嘎狗嚕對肢體缺血再灌注損傷大鼠的抗炎作用研究

王濟緯 蘭 俊 許榮成 鄧連成 劉 斌 鄢連和 陳科 雷后興

·藥學(xué)研究·

嘎狗嚕對肢體缺血再灌注損傷大鼠的抗炎作用研究

王濟緯 蘭 俊 許榮成 鄧連成 劉 斌 鄢連和 陳科 雷后興

大鼠；再灌注損傷；嘎狗嚕；炎癥因子

肢體缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是一種臨床常見損傷，處理不當會引起嚴重的臨床后果。其病理生理機制十分復(fù)雜，包括細胞凋亡、氧化應(yīng)激、鈣超載、血管內(nèi)皮損傷、缺血后的微循環(huán)障礙等方面，而炎癥反應(yīng)在其發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[1-2]，發(fā)生IRI會刺激機體炎性細胞在肢體的聚集，同時表達產(chǎn)生大量的炎性細胞因子，而這些炎性因子反過來刺激更多的炎性反應(yīng)，加重再灌注損傷。研究[3]發(fā)現(xiàn)，細胞間黏附分子-1（ICAM-1）在其中起著非常重要的作用。文獻[4-5]報道，畬藥嘎狗嚕（地稔，Melastoma dodecandrum Lour，MDL）具有抗炎作用。本實驗觀察畬藥嘎狗嚕水煎液對肢體缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應(yīng)的影響及作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡清潔級健康SD大鼠，體質(zhì)量200～250g，雌雄各15只，溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。許可證號：SYXK（浙）2010-0150。適應(yīng)性飼養(yǎng)，雌雄分養(yǎng)，實驗前夜禁食，自由飲水。

1.2 畬藥配置MDL全草由麗水市畬族醫(yī)藥研究所提供。取MDL原藥材1kg，剪碎后分別以10倍量、8倍量、6倍量水煎煮3次，每次30min，合并3次煎煮液濾過、離心，濃縮至1g生藥/mL的MDL濃縮液置于冰箱冷藏備用，實驗用MDL水煎液由MDL濃縮液+純水稀釋配制而成，濃度0.2g/mL。灌胃劑量為1次10mL/kg，1天1次。

1.3 實驗儀器及試劑南京SOPTOP舜宇顯微鏡ST60，上海手術(shù)器械廠800型離心機，Mutuskan MK3酶標儀。Multi sciences公司生產(chǎn)的細胞間黏附分子-1（ICAM-1，批號238960234）、白細胞介素-6（IL-6，批號230660752）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號238260734）試劑盒。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組及造模30只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組和藥物組，每組10只。大鼠術(shù)前禁食12h，自由飲水，術(shù)前10%水合氯醛3mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。每2h追加1次維持麻醉，劑量減半。麻醉成功后，大鼠仰臥位，四肢固定于木板上，取右腹股溝切口，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，剪開皮膚，在手術(shù)顯微鏡下顯露股動、靜脈及股神經(jīng)，分離出右側(cè)股動脈。假手術(shù)組僅單純游離股動脈，不阻斷，直接縫合皮膚。模型組和藥物組大鼠用無創(chuàng)動脈夾夾閉右側(cè)股動脈，顯微鏡下確認阻斷動脈血流后，縫合切口兩針，再次消毒。同時予以右大腿根部橡皮帶環(huán)扎，阻斷側(cè)支循環(huán)。4h后松解橡皮帶，拆線，取出動脈夾，并檢查血管是否通暢，以確認恢復(fù)右下肢血流灌注，縫合創(chuàng)口。藥物組造模后第2天開始灌胃中藥，另兩組灌胃等量生理鹽水，每天1次，共喂5天；第6天三組大鼠麻醉后，心尖取血，檢測相關(guān)指標。

1.4.2 血漿組織細胞因子水平檢測取血4mL入促凝管（促凝劑+分離膠）,靜置30min待血清部分析出后，再予離心機離心，3000rpm，10min。分離血清后裝入無菌Epperdorf管置于-75℃超低溫冰箱中保存，統(tǒng)一檢測。ICAM-1、IL-6、TNF-α濃度均采用ELISA法檢測，嚴格按照試劑盒說明書操作。將血清標本從-75℃超低溫冰箱中取出，緩慢恢復(fù)至室溫；準備所有試劑和標準品；復(fù)孔加入100μL兩倍倍比稀釋的標準品；樣本孔加入50μL 1×檢測緩沖液和50μL樣本；每孔加入50μL稀釋的檢測抗體；室溫孵育2h；洗滌6次；每孔加入100μL稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素；室溫孵育45min；洗滌6次；每孔加入100μL顯色底物，避光，室溫孵育20min；每孔加入100μL終止液；30min內(nèi)，在450nm波長檢測OD值，參考波長630nm。

根據(jù)標準品濃度和相應(yīng)的OD450吸光值制定標準曲線；根據(jù)標準曲線計算樣本的ICAM-1、IL-6、TNF-α濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料均以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗法，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

模型組ICAM-1含量與假手術(shù)組比較顯著升高（P<0.05），模型組IL-6、TNF-α與假手術(shù)組比較有非常顯著升高（P<0.01）。藥物組ICAM-1、IL-6、TNF-α與模型組比較均有非常顯著降低（P<0.01）。見表1。

表1 MDL提取液對肢體IRI模型大鼠血清炎性因子的影響

表1 MDL提取液對肢體IRI模型大鼠血清炎性因子的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01. ICAM-1：細胞間黏附分子-1；IL-6：白細胞介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子-α

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3 討論

缺血再灌注損傷可在全身多部位發(fā)生，肢體、心臟、肝臟、肺臟、腦部、腎臟、小腸等都是好發(fā)部位[3，6-7]，同時這些部位的再灌注損傷又會影響全身相關(guān)重要器官及系統(tǒng)，嚴重者會導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），處理不及時可造成持續(xù)的不可控的炎癥反應(yīng)，其產(chǎn)生的炎性介質(zhì)會影響內(nèi)皮細胞功能，并影響重要器官微循環(huán)，引起凝血功能障礙，導(dǎo)致多臟器功能障礙綜合征（MODS）[8]。

嘎狗嚕系畬族民間的常用藥物，具有解毒消腫、祛瘀活血之功能。ICAM-1參與免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。ICAM-1、IL-6和TNF-α作為經(jīng)典的炎癥因子指標，可以準確表達炎癥反應(yīng)的強弱。本實驗通過鉗夾股動脈及橡皮片捆扎肢體造成大鼠缺血再灌注損傷，造模后相關(guān)指標升高，成功造成肢體缺血再灌注損傷動物模型。本研究發(fā)現(xiàn)，MDL水煎提取液能夠明顯減少血液中炎癥因子的表達，表明MDL水煎提取液可以通過降低炎癥因子的表達抑制大鼠炎癥反應(yīng)。

［1］Furuichi K，Wada T，Kaneko S，et al.Roles of chemo-kines in renal ischemia/reperfusion injury［J］.Front Biosci，2008，13：4021-4028.

［2］Thurman JM.Triggers of inflammation after renal ischemia/ reperfusion［J］.Clin Immunol，2007，123（1）：7-13.

［3］徐江，黃曉琳.高壓氧對腦缺血再灌注大鼠核因子-k B及細胞間黏附分子-1表達的影響［J］．中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2005，27（5）：259-262.

［4］雷后興，鄢連和，李水福等.畬藥地稔水煎液的鎮(zhèn)痛抗炎作用研究［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2008，3（3）：45-47.

［5］周芳，張興燊，張旖簫，等.地稔水煎液鎮(zhèn)痛抗炎藥效的實驗研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18（10）：2370-2371.

［6］王良榮，金立達，林麗娜，等.糖尿病對肢體缺血再灌注后患者炎癥反應(yīng)和肺功能的影響［J］.溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015，45（3）：194-196.

［7］王曉琴，陳麗.舒芬太尼預(yù)處理對老年人肢體缺血再灌注后腫瘤壞死因子-α和心肌肌鈣蛋白I的影響［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2016，10（9）：1283-1286.

［8］北京市科委重大項目“MODS中西醫(yī)結(jié)合診治/降低病死率研究”課組．多器官功能障礙綜合征診斷標準、病情嚴重度評分及預(yù)后評估系統(tǒng)和中西醫(yī)結(jié)合證型診斷［S］．中國危重癥急救醫(yī)學(xué)，2008，20（1）：1-3.

（收稿：2016-10-12修回：2106-10-22）

浙江省麗水市重點創(chuàng)新團隊項目（No.2012CXTD09-06）

浙江省麗水市人民醫(yī)院（麗水323000）

雷后興，Email：zjleihx@163.com