洋金花總堿對人肺腺癌A549細(xì)胞EMT過程中E-cad表達的影響

譚曉麗呂曉東王真

·論著·

洋金花總堿對人肺腺癌A549細(xì)胞EMT過程中E-cad表達的影響

譚曉麗1呂曉東1王真2

目的觀察洋金花總堿對轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)的A549細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）過程中E-鈣黏蛋白（E-cad）表達的影響。方法將體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞隨機分為空白對照組，TGF-β1組及洋金花總堿低、中、高濃度藥物組，分別作用24、48、72h后，通過Western-blot及RT-PCT檢測各組A549細(xì)胞E-cad表達的變化。結(jié)果24、48、72hE-cad表達，空白對照組分別為（1.49±0.12）、（2.52±0.07）、（2.58±0.21）；TGF-β1組分別為（0.66±0.01）、（0.50±0.13）、（0.52± 0.08）；洋金花總堿低、中、高濃度藥物組分別為24h[（0.67±0.12）、（0.67±0.12）、（1.12±0.05）]、48h [（0.70±0.28）、（1.02±0.08）、（1.10±0.13）]、72h[（0.68±0.04）、（1.25±0.11）、（1.30±0.09）]。與空白對照組比較，TGF-β1組和洋金花總堿低、中、高濃度藥物組的E-cad表達均明顯減少（P<0.01）；與TGF-β1組比較，各時間段的洋金花總堿低濃度組E-cad表達無明顯變化（P>0.05），但48、72h洋金花總堿中、高濃度組E-cad表達明顯增加（P<0.01）；與24h低濃度藥物組比較，24h中濃度藥物組E-cad表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但作用48、72h后，中濃度藥物組的E-cad表達明顯增加（P< 0.01），而高濃度藥物組3個時間點的E-cad表達均明顯增加（P<0.01）。與中濃度藥物組比較，24h高濃度藥物組E-cad表達增加（P<0.05），48、72h高濃度藥物組E-cad表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）。與空白對照組比較，不同濃度作用的洋金花總堿藥物組使E-cad mRNA表達上調(diào)（P<0.01），并且在72h及高濃度時最明顯（P<0.01）。結(jié)論洋金花總堿通過增加上皮標(biāo)志物E-cad表達，可抑制A549細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

肺腺癌細(xì)胞；A549細(xì)胞；洋金花總堿；上皮細(xì)胞間質(zhì)化；E-cad

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種慢性、不可逆性的致命性肺疾病，而肺泡上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被認(rèn)為是肺纖維化的重要病理生理機制之一[1]，研究EMT及其相關(guān)信息傳導(dǎo)通路可為抑制肺纖維化進程提供有效策略。有研究表明，在眾多參與EMT的細(xì)胞因子中，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growthactor-β1，TGF-β1）起著關(guān)鍵作用[2]。E-鈣黏蛋白（E-Cadherin，E-cad）是上皮細(xì)胞跨膜蛋白，特異性較高，常用于標(biāo)志性表示上皮細(xì)胞。x藥理研究發(fā)現(xiàn)洋金花的主要有效成分為東莨菪堿[3]，表現(xiàn)為抑制毒蕈堿樣作用。實驗證實，M受體阻滯劑噻托溴胺能濃度依賴性抑制乙酰膽堿、TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖[4]。本研究觀察洋金花總堿對TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT過程中E-cad表達的變化，為洋金花總堿抗纖維化作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料肺腺癌細(xì)胞株A549（購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞庫）；洋金花總堿（來源于浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；TGF-β1（美國PeproTech公司）；Ham'F12培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Life Technologies公司)，E-cad兔抗人一抗（美國Epitomics公司）；GAPDH單克隆抗體（杭州達文生物有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（杭州達文生物有限公司）；SDSPAGE蛋白上樣緩沖液（5X）、BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Trizol Reagent（美國Invitrogen生命技術(shù)有限公司）；Prime Script RT Master Mix試劑盒、DEPC水（TaKaRa，大連寶生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞株（A549）先常規(guī)傳代于含10%胎牛血清Ham'F12培養(yǎng)基中，逐漸過渡至含10%胎牛血的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2及飽和濕度條件孵箱中培養(yǎng)，用0.25%胰酶-EDTA消化，傳代，取增殖旺盛、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實驗研究。

1.2.2 細(xì)胞分組和處理當(dāng)細(xì)胞生長融合至70%～80%，用無血清培養(yǎng)基饑餓24h，使細(xì)胞靜止于同步期，隨機將細(xì)胞分為空白對照組、TGF-β1組（5ng/ mL）及洋金花總堿低濃度組（50g/mL+5ng/mL TGF-β1）、中濃度組（100g/mL+5ng/mL TGF-β1）和高濃度組（200g/mL+5ng/mL TGF-β1），分別作用24、48、72h。洋金花藥物濃度梯度由前期MTT測得。

1.2.3 Western blot法檢測分別在低、中、高濃度洋金花總堿作用細(xì)胞24、48、72h時間點收集各組細(xì)胞，按試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白：棄培養(yǎng)液，加入細(xì)胞蛋白裂解液，BCA試劑盒蛋白定量。各組標(biāo)本加入蛋白上樣緩沖液行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1h，兔抗人一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（二抗）室溫2h，ECL發(fā)光顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)成像，利用圖像分析軟件進行分析，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白與內(nèi)參灰度的相對比值。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 RT-PCR檢測分別在低、中、高濃度洋金花總堿作用細(xì)胞24、48、72h時間點收集各組細(xì)胞，進行以下處理?？俁NA提?。喊凑f明書，用Trizol法分別提取各組A549細(xì)胞總RNA，并計算總RNA濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：加入5倍Prime Script RT Master Mix配置成10μL的逆轉(zhuǎn)錄液，操作在冰上進行，在逆轉(zhuǎn)錄儀上設(shè)置程序，37℃，15min；85℃，5s；4℃，5min，反應(yīng)所得即為cDNA。RTPCR擴增反應(yīng)：按說明書配置每份10μL的反應(yīng)體系，合成E-cad和GAPDH的兩對引物分別為：E-cad，上游引物5'-TTCTGGAAGGAATGGAGGAGTC-3'，下游引物5'-ACCTGGAATTGGGCAAATGTG-3（'120kd）；GAPDH：上游引物5'-GGTCTCCTCTGACT-TCAACA -3'，下游引物5'-AGCCAA-TTCGTTGTCA-TAC-3'（36kd），在PCR儀上進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃30s 1個循環(huán)；95℃5s，60℃34s，40個循環(huán)；95℃15s 1個循環(huán)；60℃1min 1個循環(huán)及95℃15s 1個循環(huán)。所得的RQ值即為目的基因與內(nèi)參的相對比值。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)以表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用One-way ANOVA檢驗，予以方差齊性檢驗，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，方差齊時組間比較用LSD法，方差不齊時組間比較用Tamhane's T2法，P<0.05說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 各組24、48、72h E-cad蛋白表達比較與空白對照組比較，24、48、72h時間點TGF-β1組與洋金花總堿低、中、高濃度組的E-cad表達均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與TGF-β1組比較，各時間段的洋金花總堿低濃度組E-cad表達無明顯變化（P>0.05），洋金花總堿中、高濃度組48、72h E-cad表達明顯增加（P<0.01）；與洋金花總堿低濃度組比較，作用24h時，洋金花總堿中濃度組的E-cad表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但48、72h中濃度藥物組的E-cad表達明顯增加（P<0.01），洋金花總堿高濃度組則3個時間點的E-cad表達均明顯增加（P< 0.01），說明洋金花總堿對細(xì)胞的作用呈濃度依賴性和時間依賴性。與洋金花總堿中濃度組比較，24h時洋金花總堿高濃度組E-cad表達增加（P<0.05），洋金花總堿高濃度組48、72h時間點的E-cad表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1、圖1。

2.2 各組24、48、72h E-cadmRNA表達比較與空白對照組比較，3個時間點TGF-β1組E-cadmRNA表達均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與TGF-β1組比較，洋金花總堿各濃度組每個時間點的E-cad mRNA表達隨藥物濃度的增加而增多（P<0.01），且隨著作用時間延長，E-cadmRNA表達明顯增多。洋金花總堿高濃度組72h時間點的表達達高峰，與24h時間點比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖2。

表1 各組洋金花總堿作用24、48、72h后E-cad的蛋白表達比較

表1 各組洋金花總堿作用24、48、72h后E-cad的蛋白表達比較

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與TGF-β1組比較，△P＜0.01；與洋金花總堿低濃度組比較，▲P＜0.01；與洋金花總堿中濃度組比較，○P＜0.05；E-cad：E-鈣黏蛋白；TGF-β1：轉(zhuǎn)化因子-β1

圖1 各組細(xì)胞在藥物作用24、48、72h后E-cad表達

圖2 各組24、48、72h E-cadmRNA表達比較

3 討論

肺纖維化發(fā)病多從肺泡炎開始，以纖維化告終，作為病變開始的靶細(xì)胞除了血管內(nèi)皮細(xì)胞外，還有相當(dāng)數(shù)量的肺泡細(xì)胞，特別是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞。A549細(xì)胞與來源于人的原代Ⅱ型肺泡細(xì)胞,在病毒誘發(fā)的損傷中TGF-β1mRNA的表達水平、凋亡相關(guān)因子Caspse3/7的活性及細(xì)胞增殖能力均接近[5]，誘導(dǎo)它增殖和EMT可以模擬Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞在病理狀態(tài)下參與體內(nèi)肺纖維化形成過程。

EMT是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，并獲得轉(zhuǎn)移能力的過程，很久以來一直被認(rèn)為在胚胎發(fā)育和惡性腫瘤的細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中起主導(dǎo)作用。近年發(fā)現(xiàn)，EMT與肺纖維化也關(guān)系密切，體外培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞可以通過EMT而成為肌成纖維母細(xì)胞（MFb）的部分來源[6]；特發(fā)性肺纖維化患者的活檢標(biāo)本中，也觀察到EMT參與肺纖維化的形成[7-8]。TGF-β1作為體外誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵因子，早期變化即是E-鈣黏蛋白表達受到抑制，細(xì)胞間緊密連接被破壞，上皮細(xì)胞喪失黏附特性，逐漸從基底膜上脫落；然后胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞骨架進行重排，表達新的表型蛋白如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），胞質(zhì)內(nèi)肌絲也從上皮型的角蛋白（cytokeratin）轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的波形蛋白（vimentin）[9-10]。

姜毅等[11]使用不同濃度的槲皮素干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞，用Western blot及RT-PCR檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物E-cad、Vimentin的表達變化，結(jié)果顯示，一定濃度的槲皮素能抑制A549細(xì)胞的增殖，并在基因和蛋白水平增加E-cad表達，降低Vimentin表達，從而抑制A549細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本實驗研究顯示洋金花總堿能在蛋白和基因水平增加E-cad的表達，且呈濃度依賴性和時間依賴性，說明洋金花總堿能在一定程度上抑制A549細(xì)胞的EMT過程，從而減少成纖維細(xì)胞的來源，延緩肺纖維化進程。

洋金花臨床廣泛用于呼吸系統(tǒng)疾病，我們研究發(fā)現(xiàn)，洋金花總堿能明顯增加TGF-β1誘導(dǎo)下人肺腺癌細(xì)胞A549的上皮細(xì)胞表達，但同期未做相應(yīng)的體內(nèi)實驗，且關(guān)于洋金花總堿分子水平的研究文獻較少，故具體的作用靶點還需要后期更深入的研究。

［1］Chris J Scotton，Rachel C Chambers.Molecular targets in pulmonary fibrosis：the myofibroblast in focus［J］.Chest，2007，132（4）：1311-1321.

［2］黃振杰，鄭金旭，湯艷，等.肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在肺纖維化中的作用［J］.臨床肺科雜志，2011，16（6）：823-826.

［3］苗明三，李振國.現(xiàn)代實用中藥質(zhì)量控制技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：782.

［4］Pieper MP，Chaudhary NⅠ，Park JE.Acetylcholine-induced proliferation of fibroblasts and myofibroblasts in vitro is inhibited by tiotropium bromide［J］.Life Sciences，2007，80（24-25）：2270-2273．

［5］Andrea PM，Dominic TK，Sinead MS，et al.Alveolar epithelial cell injury with Epstein-Barr virus upregulcates TGF-beta1 expression［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，295（3）：451-60.

［6］Barth K，Reh J，Sturrock A，et al.Epithelial vs myofibroblast differentiation in immortal rat lung cell lines-modulating effects of bleomycin［J］.Histochem Cell Biol，2005，124（6）：453-464.

［7］Milara J，Navarro R，Juan G，et al.Sphingosine-1-phosphate is increased in patients with idiopathic pulmonary fibrosis and mediates epithelial to mesenchymal transition［J］.Thorax，2012，67（2）：147-156.

［8］Ohta H，Chiba S，Ebina M，et al.Altered expression of tight junction molecules in alveolar septa in lung injury and fibrosis［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2012，302（2）：193-205.

［9］Ansieau S，Bastid J，Doreau A，et al.Induction of EMT by twist proteins as a collateral effect of tumor-promoting inactivation of premature senescence［J］.Cancer Cell，2008，14（1）：79-89.

［10］Frame MC，Inman GJ.NCAM is at the heart of reciprocal regulation of E-cadherin-and integrin-mediated adhesions via signaling modulation［J］.Dev Cell，2008，15（4）：494-496.

［11］姜毅，龐軍，吳曉東，等.槲皮素對TGF-β1誘導(dǎo)的人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（5）：6-8.

（收稿：2016-09-12修回：2016-10-07）

Effect of Yangjinhua Alkaloids on the Expression of E-cad in Human Lung Adenocarcinoma Cell LineA549 Cells during EMT

TAN Xiaoli1,LU Xiaodong1,WANG Zhen2.1 Department of Respiratory,the First Hospital of Jiaxing,Zhejiang,Jiaxing(314000),China;2Department of Respiratory,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo observe the E-cad expression changes in A549 cells during TGF-β1-induced EMT after Yangjinhua alkaloids treatment.MethodsA549 cells in vitro cultured were randomly divided into blank control group,TGF-β1 group,low,medium and high dose of Yangjinhua alkaloids group.The change of cell morphology and the expression of E-cad were observed by western blot and RT-PCR after 24,48 and 72 hours,respectively.ResultsThe expressions of E-cad at 24,48 and 72 hours after treatment were 1.49±0.12,2.52±0.07, 2.58±0.21 in blank control group,0.66±0.01,0.50±0.13,0.52±0.08 in TGF-β1 group,0.67±0.12,0.67±0.12,1.12± 0.05 in low dose of Yangjinhua alkaloids group,0.70±0.28,1.02±0.08,1.10±.13 in medium dose of Yangjinhua alkaloids group and 0.68±0.04,1.25±0.11,1.30±0.09 in high dose of Yangjinhua alkaloids group.Compared with those in blank control group,the expressions of E-cad in three Yangjinhua alkaloids groups were significantly decreased（P<0.01）.Compared to those in TGF-β1 group,the expressions of E-cad at 24,48 and 72 hours in lowdose of Yangjinhua alkaloids group were not different（P>0.05）,but the expressions of E-cad at 48 and 72 hours in medium and high doses of Yangjinhua alkaloids groups were obviously increased（P<0.01）.Among three Yangjinhua alkaloids groups,the expression of E-cad at 24 hin low dose group did not differ from that in medium dose group,but the expression of E-cad at 48 and 72 hours in medium dose groups were significantly increased（P<0.01）,and the expression of E-cad in high dose group were higher at each time point（P<0.01）;compared to those in medium dose group,the expression of E-cad at 24 h in high dose group were raised（P<0.05）, but no significant difference was noted between two groups at 48 and 72 hours（P>0.05）.Compared to blank control group,three Yangjinhua alkaloids groups all had higher level of E-cad mRNA（P<0.01）,and the level of E-cad mRNA reached the peak at 72 hours after treatment or in high dose group（P<0.01）.ConclusionYangjinhua alkaloids can inhibit the EMT process of A549 cells by increasing the expression of the epithelial marker E-cad.

lung adenocarcinoma cell;A549 cells;Yangjinhua alkaloids;epithelial-mesenchymal transition;E-cad

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2012ZB049）

1浙江省嘉興市第一醫(yī)院呼吸科（嘉興314000）；2浙江省中醫(yī)院呼吸科（杭州310006）

王真，Tel：13605801386；E-mail：wangzhen610@sina.cn