護細胞免于凋亡，同時也與腫瘤細胞遷移、擴散與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11-12]。SFN可能通過降低STAT3、NF-κB的磷酸化水平，從而促進SW620細胞凋亡，抑制其增殖。

臨床觀察表明，癌細胞轉(zhuǎn)移是大多數(shù)惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一，因此，癌細胞浸潤與轉(zhuǎn)移是抗腫瘤機制研究的重點，也是許多研究關(guān)注的熱點。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個多步驟的過程，原發(fā)部位腫瘤需穿透基底膜才能侵入血管或淋巴管。MMPs可特異性降解基底膜中的有效成分及細胞外基質(zhì)，從而破壞基底膜，為癌細胞浸潤與轉(zhuǎn)移排除了首要障礙；還可通過促進毛細血管新生等促進腫瘤細胞的生長及擴散[13]。MMP-2及MMP-9作為MMP家族成員，有報道[14]顯示其表達異常與結(jié)直腸惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。該實驗中，20 μmol/L SFN處理后，SW620細胞的遷移能力減弱，同時MMP-2及MMP-9蛋白的表達水平降低，推測SFN抑制SW620細胞侵襲遷移能力的機制可能與降低MMP-2及MMP-9蛋白的表達有關(guān)。

綜上所述，SFN在體外可抑制結(jié)直腸癌細胞SW620增殖、促進其凋亡，同時可減弱SW620細胞的遷移能力，推測SFN降低p-STAT3、p-NF-κB與MMP-2、MMP-9蛋白的表達可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的機制之一，為SFN在結(jié)直腸癌治療的臨床應用提供了實驗基礎。

[1]TORRE LA,SIEGEL RL,WARD EM,et al.Global cancer incidence and mortality rates and trends:an update[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2016,25(1):16

[2]楊曉利,王峰, 夏金,等.替吉奧或卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑一線治療晚期結(jié)直腸癌效果對比分析[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2013,48(5):687

[3]KUPPUSAMY P,YUSOFF MM,MANIAM GP,et al.Nutraceuticals as potential therapeutic agents for colon cancer:a review[J].Acta Pharm Sin B,2014,4(3):173

[4]單延紅,張海軍,徐志剛,等.姜黃素聯(lián)合人類細胞因子誘導的殺傷細胞對卵巢癌細胞增殖的抑制作用及其機制[J].吉林大學學報(醫(yī)學版),2011,37(2):220

[5]HOUGHTON CA,FASSETT RG,COOMBES JS.Sulforaphane:translational research from laboratory bench to clinic[J].Nutr Rev,2013,71(11):709

[6]HANAHAN D,WEINBERG RA.Hallmarks of cancer:the next generation[J].Cell,2011,144(5):646

[7]朱海鵬.蘿卜硫素對 LNCaP 細胞增殖、周期、凋亡及 IGFBP-3、NF-κB表達的影響[J]. 鄭州大學學報(醫(yī)學版), 2014, 49(6): 801

[8]TUORKEY MJ.Cancer therapy with phytochemicals: present and future perspectives[J].Biomed Environ Sci,2015,28(11):808

[9]BROMBERG J,DARNELL JE Jr.The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function[J].Oncogene,2000,19(21):2468

[10]李春雨,趙海龍.核轉(zhuǎn)錄因子STAT3及其在結(jié)直腸癌中的應用價值[J].中國醫(yī)科大學學報,2015,44(1):1

[11]SAKAMOTO K,MAEDA S,HIKIBA Y,et al.Constitutive NF-kappaB activation in colorectal carcinoma plays a key role in angiogenesis, promoting tumor growth[J].Clin Cancer Res,2009,15(7):2248

[12]HORST D,BUDCZIES J,BRABLETZ T,et al.Invasion associated up-regulation of nuclear factor kappaB target genes in colorectal cancer[J].Cancer,2009,115(21):4946

[13]KRARUP PM,ELD M,HEINEMEIER K,et al.Expression and inhibition of matrix metalloproteinase(MMP)-8,MMP-9 and MMP-12 in early colonic anastomotic repair[J].Int J Colorectal Dis,2013,28(8):1151

[14]KESSENBROCK K,PLAKS V,WERB Z.Matrix metalloproteinases:regulators of the tumor microenvironment[J].Cell,2010,141(1):52

(2016-08-08收稿 責任編輯徐春燕)

Effects of sulforaphane on proliferation,apoptosis and migration of SW620 cells

LUOZhenzhen1,2,3),ZHANGZhen1,2,3),QIAOYamin1,2,3),CHENXinfeng1,2,3),HUANGLan1,2,3),ZHANGYi1,2,3,4)

1)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Bio-therapyCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)EngineeringandTechnologyResearchCenterforTumorImmunotherapyofHenanProvince,Zhengzhou450052 4)SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

sulforaphane;colorectal cancer;SW620 cell;STAT3;NF-κB;MMP

Aim: To observe the effects of sulforaphane(SFN) on proliferation, apoptosis, and migration of SW620 cellsinvitroand to explore the potential mechanism involved.Methods: SW620 cells were treated with 0，5，10，15，20 μmol/L SFN for 48，72 h and the cell proliferation was detected by CCK-8 kit. SW620 cells were treated with 0，5，10，15，20 μmol/L SFN for 24，48 h and the cell apoptosis was detected by flow cytometry. SW620 cells were treated with 20 μmol/L SFN for 24 h, the migration capability was measured by the wound healing test, and the protein expression levels of STAT3, p-STAT3, NF-κB, p-NF-κB, MMP-2 and MMP-9 were determined by Western blot. Results: SFN significantly reduced the proliferation and increased apoptosis in a dose-dependent manner(P<0.05). The ability of migration was significantly inhibited by 20 μmol/L SFN(P<0.05),and the expressions of p-STAT3, p-NF-κB, MMP-2, and MMP-9 protein were significantly down-regulated(P<0.05). Conclusion: It is indicated that SFN could inhibit the proliferation and the ability of migration, and induce apoptosis of SW620 cells, which may be related with its down-regulating the expressions of p-STAT3, p-NF-κB, MMP-2 and MMP-9 protein.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.010

*河南省科技廳基礎與前沿技術(shù)研究基金 112300410153，122300410155

R735.3