宮頸癌及癌前病變患者高危型HPV16感染與HLA—Ⅰ表達(dá)的關(guān)系

鐵煒煒　葛芬芬

[摘要] 目的 探討宮頸癌及癌前病變患者高危型人乳頭狀瘤病毒16（HPV16）感染與人類白細(xì)胞抗原Ⅰ（HLA-Ⅰ）表達(dá)的關(guān)系。 方法 選取2014年4月～2016年4月我院行手術(shù)切除術(shù)或婦科檢查的123例宮頸病變患者為研究對象，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測患者HPV陽性檢出率，采用免疫組織化學(xué)S-P方法檢測組織中HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)水平，分析HLA-Ⅰ與宮頸癌及癌前病變患者高危型HPV16感染之間的關(guān)系。 結(jié)果 宮頸炎組織中HPV16陽性檢出率為8.33%，明顯低于宮頸內(nèi)上皮瘤變（CIN）組織中HPV16陽性檢出率（31.25%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CIN組織中HPV16陽性檢出率為31.25%，明顯低于宮頸鱗癌（CSCC）組織中陽性檢出率（79.10%）（P<0.05）；宮頸炎組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率為95.83%，明顯高于CIN組織陽性表達(dá)率（40.63%）（P<0.05），CIN組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率為40.63%，明顯高于CSCC組織中陽性表達(dá)率（19.40%）（P<0.05）；宮頸癌組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率與宮頸癌組織分化、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HPV16感染與HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.748，P<0.05）。 結(jié)論 HLA-Ⅰ表達(dá)及高危型HPV16感染與宮頸病變進(jìn)展為宮頸癌密切相關(guān)，且HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)與HPV16感染呈明顯負(fù)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌；癌前病變；人乳頭狀瘤病毒16；人類白細(xì)胞抗原Ⅰ

[中圖分類號] R737.34 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）12-0066-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between high-risk human papillomavirus 16（HPV16） infection and human leukocyte antigen Ⅰ（HLA-Ⅰ） expression in patients with cervical cancer and precancerous lesions. Methods A total of 123 patients with cervical lesions who underwent surgical resection or gynecological examination in our hospital from April 2014 to April 2016 were selected. The positive detection rate of HPV in patients was detected by polymerase chain reaction（PCR）. Immunohistochemistry S-P method was used to detect the expression of HLA-Ⅰprotein in tissues. And the relationship between HLA-Ⅰand HPV16 infection in patients with cervical cancer and precancerous lesions was analyzed. Results The positive detection rate of HPV16 in cervicitis tissues was 8.33%， which was significantly lower than that in cervical intraepithelial neoplasia（31.25%）， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The positive rate of HPV16 in CIN tissues（31.25%） was significantly lower than that in cervical squamous cell carcinoma（CSCC） tissues（79.10%） （P<0.05）. The positive expression rate of HLA-Ⅰprotein in cervicitis tissue was 95.83%， which was significantly higher than that in CIN tissue （40.63%）（P<0.05）. The positive expression rate of HLA-Ⅰprotein in CIN tissues （40.63%） was significantly higher than that in CSCC tissues（19.40%）（P<0.05）. The positive expression rate of HLA-Ⅰprotein in cervical cancer was closely related to the differentiation， clinical stage and lymph node metastasis of cervical cancer tissues（P<0.05）. Correlation analysis showed that HPV16 infection was significantly negatively correlated with HLA-Ⅰprotein expression（r=-0.748， P<0.05）. Conclusion HLA-Ⅰ expression and high-risk HPV16 infection are closely related to the progression of cervical lesions to cervical cancer， and HLA-Ⅰprotein expression is negatively correlated with HPV16 infection.

[Key words] Cervical cancer； Precancerous lesions； Human papillomavirus 16； Human leukocyte antigenⅠ

宮頸癌是臨床上女性最為常見的惡性腫瘤之一[1]，是全球范圍內(nèi)僅次于乳腺癌的女性第二大惡性腫瘤[2]。近年來，我國女性宮頸癌發(fā)病率呈現(xiàn)明顯增長趨勢，嚴(yán)重威脅了我國女性的身體健康及生命安全[3]。早期診斷并及時(shí)采取治療措施對臨床治療宮頸癌具有重要意義，但目前由于宮頸癌發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，臨床仍缺乏特效性診斷及治療藥物[4]。本研究旨在探討宮頸癌及癌前病變患者高危型人乳頭狀瘤病毒16（human papillomavirus 16，HPV16）感染與人類白細(xì)胞抗原Ⅰ（human leukocyte antigen Ⅰ， HLA-Ⅰ）表達(dá)的關(guān)系，試圖為宮頸癌早期診斷及闡明宮頸癌發(fā)病機(jī)制提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年4月～2016年4月我院行手術(shù)切除術(shù)或婦科檢查的123例宮頸病變患者為研究對象，所有患者臨床資料齊全，且術(shù)前均未接受任何放化療及激素治療，未合并其他惡性腫瘤性疾病，年齡30～64歲，平均（41.57±5.32）歲，經(jīng)病理學(xué)診斷，宮頸炎24例，宮頸內(nèi)上皮瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）32例，宮頸鱗癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）67例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行，標(biāo)本采集符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2主要試劑

氯仿、異丙醇、異戊醇、DNA純化試劑盒、PCR試劑盒，均購于上海生工公司；S-P試劑盒、DAB顯色試劑盒，均購于北京中杉金橋技術(shù)公司；鼠抗人HLA-Ⅰ單克隆抗體、廣譜型二抗，購于美國Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取及HPV16陽性擴(kuò)增 采用酚/氯仿抽提法提取新鮮標(biāo)本組織總DNA，利用DNA純化試劑盒進(jìn)行DNA純化。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），以β-actin擴(kuò)增陽性的DNA為模板進(jìn)行HPV16片段擴(kuò)增，所有引物由上海生工合成。具體操作嚴(yán)格按照PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測HPV16陽性情況，以452bp處出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物為HPV陽性，表示組織受HPV感染，若無則為陰性，表示無HPV感染。引物序列見表1。

1.3.2 免疫組化方法檢測HLA-Ⅰ蛋白表達(dá) 所取標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制作厚度為4 μm的石蠟切片；采用免疫組化S-P（streptavidin-perosidase）方法，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，采用S-P試劑盒檢測石蠟切片中HLA-Ⅰ表達(dá)，用已知陽性切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明進(jìn)行。

1.4 S-P結(jié)果判定

以胞膜/胞醬染色呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。高倍鏡下觀察，以細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞所占百分比評分乘積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2[5]。以0～2分為陰性，標(biāo)記為（-）；≥3分為陽性，標(biāo)記為（+）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV16在不同宮頸病變組織中檢出情況比較

宮頸炎組織中HPV16陽性檢出率為8.33%，明顯低于CIN組織中HPV陽性檢出率（31.25%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CIN組織中HPV陽性檢出率為31.25%，明顯低于CSCC組織中陽性檢出率（79.10%）（P<0.05）。見表3。

2.2 HLA-Ⅰ蛋白在不同宮頸病變中的表達(dá)情況比較

宮頸炎組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率為95.83%，明顯高于CIN組織陽性表達(dá)率（40.63%）（P<0.05），CIN組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率為40.63%，明顯高于CSCC組織中陽性表達(dá)率（19.40%）（P<0.05）。見表4。

2.3 HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征之間的關(guān)系

宮頸癌組織中HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)與患者年齡無相關(guān)性（P>0.05），宮頸癌低分化組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率為27.91%，明顯高于高分化組織陽性表達(dá)率（4.17%）（P<0.05）；宮頸癌臨床分期Ⅰ期組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率為40.00%，明顯高于臨床分期Ⅱ期、Ⅲ期陽性表達(dá)率（12.50%、6.67%）（P<0.05），臨床分期Ⅱ期、Ⅲ期組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；宮頸癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率為23.53%，明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織陽性表達(dá)率（3.85%）（P<0.05）。見表5。

2.4 HPV16與HLA-Ⅰ的相關(guān)性

采用Spearman秩相關(guān)性分析結(jié)果可見，HPV16感染與HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.748，P<0.05），隨HPV感染率升高，HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率呈明顯下降趨勢（P<0.05）。見圖1。

3 討論

宮頸癌在我國發(fā)病率位居女性生殖道惡性腫瘤之首。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)[6]，全球范圍內(nèi)，每年新增宮頸癌發(fā)病病例約50萬例，而我國發(fā)病病例可達(dá)14萬。我國宮頸癌發(fā)病年齡多見于35歲之后，以45～50歲為高發(fā)。臨床研究證實(shí)[7]，早期宮頸癌患者治愈率明顯高于晚期者，但由于現(xiàn)有診斷技術(shù)主要依賴于宮頸癌明顯癥狀，大部分患者特征性臨床癥狀出現(xiàn)較晚，嚴(yán)重影響了宮頸癌的早期預(yù)警及有效診斷，導(dǎo)致許多患者失去治療最佳時(shí)機(jī)。目前，尋找新型早期診斷腫瘤標(biāo)志物是宮頸癌治療亟待解決的關(guān)鍵問題[8]。

目前，宮頸癌發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，普遍認(rèn)為其發(fā)病取決于病毒、宿主以及環(huán)境協(xié)同等三方面因素，其中HPV持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)病最為重要的因素之一[9]。研究表明[10]，HPV持續(xù)性感染與宮頸疾病惡化密切相關(guān)，是反映宮頸病變嚴(yán)重程度的預(yù)測指標(biāo)之一。HPV16是高危型HPV，可影響宿主細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)以及正常蛋白質(zhì)功能，從而改變細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)以及抗原呈遞等一系列重要機(jī)制，促進(jìn)細(xì)胞增長繁殖，誘導(dǎo)細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視并誘發(fā)腫瘤[11]。大量研究表明[12-13]，高危型HPV16感染與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。HLA-Ⅰ是由β2-MG輕鏈與糖蛋白重鏈組成的抗原分子，主要功能是將內(nèi)源性抗原肽呈遞到細(xì)胞表面[14]。當(dāng)機(jī)體蛋白酶復(fù)合物降解細(xì)胞內(nèi)病毒或者異常蛋白并且產(chǎn)生內(nèi)源性抗原肽后，HLA-Ⅰ可以在抗原呈遞元件協(xié)助下完成抗原肽組裝負(fù)載以及提呈，實(shí)現(xiàn)CD8+CTL對病毒抗原或自身異常蛋白的識別以及免疫監(jiān)視，從而起到調(diào)節(jié)適應(yīng)性以及天然免疫應(yīng)答的作用。研究表明[15]，HLA-Ⅰ類基因表達(dá)缺失與宮頸癌發(fā)病及發(fā)展密切相關(guān)，與宮頸癌患者生存率下降同樣存在密切關(guān)系。因此，本研究旨在探討宮頸癌及癌前病變患者高危型HPV16感染與HLA-Ⅰ表達(dá)的關(guān)系，為宮頸癌早期診斷及闡明宮頸癌發(fā)病機(jī)制提供一定理論依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，宮頸炎組織中HPV16陽性檢出率為8.33%，明顯低于CIN組織中HPV16陽性檢出率（31.25%），CIN組織中HPV16陽性檢出率（31.25%）明顯低于CSCC組織中陽性檢出率（79.10%），說明隨宮頸病變程度加深，HPV16感染率呈明顯升高趨勢，CSCC組織中感染率最高，HPV16感染是一個(gè)較長的過程，CIN發(fā)展成為CSCC期間，HPV16可協(xié)助腫瘤細(xì)胞影響機(jī)體基因表達(dá)，幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視以及清除，從而導(dǎo)致腫瘤擴(kuò)散最終致癌；宮頸炎組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率為95.83%，明顯高于CIN組織陽性表達(dá)率（40.63%），CIN組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率（40.63%）明顯高于CSCC組織中陽性表達(dá)率（19.40%），說明隨著宮頸疾病惡性程度加深，HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率逐漸減少，嚴(yán)重宮頸疾病中存在HLA-Ⅰ表達(dá)缺陷，提示HLA-Ⅰ表達(dá)缺陷與宮頸癌發(fā)生有關(guān)，可作為宮頸癌前病變進(jìn)展成為宮頸癌的腫瘤標(biāo)記物。宮頸癌組織中HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)與患者年齡無相關(guān)性，但隨宮頸癌組織分化、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)明顯下降趨勢，說明隨著宮頸癌病情加重，HLA-Ⅰ表達(dá)缺陷越為嚴(yán)重，HLA-Ⅰ表達(dá)缺陷導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更易于逃避免疫監(jiān)視及清除，從而導(dǎo)致疾病進(jìn)展及轉(zhuǎn)移。相關(guān)性分析結(jié)果可見，HPV16感染與HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，隨HPV16感染率升高，HLA-Ⅰ蛋白陽性表達(dá)率呈明顯下降趨勢，即HLA-Ⅰ表達(dá)缺陷率明顯升高，推測在宮頸疾病進(jìn)展中，HPV16可整合到HLA-Ⅰ內(nèi)，導(dǎo)致HLA-Ⅰ基因發(fā)生突變、缺失，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸并最終致癌，其具體作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究[16-20]，HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征關(guān)系方面，本研究結(jié)果顯示HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)與組織分化、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素存在顯著相關(guān)性（P<0.05），這些因素是宮頸癌病變的高危因素，需要引起醫(yī)務(wù)人員的高度重視。

本研究結(jié)果表明，HLA-Ⅰ表達(dá)及高危型HPV感染與宮頸病變進(jìn)展為宮頸癌密切相關(guān)，推測HLA-Ⅰ表達(dá)缺陷可作為宮頸癌前病變進(jìn)展為宮頸癌的重要預(yù)警標(biāo)志，HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)與HPV感染呈明顯負(fù)相關(guān)，為闡明宮頸癌發(fā)病機(jī)制提供了一定依據(jù)，其具體相互作用機(jī)制，有待于進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2017-02-15）