α-細(xì)辛醚誘導(dǎo)的Eca-109細(xì)胞中cytC、bax的表達(dá)*

張 妍,韓倩倩,朱艷琴

河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450046

α-細(xì)辛醚誘導(dǎo)的Eca-109細(xì)胞中cytC、bax的表達(dá)*

張 妍,韓倩倩,朱艷琴#

河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450046

#通信作者，女，1956年11月生，碩士，教授，研究方向:中藥抗腫瘤，E-mail:jc.zyqin@163.com

α-細(xì)辛醚；細(xì)胞色素C；bax；Eca-109 細(xì)胞

目的：觀察α-細(xì)辛醚對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞凋亡及cytC、bax表達(dá)的影響，探討其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)人食管癌Eca-109細(xì)胞，以15 mmol/L 5-氟尿嘧啶(5-FU)和25、50、100 mg/L的α-細(xì)辛醚干預(yù)48 h后，DAPI染色、倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，Annexin V-PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，分別采用Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)cytC、bax mRNA及蛋白的表達(dá)。以無(wú)干預(yù)細(xì)胞作空白對(duì)照。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，α-細(xì)辛醚組和5-FU組細(xì)胞的增殖能力降低，凋亡率升高(P<0.05)，細(xì)胞中cytC、bax蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05)。結(jié)論：α-細(xì)辛醚可能通過(guò)上調(diào)線粒體通路cytC、bax的表達(dá)，抑制Eca-109細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

食管癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、 多階段、 多基因變異積累及相互作用的復(fù)雜過(guò)程[1]。近來(lái)研究[2]表明，化療藥物多是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。線粒體作為細(xì)胞凋亡調(diào)控的活動(dòng)中心，可通過(guò)開(kāi)放線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，因而線粒體途徑的凋亡基因調(diào)控備受關(guān)注。α-細(xì)辛醚是天南星科植物石菖蒲揮發(fā)油的主要成分，具有鎮(zhèn)靜、解痙、催眠、抗驚厥等功效[3]。有關(guān)α-細(xì)辛醚抗腫瘤作用的研究甚少。作者通過(guò)觀察α-細(xì)辛醚對(duì)體外培養(yǎng)人食管癌Eca-109細(xì)胞增殖和凋亡的影響，檢測(cè)細(xì)胞色素C(cytochrome C，cytC)、bax mRNA和蛋白的表達(dá)情況，探討α-細(xì)辛醚誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡的作用靶點(diǎn)及機(jī)制，為α-細(xì)辛醚的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 Eca-109購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。α-細(xì)辛醚為山西普德藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，2 mg/支；5-氟尿嘧啶(5-FU)為上海旭東海普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，規(guī)格2 g/L、10 mL/支；四甲基偶氮唑鹽(MTT)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)為美國(guó)Solarbio公司產(chǎn)品; 胎牛血清為天津?yàn)蠊?TBD)產(chǎn)品；DAPI和Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒為南京凱基生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒為上海索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品； cytC、bax兔抗人單克隆抗體為英國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒為寶生物工程大連有限公司產(chǎn)品；引物由北京市理化分析測(cè)試中心合成。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó) Beckman Coulter公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Savant公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Eca-109細(xì)胞復(fù)蘇后，常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、鏈霉素100 U、青霉素100 U的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃、相對(duì)濕度為95%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，3～4 d傳代1 次。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca-109細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并確保細(xì)胞存活在95%以上。調(diào)整細(xì)胞密度為1×104mL-1，鋪于96孔板，每孔200 μL，24 h后，按實(shí)驗(yàn)分組處理。細(xì)胞分為空白對(duì)照組、15 mmol/L 5-FU組和不同劑量(25、50、100 mg/L)的α-細(xì)辛醚組，空白對(duì)照組只加入等體積的培養(yǎng)液。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 分組處理48 h后，每孔加入20 μL濃度為5 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸去上清，每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處的OD值，表示細(xì)胞增殖能力。

1.5 細(xì)胞形態(tài)變化的觀察 分組培養(yǎng)48 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，同時(shí)，運(yùn)用DAPI 染色在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化。

1.6 Annexin V-PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 PBS洗滌細(xì)胞， 用2.5 g/L胰蛋白酶消化2～3 min，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入培養(yǎng)液，吹打混勻后，1 000 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清，PBS重懸細(xì)胞，取0.5 mL細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加0.5 mL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入1 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后，避光4 ℃孵育 5～10 min，加入400 μL Binding Buffer，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western blot檢測(cè)cytC、bax蛋白的表達(dá) 提取培養(yǎng)48 h的各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；取30 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入兔抗人一抗(1:2 000)進(jìn)行雜交，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，充分漂洗后，加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(1:3 000)，室溫振搖2 h，充分洗滌后，加入ECL超敏發(fā)光液，反應(yīng)5 min后，移入凝膠成像分析儀中，化學(xué)光敏模式曝光顯影，使用Quantity One分析條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)cytC、bax mRNA的表達(dá) 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，確定其純度及完整性。引物序列如下：β-actin上游5’-CCGTCTTCCCCTCCATCG-3’， 下游5’-GTCCCAGTT GGTGACGATGC-3’，擴(kuò)增片段大小155 bp ；cytC上游5’-TTGCACTTACACCGGTACTTAAGC-3’，下 游 5’-ACGTCCCCACTCTCTAAGTCCAA-3’，擴(kuò)增片段大小62 bp；bax上游5’-CTGCGAACTAACAGGCAAGC-3’,下游5’-CTAGATATGGCGTCCAGCTG-3’，擴(kuò)增片段大小286 bp。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性 15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)體系：總反應(yīng)體積為10 μL, 其中5×Primer Script Buffer 2 μL，Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L) 0.5 μL，RNA(100 μg/L) 5 μL，無(wú)RNase dH2O 1.5 μL。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù) 2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0分析，各組細(xì)胞增殖能力、凋亡率、cytC和bax表達(dá)的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力和凋亡情況 與空白對(duì)照組比較， 5-FU和不同劑量的α-細(xì)辛醚均可抑制 Eca-109細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖能力和凋亡情況(n=3)

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05 。

2.2 各組細(xì)胞形態(tài)觀察 空白對(duì)照組細(xì)胞核被染成均一的淡藍(lán)色， 完整性良好， 未見(jiàn)明顯的凋亡細(xì)胞。α-細(xì)辛醚處理后細(xì)胞出現(xiàn)體積縮小，細(xì)胞核皺縮、 染色加深等典型的凋亡形態(tài)特征；并且隨著α-細(xì)辛醚濃度的增加，細(xì)胞總數(shù)明顯減少，核固縮、核碎片增多。各組細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖 1。

A：空白對(duì)照組;B：5-FU組；C：25 mg/L α-細(xì)辛醚組；D：50 mg/L α-細(xì)辛醚組；E：100 mg/L α-細(xì)辛醚組。圖1 各組細(xì)胞形態(tài)觀察(×200)

2.3 各組細(xì)胞cytC和bax蛋白的表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，其他各組cytC和bax蛋白表達(dá)顯著升高。結(jié)果見(jiàn)圖2、表2。

1：空白對(duì)照組；2：5-FU組；3：25 mg/L α-細(xì)辛醚組；4：50 mg/L α-細(xì)辛醚組；5：100 mg/L α-細(xì)辛醚組。圖2 各組細(xì)胞cytC和bax蛋白的表達(dá)

表2 各組細(xì)胞cytC和bax蛋白的表達(dá)(n=3)

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05。

2.4 各組細(xì)胞cytC和bax mRNA的表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，其他各組cytC和bax mRNA表達(dá)顯著升高。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞cytC和bax mRNA的表達(dá)(n=3)

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05。

3 討論

食管癌等惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命。近來(lái)研究[4-5]表明，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞凋亡異常相關(guān)。腫瘤細(xì)胞多存在凋亡不足，因而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為腫瘤治療的新思路。

細(xì)胞凋亡調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為，至少有3條通路參與：線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。其中，線粒體通路作為細(xì)胞能量代謝的“工廠”，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中處于中心地位，又稱(chēng)內(nèi)源性凋亡途徑[6]。在氧化應(yīng)激、DNA損傷、X射線、化療藥物等促凋亡信號(hào)作用下，MPTP不可逆性開(kāi)放，導(dǎo)致線粒體跨膜電位消失，呼吸鏈解偶聯(lián)，線粒體基質(zhì)滲透壓升高，內(nèi)膜腫脹，位于線粒體膜間隙的cytC等凋亡因子釋放于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，cytC在ATP/dATP存在的條件下，能與凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic protease-activating factor 1，Apaf 1)形成多聚復(fù)合體，通過(guò) Apaf 1氨基端的caspase募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain，CARD)募集胞質(zhì)中的bax前體，從而使其自我剪切而活化，并啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的caspase-3和caspase-7，完成對(duì)其相應(yīng)底物的切割，引起細(xì)胞凋亡[7-8]。在前期的研究中，作者發(fā)現(xiàn)細(xì)辛醚可激活線粒體通路，導(dǎo)致Smac因子釋放。該研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，α-細(xì)辛醚可導(dǎo)致Eca-109細(xì)胞中cytC表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

bax 是 Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白之一。Bcl-2家族蛋白相互作用，通過(guò)激活下游系列基因，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用，控制著線粒體內(nèi)膜和外膜的通透性，因此Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)控者[9]。正常情況下，bax主要分布于細(xì)胞質(zhì)，在凋亡信號(hào)的作用下，bax從胞質(zhì)進(jìn)入線粒體得以活化，活化的bax與線粒體內(nèi)膜的內(nèi)膜腺苷轉(zhuǎn)位因子(adenine nucleotide translocator,ANT)和外膜的電壓依賴(lài)性陰離子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)結(jié)合，導(dǎo)致MPTP開(kāi)放，線粒體膜通透性破壞，致cytC等物質(zhì)釋放，促使細(xì)胞凋亡[10]；同時(shí)，bax還可通過(guò) BH3 結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合于線粒體膜上的Bcl-2蛋白，形成bax-Bcl-2二聚體，從而拮抗Bcl-2的抗凋亡作用[11]。陳志英等[12]應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)58例結(jié)直腸癌中bax的表達(dá)， 并以20例結(jié)直腸黏膜炎癥組織為對(duì)照，結(jié)果表明bax在結(jié)直腸癌中的表達(dá)明顯低于炎癥組織，提示bax低表達(dá)與結(jié)直腸癌等腫瘤相關(guān)。該研究結(jié)果顯示，α-細(xì)辛醚可上調(diào)Eca-109細(xì)胞bax mRNA和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)cytC釋放，誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞凋亡。然而bax上游的調(diào)控基因及機(jī)制有待進(jìn)一步考證。

總之，α-細(xì)辛醚可通過(guò)上調(diào)cytC、bax表達(dá)，抑制Eca-109細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

[1]BEHRENS A,ELL C,LORDICK F.Perioperative and Palliative Chemotherapy for Esophageal Cancer[J].Viszeralmedizin,2015,31(5):341

[2]ZHAO WS,LUO Y,LI BY,et al.Anti-ABCG2 scFv antibody of lung adenocarcinoma increases chemosensitivity and induces apoptosis through the activation of mitochondrial pathway[J].Am J Cancer Res,2016,6(5):1026

[3]王甜甜,吳芳,朱艷琴,等.α-細(xì)辛醚誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞系Eca-109凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào),2014,29(4):473

[5]趙霏，馬虎山，席思凡，等.灰樹(shù)花多糖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的Meta分析[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2016,42(5)：14

[6]UTO T,TOYAMA M,YOSHINAGA K,et al.Cepharanthine induces apoptosis through the mitochondria/caspase pathway in murine dendritic cells[J].Immunopharmacol Immunotoxicol,2016,38(3):238

[7]ESMAEILI MA,ABAGHERI-MAHABADI N,HASHEMPOUR H,et al.Viola plant cyclotide vigno 5 induces mitochondria-mediated apoptosis via cytochrome C release and caspases activation in cervical cancer cells[J].Fitoterapia,2016,109:162

[8]KONG F,WANG H,GUO J,et al.Hsp70 suppresses apoptosis of BRL cells by regulating the expression of Bcl-2, cytochrome C, and caspase 8/3[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2016,52(5):568

[9]JIANG Y,XU H,WANG J.Alantolactone induces apoptosis of human cervical cancer cells via reactive Oxygen species Generation, glutathione depletion and inhibition of the Bcl-2/Bax signaling pathway[J].Oncol Lett,2016,11(6):4203

[10]FARHADI F,JAHANPOUR S,HAZEM K,et al.Garlic(Allium sativum)Fresh Juice Induces Apoptosis in Human Oral Squamous Cell Carcinoma: The Involvement of Caspase-3, Bax and Bcl-2[J].J Dent Res Dent Clin Dent Prospects,2015,9(4):267

[11]LI H,LI X,BAI M,et al.Matrine inhibited proliferation and increased apoptosis in human breast cancer MCF-7 cells via upregulation of Bax and downregulation of Bcl-2[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(11):14793

[12]陳志英,何常,李佽,等.抑癌基因WWOX與相關(guān)基因p73、Bax在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志,2012,9(1):57

(2016-09-01收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Expressions of cytochrome C and bax on Eca-109 cells inducing by α-asarone

ZHANGYan,HANQianqian,ZHUYanqin

SchoolofBasicMedicine,HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046

α-asarone;cytochrome C;bax；Eca-109 cell

Aim: To observe the influence of α-asarone on esophageal carcinoma Eca-109 cells apoptosis and cytochrome c(cytC), bax expression, and explore its molecular mechanism.Methods: 5-FU and different dosages of α-asarone were used to intervene culture Eca-109 cellsinvitro. morphologic changes were viewed under an inverted fluorescence microscope after DAPI staining assay. Cell proliferation and apoptosis rate were measured by MTT and Annexin V-PI. The protein and mRNA expression levels of cytC and bax were detected by Western blot and real-time quantitative PCR.Results: Compared with blank group,cell proliferation rate decreased significantly, and cell apoptosis rate increased significantly in 5-FU and different dosages of α-asarone groups(P<0.05), the expression levels of cytC and bax protein and mRNA increased significantly in 5-FU different dosages of α-asarone groups(P<0.05).Conclusion: α-asarone could inhibit Eca-109 cells proliferation and induce cell apoptosis via up-regulating cytC and bax′s expression.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.003

*河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目 072300450030；河南省科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目 13A310612；河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目 16A310021

R735.1