上調(diào)FOXC1的表達對SKOV3細胞增殖及侵襲的影響*

任琛琛，劉泇希，楊 立，薛景戈，李飛燕，劉 靈，李 靜，白 楊

鄭州大學第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

上調(diào)FOXC1的表達對SKOV3細胞增殖及侵襲的影響*

任琛琛△，劉泇希，楊 立，薛景戈，李飛燕，劉 靈，李 靜，白 楊

鄭州大學第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

△女，1968年11月生，博士，教授，研究方向：婦科腫瘤，E-mail：renchenchen1106@126.com

SKOV3細胞；FOXC1；增殖；侵襲

目的：探討上調(diào)FOXC1的表達對卵巢漿液性腺癌SKOV3細胞增殖及侵襲的影響。方法：分別以重組FOXC1慢病毒、慢病毒空載體穩(wěn)定感染SKOV3細胞(實驗組和載體對照組)，并以未感染慢病毒的SKOV3細胞為空白對照組，分別應用qRT-PCR和Western blot法檢測3組細胞中FOXC1 mRNA和蛋白的表達情況，應用CCK-8法檢測3組細胞接種24、48、72 h后的增殖能力，用Transwell小室檢測接種24 h細胞的體外侵襲能力。結果：實驗組SKOV3細胞FOXC1 mRNA及蛋白的表達均較載體對照組及空白對照組升高(P<0.05)。與空白對照組及載體對照組相比，實驗組SKOV3細胞感染不同時間的增殖活性均降低，侵襲能力亦降低(P<0.05)。結論：上調(diào)FOXC1的表達能夠抑制SKOV3細胞的增殖及侵襲能力。

卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤之一，其中卵巢漿液性腺癌是EOC中最常見的病理類型[1]。由于發(fā)病隱匿，多數(shù)EOC患者就診時已是晚期，目前在發(fā)達國家EOC的病死率居婦科腫瘤之首[2]。因此，了解EOC的發(fā)病機制對早期診斷及有效治療至關重要。FOXC1是叉頭框(forkhead box,FOX)家族的一員，通過自身的叉頭區(qū)DNA結合域結合目的基因片段啟動轉錄。目前已知FOXC1在胚胎發(fā)育和眼睛發(fā)育的調(diào)節(jié)中具有重要作用，其基因突變可導致人類Axenfeld-Rieger畸形等疾病[3]。近年來發(fā)現(xiàn)FOXC1除了參與細胞或器官分化及代謝等生物學過程外，還可能與多種腫瘤(乳腺癌、肝癌、胃癌等)的發(fā)生發(fā)展也密切相關[4-6]。研究[7-8]表明：FOXC1在不同病理分型的EOC組織中的陽性表達率存在差異，提示FOXC1可能參與了EOC的發(fā)生發(fā)展甚至轉移過程，但具體的生物學功能尚不明確。為進一步了解FOXC1在EOC惡性生物學行為中的作用，該研究應用慢病毒感染卵巢漿液性囊腺癌細胞SKOV3，外源性上調(diào)FOXC1后，觀察SKOV3細胞增殖及侵襲力的變化，為進一步探討FOXC1在EOC發(fā)生發(fā)展中的生物學功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 SKOV3細胞株由第四軍醫(yī)大學病原生物學教研室趙亞教授惠贈。FOXC1多克隆抗體(ab5079)購自英國Abcam公司，RPMI 1640培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自美國Hyclone公司。FOXC1慢病毒過表達質(zhì)粒(p-EGFP-慢病毒過表達質(zhì)粒)、qPCR引物及All-in-OneTMqPCR Mix檢測試劑盒均購自美國GeneCopoeiaTM公司。Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)凝膠購自Sigma公司。CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司。

1.2 慢病毒感染及穩(wěn)定株的篩選 以7×104個/孔的密度將SKOV3細胞接種于24孔板。每孔分別加入滴度為5×108Tu/mL FOXC1慢病毒過表達質(zhì)粒的慢病毒顆粒(實驗組)10 μL后再加入聚凝胺，至終濃度為5 mg/L，搖動混勻后放入37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。同樣設置載體對照組(感染慢病毒空載體)、空白對照組(未感染慢病毒的SKOV3細胞)。12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。72 h后使用終質(zhì)量濃度為2 mg/L嘌呤霉素篩選培養(yǎng)1周。在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光，直至抗藥克隆出現(xiàn)，繼續(xù)培養(yǎng)至克隆融合，隨后用胰蛋白酶消化，傳代至新的培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)及擴培，用于后續(xù)實驗。

1.3 qRT-PCR檢測3組細胞FOXC1 mRNA的表達水平 Trizol法提取3組細胞總RNA，反轉錄合成cDNA。按照All-in-OneTMqPCR Mix檢測試劑盒說明書進行qRT-PCR檢測。FOXC1引物序列：上游5’-CTTCTTCCTTGCCTCTCA-3’，下游5’-TCCACGA CATCCAACTAC-3’。 GAPDH引物序列:上游5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’,下游5’-GGTG GAATCATATTGGAACA-3’。反應體系為20 μL，反應條件：95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,35個循環(huán)。每個樣品設置3個復孔，檢測結果取平均值后根據(jù)公式2-ΔΔCT計算FOXC1 mRNA的相對表達水平。實驗重復3次。

1.4 Western blot法檢測3組細胞FOXC1蛋白的表達水平 將3組細胞分別接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，細胞密度達到90%后在冰上采用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。以50 μg蛋白上樣量進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后濕轉法轉移蛋白至PVDF膜。加入50 g/L脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉2 h,TBST洗滌3次。分別加一抗(FOXC1多克隆抗體按1:1 000稀釋，β-actin單抗按1:5 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日應用TBST洗膜3次，加FITC標記的二抗(按1:2 000稀釋)室溫避光孵育2 h。TBST洗膜3次，應用CLX Odyssey掃描儀掃描PVDF膜，系統(tǒng)軟件自動生成灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算FOXC1蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.5 CCK-8法檢測接種不同時間后3組細胞的增殖情況 取處于對數(shù)生長期的3組SKOV3細胞，以3×103個/孔接種于96孔板，每組均設置5個平行孔。在接種后的0、24、48、72 h，用CCK-8試劑盒檢測細胞在450 nm處的吸光度值，表示細胞增殖活性。

1.6 體外侵襲實驗檢測接種24 h 3組細胞的侵襲能力 將50 μL Matrigel膠鋪在Transwell小室的上室，37 ℃放置8 h。每組均在小室的上室中接種1×105個細胞，下室中加入600 μL完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后用棉簽擦凈上室內(nèi)細胞，PBS沖洗，40 g/L多聚甲醛固定20 min后，吉姆薩染液染色5 min。PBS洗滌30 min，通風晾干后，選擇5個視野計數(shù)染色細胞，即為穿膜細胞數(shù)，取平均值。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較3組SKOV3細胞中 FOXC1 mRNA和蛋白的表達水平、細胞增殖活性及穿膜細胞數(shù)，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 FOXC1過表達的SKOV3細胞穩(wěn)定株的篩選

慢病毒感染的SKOV3細胞中綠色熒光蛋白的表達情況見圖1。3組細胞中FOXC1蛋白(圖2)及mRNA的表達水平比較見表1。與載體對照組和空白對照組相比，實驗組細胞中FOXC1在mRNA和蛋白水平均呈高表達。

A：實驗組；B：載體對照組。圖1 慢病毒感染后SKOV3細胞熒光顯微鏡下的觀察結果(×40)

1：空白對照組；2：載體對照組；3：實驗組。圖2 3組SKOV3細胞FOXC1蛋白的表達情況

表1 3組SKOV3細胞中FOXC1 mRNA和蛋白表達水平的比較

*：與其余2組相比，P<0.05。

2.2 3組SKOV3細胞增殖活性的比較 3組SKOV3細胞接種24、48、72 h后增殖活性的比較見表2。由表2可見，接種24、48、72 h后實驗組的增殖活性低于載體對照組及空白對照組。

表2 3組SKOV3細胞不同培養(yǎng)時間增殖活性的比較

*：與載體對照組和空白對照組相比，P<0.05。

2.3 3組SKOV3細胞體外侵襲能力的比較 接種24 h后，實驗組、載體對照組、空白對照組的穿膜細胞數(shù)分別為(100.1±3.2)，(167.1±1.0)和(168.9±1.9)，3組間相比，差異有統(tǒng)計學意義(F=315.858，P<0.001)；與載體對照組及空白對照組相比，實驗組穿膜細胞數(shù)明顯減少(P<0.001)。

3 討論

EOC是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其中卵巢漿液性腺癌占EOC的75%，因缺乏特異性早期診斷指標以及有效的個體化治療，EOC患者的5 a生存率僅有30%左右[9]。

轉錄因子FOXC1位于人染色體6p25上，近年來認為FOXC1與腫瘤的生物學行為有關，該基因突變導致的FOXC1表達缺失或異?；罨芤l(fā)許多疾病。目前有研究[7]提示：卵巢漿液性囊腺癌SKOV3和HO-8910細胞系中FOXC1在mRNA及蛋白水平均有表達，但FOXC1在EOC的發(fā)生發(fā)展中究竟扮演了怎樣的角色尚不明確。該研究選取SKOV3為實驗對象，利用慢病毒作為轉導載體感染SKOV3細胞，大大提高了轉導效率，使其能夠穩(wěn)定表達外源基因。結果顯示，實驗組FOXC1的表達在mRNA水平和蛋白水平均較載體對照組及空白對照組升高，說明通過慢病毒感染SKOV3細胞能夠有效上調(diào)FOXC1在該細胞中的表達，并且經(jīng)過篩選，成為穩(wěn)定表達FOXC1的細胞株，為后續(xù)實驗提供了可靠的實驗基礎。

目前，F(xiàn)OXC1在腫瘤中的作用已成為研究熱點，并已發(fā)現(xiàn)FOXC1在不同組織、器官的腫瘤發(fā)生發(fā)展中分別扮演了抑癌或致癌的角色。Wang等[10]研究顯示在人基底樣乳腺癌中FOXC1可以通過激活NF-κB信號通路促進體外癌細胞系的增殖、侵襲及遷移；并且FOXC1可以與VEGF通過Notch信號相互作用，從而調(diào)節(jié)血管基因的表達并誘導腫瘤血管生成。而Zhou等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以通過上調(diào)FOXC1的表達從而負性調(diào)控多種腫瘤細胞的增殖，間接提示FOXC1可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。該研究結果顯示，通過慢病毒感染方式上調(diào)SKOV3細胞株中FOXC1的表達后，體外培養(yǎng)的SKOV3細胞增殖活性及侵襲能力受到了明顯的抑制，但是具體機制仍不清楚。有研究[10-12]提示FOXC1在腫瘤中可能是通過NF-κB、VEGF/Notch、TGF-β/Smad、Wnt等多條細胞信號通路發(fā)揮作用。FOXC1發(fā)揮作用的同時可能伴隨著多種調(diào)控方式及細胞信號轉導通路的參與，不同狀態(tài)下何種通路占優(yōu)勢可能會影響FOXC1在疾病中的作用。

綜上所述，F(xiàn)OXC1的表達增高可抑制SKOV3細胞的增殖及侵襲。但該研究僅從體外實驗分析了FOXC1過表達對SKOV3細胞系的某些生物學功能的影響，尚缺乏EOC更多細胞系的驗證及相關的動物實驗證實。隨著對FOXC1在EOC體內(nèi)實驗及具體作用機制的深入探究，其有望成為EOC治療中的有效靶點之一。

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(2016-11-18收稿 責任編輯徐春燕)

Impact of up-regulating FOXC1 expression on proliferation and invasion of SKOV3 cells

RENChenchen,LIUJiaxi,YANGLi,XUEJingge,LIFeiyan,LIULing,LIJing,BAIYang

DepartmentofGynecologyandObstetrics,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

SKOV3 cell;FOXC1;proliferation;invasion

Aim: To explore the changes of proliferation and invasion in SKOV3 cells after up-regulating the expression of FOXC1. Methods: SKOV3 cells were divided into 3 groups: cells in experimental group were infected with p-EGFP-lentiviral vector with overexpressed FOXC1 plasmids, cells in vector control group were infected with empty p-EGFP-lentiviral vector, and cells in blank control group, not infected. The expressions of FOXC1 mRNA and protein were detected by qRT-PCR and Western blot,respectively. The cell proliferation after 24,48 and 72 h infection and cell invasion after 24 h infection were observed by CCK-8 kit and Transwell invasion assay,respectively. Results: The expressions of FOXC1 mRNA and protein in SKOV3 cells in experimental group were significantly higher than those in the vector control and blank control groups(P<0.05).Compared with blank control group and vector control group, the proliferation activity of SKOV3 cells in experimental group was reduced at different time points, so was the invasive ability(P<0.05).Conclusion: Up-regulation of FOXC1 may suppress cell proliferation and invasion of SKOV3 cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.008

*河南省科技廳科技攻關項目 162102310131

R737.31