生防枯草芽孢桿菌210發(fā)酵工藝優(yōu)化

鄒高溪，趙春田，裘娟萍

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

生防枯草芽孢桿菌210發(fā)酵工藝優(yōu)化

鄒高溪，趙春田，裘娟萍*

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

采用響應(yīng)面法，優(yōu)化抗真菌的枯草芽孢桿菌210的發(fā)酵工藝，提高芽孢產(chǎn)量。結(jié)果顯示，影響芽孢產(chǎn)量最主要的3個(gè)因素為玉米粉、蛋白胨和KH2PO4用量，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：玉米粉10.75 g·L-1、黃豆粉9.00 g·L-1、蛋白胨6.97 g·L-1、KH2PO40.66 g·L-1、NaCl 4.00 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.60 g·L-1、CaCl23.00 g·L-1、MnSO4·H2O 0.60 g·L-1?；趦?yōu)化配方通過(guò)單因素優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度31 ℃、裝液量30 mL·250 mL-1、接種量4%?？莶菅挎邨U菌210在上述優(yōu)化后的條件下培養(yǎng)，芽孢產(chǎn)量達(dá)到1.64×1010cfu·mL-1，較優(yōu)化前提高6.5倍。

枯草芽孢桿菌；發(fā)酵工藝；響應(yīng)面法

植物病害是造成農(nóng)業(yè)損失的主要因素之一，目前生產(chǎn)上主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治?；瘜W(xué)農(nóng)藥的不當(dāng)使用可能引發(fā)嚴(yán)重環(huán)境問(wèn)題，破壞生態(tài)平衡，威脅農(nóng)產(chǎn)品安全[1]。作為一種替代方案，利用微生物(生防菌)防治植物病害在近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注[2-3]。

枯草芽孢桿菌是一種優(yōu)良的生防菌，它能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，這些抗菌物質(zhì)對(duì)人畜安全，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，且不易產(chǎn)生抗藥性，加之枯草芽孢桿菌本身具有生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、芽孢抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，十分有利于生防菌的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖[4]。目前，枯草芽孢桿菌作為生防菌已經(jīng)在生產(chǎn)中得到應(yīng)用：含有枯草芽孢桿菌的微生物農(nóng)藥“百抗”對(duì)水稻紋枯病的防效達(dá)70%以上；武漢天惠生物工程有限公司開(kāi)發(fā)的枯草芽孢桿菌Bs-208殺菌劑是多種植物病原菌的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑[5]。研究發(fā)現(xiàn)，不同枯草芽孢桿菌菌株在營(yíng)養(yǎng)需求方面存在顯著差異，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化能夠快速有效地提高相應(yīng)菌株的芽孢產(chǎn)量[6]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)前期分離篩選得到1株枯草芽孢桿菌210，對(duì)常見(jiàn)的植物病源真菌具有良好的拮抗作用。本研究擬應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化枯草芽孢桿菌210產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基，采用單因素試驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵條件，旨在提高芽孢產(chǎn)量，為生防菌210的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種及培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)210，浙江工業(yè)大學(xué)微生物研究所保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面及平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖10.00，蛋白胨10.00，牛肉膏5.00，NaCl 5.00，瓊脂15.00～20.00，pH值7.0(滅菌前)，115 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖5.00，蛋白胨5.00，NaCl 5.00，MgSO4·7H2O 0.20，KH2PO40.20，pH值7.0(滅菌前)，115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：玉米粉12.00，黃豆粉6.00，蛋白胨4.00，NaCl 4.00，MgSO4·7H2O 0.40，KH2PO40.40，CaCl22.00，MnSO4·H2O 0.60，pH值7.0(滅菌前)，121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)條件：用接種環(huán)在甘油管中取枯草芽孢桿菌210在斜面上劃線接種進(jìn)行活化，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

種子培養(yǎng)條件：將活化的枯草芽孢桿菌210接種到種子培養(yǎng)基中，裝液量30 mL·250 mL-1，200 r·min-1，37 ℃培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵培養(yǎng)條件：按4%接種量將種子液接種到裝液量50 mL·250 mL-1發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r·min-1，37 ℃培養(yǎng)72 h。

1.2.2 細(xì)胞數(shù)及芽孢數(shù)測(cè)定

發(fā)酵液于80 ℃水浴加熱30 min后，采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法[7]測(cè)定芽孢數(shù)，每個(gè)稀釋度平行重復(fù)3次。

1.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.1 Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)

取玉米粉(A)、黃豆粉(B)、蛋白胨(C)、NaCl(E)、MgSO4·7H2O(F)、KH2PO4(G)、CaCl2(I)、MnSO4·H2O(J)作為PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)的8個(gè)因素，每個(gè)因素取高低2個(gè)水平，低水平(-1)為初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度，高水平(+1)取低水平的1.5倍(表1)。選用n=12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)表，以單位體積發(fā)酵液芽孢數(shù)為響應(yīng)值。

1.3.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果確定的3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，以各顯著因素的正負(fù)效應(yīng)確定最陡爬坡試驗(yàn)的方向，以適當(dāng)?shù)臐舛忍荻雀淖優(yōu)樽兓介L(zhǎng)，快速逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.3.3 Box-behnken設(shè)計(jì)

以PB試驗(yàn)篩選得到的3個(gè)因素為設(shè)計(jì)因素，以最陡爬坡試驗(yàn)得出的濃度作為中心點(diǎn)，分別取高(+1)、中(0)、低(-1)3個(gè)水平進(jìn)行Box-behnken設(shè)計(jì)，以發(fā)酵液?jiǎn)挝惑w積芽孢數(shù)作為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.05b軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

取最佳培養(yǎng)基配方進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取平均值，驗(yàn)證模型是否可靠，進(jìn)而得出最終優(yōu)化結(jié)果。

1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

在優(yōu)化培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，分別對(duì)枯草芽孢桿菌210的培養(yǎng)溫度(28、31、34、37、40 ℃)、接種量(30、40、50、60 mL·250 mL-1)、裝液量(2%、3%、4%、5%、6%)等發(fā)酵條件進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基主要組分篩選

采用Plackett-Burman法，研究枯草芽孢桿菌210發(fā)酵培養(yǎng)基8個(gè)組分對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響，培養(yǎng)72 h后測(cè)定發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)表1。應(yīng)用Minitab 17軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組分所代表的高低水平及其方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。

由表1和表2可知，培養(yǎng)基組分對(duì)芽孢產(chǎn)量影響顯著的3個(gè)因素為：A(玉米粉)、C(蛋白胨)和G(KH2PO4)，這3個(gè)因素對(duì)芽孢產(chǎn)量(Y)的影響可用回歸方程Y=3.62-0.42A+0.53C+0.37G表示，該回歸方程的決定系數(shù)R2=0.998 3，大于0.95，說(shuō)明回歸方程擬合程度良好。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，選擇玉米粉、蛋白胨、KH2PO4進(jìn)行爬坡試驗(yàn)，以尋找最適的濃度配比。由表2可知，玉米粉對(duì)芽孢產(chǎn)量具有負(fù)效應(yīng)，蛋白胨、KH2PO4對(duì)芽孢產(chǎn)量具有正效應(yīng)；因此要提高芽孢產(chǎn)量，應(yīng)適當(dāng)降低玉米粉的濃度，提高蛋白胨、KH2PO4的濃度。最陡爬坡試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見(jiàn)表3。可以看出，4號(hào)試驗(yàn)組的芽孢產(chǎn)量最高，說(shuō)明在玉米粉10.00 g·L-1、蛋白胨7.50 g·L-1、KH2PO40.75 g·L-1條件下，發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)量最大。

2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

利用Design-Expert 8.05b軟件中的Box-Behnken，選擇玉米粉(X1)、蛋白胨(X2)、KH2PO4(X3)進(jìn)行3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表4)：X1，9.00(-1水平)、10.00(0水平)、11.00(+1水平)；X2，6.50(-1水平)、7.50(0水平)、8.50(+1水平)；X3，0.65(-1水平)、0.75(0水平)、0.85(+1水平)。測(cè)定各試驗(yàn)組芽孢產(chǎn)量。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)各變量對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

Table 1 Effect of variables (in coded levels) in the Plackett-Burman design on spore yield

序號(hào)No．ABCDEFGHIJ芽孢Spores/(109cfu·mL-1)1-1-1+1+1+1-1+1+1-1+15 072+1+1-1+1+1-1+1-1-1-13 603-1+1+1-1+1-1-1-1+1+14 374-1-1-1+1+1+1-1+1+1-12 935+1-1+1+1-1+1-1-1-1+13 176+1-1+1-1-1-1+1+1+1-13 337+1-1-1-1+1+1+1-1+1+12 338-1+1-1-1-1+1+1+1-1+14 009-1-1-1-1-1-1-1-1-1-12 1810+1+1+1-1+1+1-1+1-1-13 3011-1+1+1+1-1+1+1-1+1-15 6012+1+1-1+1-1-1-1+1+1+13 50

D、H為虛擬項(xiàng)。

The term of D and H were virtual items.

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子、水平及效應(yīng)

Table 2 Variables， levels and effects in the Plackett-Burman design

編碼Term變量因素Variable水平Level/(g·L-1)(-1)(+1)效應(yīng)Effect[ (+)- (-)]/6相對(duì)置信度RelativeconfidenceT值T?valueP值P?valueA玉米粉Cornflour12 0018 00-0 8352-10 510 060?B黃豆粉Soybeanmeal6 009 000 30954 310 157C蛋白胨Peptone4 006 001 06513 400 047??ENaCl4 006 00-0 0128-0 160 898FMgSO4·7H2O0 400 60-0 1352-1 700 338GKH2PO40 400 600 73159 200 069?ICaCl22 003 000 14251 790 324JMnSO4·7H2O0 600 900 26523 340 185

*和**分別表示P<0.1和P<0.05。

*and**indicatedP<0.1 andP<0.05， respectively.

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

Table 3 Design and results of steepest ascent experiment

序號(hào)No．玉米粉Cornflour/(g·L-1)蛋白胨Peptone/(g·L-1)KH2PO4/(g·L-1)芽孢Spores/(109cfu·mL-1)116 003 000 302 70214 004 500 454 37312 006 000 605 63410 007 500 756 7758 009 000 904 47

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 4 Design and results of the Box-Behnken experiment

序號(hào)No．X1X2X3芽孢Spores/(109cfu·mL-1)10007 672-1+105 703+1-106 974-1-105 5050+1+14 8060+1-15 177+10+16 4780-1-18 539-10-16 9310-10+15 0711+1-106 53120007 67130007 60140007 5315+10-17 83160-1+15 50170007 67

應(yīng)用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到芽孢產(chǎn)量(Y)的多元回歸模型：

Y=7.63+0.58X1-0.54X2-0.83X3-0.16X1X2+0.12X1X3+0.67X2X3-0.44X12-1.02X22-0.62X3。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5?？梢钥闯?，玉米粉、蛋白胨和KH2PO4對(duì)芽孢產(chǎn)量均具有顯著(P<0.05)影響，回歸模型P值<0.01，達(dá)極顯著水平，失擬項(xiàng)的P值<0.000 1，亦達(dá)極顯著水平，說(shuō)明所構(gòu)建的回歸模型顯著。決定系數(shù)R2=0.914 8，大于0.90，說(shuō)明回歸模擬程度好。

為進(jìn)一步研究相關(guān)變量因素之間的交互作用以確定最優(yōu)點(diǎn)，利用Design-Expert 8.05b軟件分析二次回歸模型，繪制3個(gè)影響因子之間的響應(yīng)面分析立體圖和等高線圖(圖1)。圖中的等高線均呈橢圓形，表明各圖中交互作用顯著。將多元回歸模型中的各自變量(X1、X2、X3)分別求一階偏導(dǎo)數(shù)并均令其為0，得到1個(gè)三元一次線性方程組，解此方程組得到模型預(yù)測(cè)最佳點(diǎn)，玉米粉、蛋白胨和KH2PO4最佳添加量分別為10.75、6.97、0.66 g·L-1，該條件下，模型預(yù)測(cè)芽孢產(chǎn)量為8.37×109cfu·mL-1。

表5 芽孢產(chǎn)量回歸模型的方差分析

Table 5 Analysis of variance (ANOVA) as regression model of spore yield

方差來(lái)源Source自由度df平方和Sumofsquares均方差MeansquareF值F?valueP值P?value模式Model919 852 218 350 0053??X112 562 6510 020 0158?X212 312 318 750 0211?X315 505 5020 830 0026??X1X210 100 100 380 5568X1X310 060 060 240 6414X2X311 781 786 730 0357?X2110 820 823 110 1210X2214 354 3516 490 00481??X2311 601 606 070 0433?殘差Residual71 850 26失擬項(xiàng)Lackoffit31 840 61275 17<0 0001??純誤差Pureerror48 91E?0032 23E?003所有項(xiàng)Cortotal1621 69

*與**分別表示P<0.05與P<0.01。

*and**indicatedP<0.05 andP<0.01， respectively.

圖1 玉米粉、KH2PO4和蛋白胨對(duì)芽孢產(chǎn)量影響的響應(yīng)面分析立體圖(左)及相應(yīng)的等高線圖(右)Fig.1 Contour plot analysis (left) and response surface plot analysis (right) into the effects of corn flour， KH2PO4 and peptone on spore yield

2.4 優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行3個(gè)批次的搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，驗(yàn)證搖瓶發(fā)酵結(jié)果。芽孢產(chǎn)量分別為7.8×109、8.2×109、8.5×109cfu·mL-1，平均為8.17×109cfu·mL-1，模型預(yù)測(cè)的最高芽孢產(chǎn)量為8.37×109cfu·mL-1，兩者比較接近，與優(yōu)化前芽孢產(chǎn)量2.19×109cfu·mL-1相比提高了2.7倍。

2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.5.1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)枯草芽孢桿菌210芽孢產(chǎn)量的影響

如圖2所示，31 ℃條件下，枯草芽孢桿菌的芽孢產(chǎn)量最高，達(dá)到1.2×1010cfu·mL-1，為枯草芽孢桿菌210產(chǎn)芽孢最適溫度。高于31 ℃的溫度下，細(xì)胞數(shù)、芽孢數(shù)及芽孢形成率都隨著溫度提高而降低。

2.5.2 不同裝液量對(duì)枯草芽孢桿菌210芽孢產(chǎn)量的影響

如圖3所示，隨著裝液量增加，細(xì)胞數(shù)、芽孢數(shù)及芽孢形成率均減少。30 mL·250 mL-1的裝液量為枯草芽孢桿菌210菌株產(chǎn)芽孢的最佳裝液量，芽孢產(chǎn)量達(dá)到1.67×1010cfu·mL-1。這可能是因?yàn)樵摼暝谏L(zhǎng)繁殖過(guò)程中需要消耗大量的氧，裝液量增加會(huì)降低溶氧，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而降低芽孢的形成。但裝液量太少則會(huì)降低發(fā)酵規(guī)模增加能耗。

2.5.3 不同接種量對(duì)枯草芽孢桿菌210芽孢產(chǎn)量的影響

菌種生長(zhǎng)繁殖的速度取決于接種量大小，接種量過(guò)大增加生產(chǎn)成本，過(guò)小則會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，降低發(fā)酵生產(chǎn)率。如圖4所示，接種量為4%時(shí)，枯草芽孢村桿菌210菌株在發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)量達(dá)到1.64×1010cfu·mL-1，過(guò)高或過(guò)低的接種量下芽孢產(chǎn)量都會(huì)降低，因此4%的接種量為枯草芽孢桿菌210產(chǎn)芽孢的最佳接種量。

圖2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)枯草芽孢桿菌210芽孢產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of culture temperature on spore yield of Bacillus subtillis 210

圖3 不同裝液量對(duì)枯草芽孢桿菌210芽孢產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fluid volume on spore yield of Bacillus subtilis 210

圖4 不同接種量對(duì)枯草芽孢桿菌210芽孢產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of inoculum size on spore yield of Bacillus subtilis 210

3 結(jié)論

為提高生防枯草芽孢桿菌210的芽孢產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，本研究通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)、響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米粉10.75 g·L-1、蛋白胨6.97 g·L-1、黃豆粉9.00 g·L-1、KH2PO40.66 g·L-1、NaCl 4.00 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.60 g·L-1、CaCl23.00 g·L-1、MnSO4·H2O 0.60 g·L-1。對(duì)比優(yōu)化前培養(yǎng)基配方，該優(yōu)化配方降低了玉米粉含量，增加了蛋白胨和KH2PO4含量。驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，芽孢產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了2.7倍，平均達(dá)到8.17×109cfu·mL-1?；趦?yōu)化后的培養(yǎng)基，通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件：培養(yǎng)溫度31 ℃、搖瓶裝液量30 mL·250 mL-1，接種量4%。應(yīng)用優(yōu)化配方及工藝，枯草芽孢桿菌210的芽孢產(chǎn)量達(dá)到1.64×1010cfu·mL-1，較優(yōu)化前提高了6.5倍。試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)的發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)提高芽孢產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 高 峻)

Optimization of fermentation technology of biocontrol bacteriumBacillussubtilis210 by response surface analysis

ZOU Gaoxi， ZHAO Chuntian， QIU Juanping*

(CollegeofBiotechnologyandBioengineering，ZhejiangUniversityofTechnology，Hangzhou310014，China)

In order to increase the spore yield， the fermentation technology ofBacillussubtilis210 with antifungal activity was optimized. It was shown that the main factors influencing spore production were doses of corn flour， peptone and KH2PO4. The optimal fermentation medium was as follows: corn flour 10.75 g·L-1， soybean meal 9.00 g·L-1， peptone 6.97 g·L-1， KH2PO40.66 g·L-1， NaCl 4.00 g·L-1， MgSO4·7H2O 0.60 g·L-1， CaCl23.00 g·L-1and MnSO4·H2O 0.60 g·L-1. Based on the single factor optimization experiment results， the optimal culture conditions were as follows∶culture temperature 31 ℃，fluid volume 30 mL·250 mL-1，inoculum size 4%. With the optimal fermentation condition， the spore yield ofBacillussubtilis210 reached 1.64×1010cfu·mL-1， and was increased by 6.5 fold as compared with the spore yield before fermentation technology optimization.

Bacillussubtilis; fermentation technology; response surface analysis

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.16

2016-12-15

浙江省重中之重學(xué)科開(kāi)放研究基金(20150109)

鄒高溪(1991—)，男，湖南永州人，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。E-mall: 1575392595@qq.com

S482.7

A

1004-1524(2017)05-0799-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 799-805

鄒高溪，趙春田，裘娟萍.生防枯草芽孢桿菌210發(fā)酵工藝優(yōu)化[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(5)： 799-805.

*通信作者，裘娟萍，E-mall: qiujping@zjut.edu.cn