革胡子鯰的鰤諾卡氏菌感染

王 芳，常藕琴，顏遠義，姜 蘭，劉 春，李凱彬，*

(1.中國水產(chǎn)科學研究院 珠江水產(chǎn)研究所， 廣東 廣州 510380； 2.廣東省水生動物疫病預防控制中心，廣東 廣州 510222)

革胡子鯰的鰤諾卡氏菌感染

王 芳1，常藕琴1，顏遠義2，姜 蘭1，劉 春1，李凱彬1，*

(1.中國水產(chǎn)科學研究院 珠江水產(chǎn)研究所， 廣東 廣州 510380； 2.廣東省水生動物疫病預防控制中心，廣東 廣州 510222)

諾卡氏菌病感染多種養(yǎng)殖魚類，且病程漫長，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來較大危害。試驗于池塘養(yǎng)殖的革胡子鯰中發(fā)現(xiàn)了結(jié)節(jié)病，病魚體色發(fā)暗，偶有皮膚潰爛，腎臟、肝臟等內(nèi)臟出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀病變。組織壓片發(fā)現(xiàn)典型的肉芽腫結(jié)構(gòu)，通過抗酸染色可觀察到大量染成特異深紅色的菌體成團存在。組織切片觀察到在腎臟、肝臟、脾臟等器官均有結(jié)節(jié)病變，并伴有不同程度的組織損傷。從腎臟等組織分離到菌落形態(tài)一致的細菌，經(jīng)回歸感染能在健康魚體內(nèi)復制出典型的結(jié)節(jié)癥狀。生化鑒定和分子鑒定結(jié)果表明，獲得的菌株為鰤諾卡氏菌。故革胡子鯰的結(jié)節(jié)病由鰤諾卡氏菌感染所致，這是該菌感染革胡子鯰的首次報道，或與其養(yǎng)殖模式密切相關(guān)。

鰤諾卡氏菌；革胡子鯰；肉芽腫；感染

諾卡氏菌為一種放線菌， 在陸地和水環(huán)境中廣泛分布，包括水、土壤、底泥以及腐爛的動植物組織[1]。水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，諾卡氏菌是一種典型的條件致病菌，雖然水體環(huán)境細菌的含量并不高，由于養(yǎng)殖的集約化程度高，養(yǎng)殖密度大，魚體容易體質(zhì)下降或損傷，給病原菌提供了可趁之機[2-7]。在我國，魚類諾卡氏菌病發(fā)生于大口黑鱸、鱧、大黃魚、七星鱸、鰤、鯛、鲀、鲆等眾多水產(chǎn)養(yǎng)殖品種[2-9]，特別是廣東、福建和浙江等南方地區(qū)，有大范圍蔓延的趨勢，且高密度、集約化的養(yǎng)殖模式更易于諾卡氏菌病的感染，已成為養(yǎng)殖過程的主要病害之一，其危害日益嚴重。僅廣東的雜交鱧養(yǎng)殖，每年諾卡氏菌病造成的損失便已超過億元，已引起水產(chǎn)主管部門和專業(yè)人士的高度重視。

革胡子鯰(Clariasgariepinus) 原產(chǎn)于非洲，1980年我國廣東省自埃及引進并馴養(yǎng)成功，故又稱埃及塘虱。革胡子鯰食性雜，生命力頑強，環(huán)境適應性好，對水質(zhì)要求不高，且有鰓上輔助呼吸結(jié)構(gòu)，溶氧不足時可通過吞咽空氣方式進行呼吸，特別適合于高密度的池塘養(yǎng)殖。同時，革胡子鯰有較強的抗病力，除了苗期的車輪蟲、柱狀黃桿菌等常見寄生蟲和細菌感染，在商品養(yǎng)殖期間病害較少[10-11]。與我國南方土著品種胡子鯰比較，革胡子鯰體型大，生長速度快，對飼料的要求也低，飼養(yǎng)管理簡單，曾經(jīng)為我國南方的重要養(yǎng)殖品種。由于革胡子鯰養(yǎng)殖特點和優(yōu)點，為了節(jié)約成本，廣東地區(qū)革胡子鯰養(yǎng)殖一般集中于中心城市附近，以市場畜禽、水產(chǎn)屠宰的下腳料和廢棄物為飼料；養(yǎng)殖密度大，每667 m2水面年養(yǎng)殖量可達10 t以上，且很多魚塘不具備水交換條件，大量投喂使得水體環(huán)境急劇惡化，為疾病防控增加了極大壓力。2013年和2014年，我們分別在廣州、佛山等地革胡子鯰養(yǎng)殖病魚中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)臟和皮膚的結(jié)節(jié)，并分離到諾卡氏菌，經(jīng)鑒定為鰤諾卡氏菌，可感染革胡子鯰并復制出相似癥狀。現(xiàn)將相關(guān)研究報道如下。

1 材料與方法

1.1 病魚來源及其表現(xiàn)癥狀

發(fā)病魚塘位于廣州市蘿崗區(qū)和佛山市南海區(qū)。了解魚塘的發(fā)病過程及水環(huán)境概況，觀察病魚發(fā)病的表現(xiàn)，解剖分析其體內(nèi)的發(fā)病癥狀。

1.2 病原菌株的分離

典型癥狀的病魚用水洗凈，75%乙醇體表消毒。滅菌剪刀解剖病魚，用已消毒的接種環(huán)挑取肝、腎、脾、皮下出現(xiàn)結(jié)節(jié)位置組織，分別在血瓊脂平板和腦心浸出液平板劃線，然后將平板放置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況及其形態(tài)。

1.3 回歸感染

由于諾卡氏菌在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為干酪狀，直接懸于水中無法將單個細菌分開。故在平板上用接種環(huán)挑取特征明顯菌落，于滅菌碾缽中充分碾壓將其中細菌分開，再溶于生理鹽水中并離心洗2～3次，分別稀釋成1.0×108、1.0×109cfu·mL-1的細菌懸液。選取健康革胡子鯰進行回歸感染，每尾平均體重為63.8 g，分別設立上述2種濃度菌液感染組和生理鹽水對照組，每組10尾魚，采用腹腔注射方式感染，注射量為每尾魚0.2 mL。注射后各組分別飼養(yǎng)于160 L魚缸中，養(yǎng)殖水溫保持在(27±2)℃，全天充氣，每天投餌、換水等相應管理，定時將死亡或瀕死的魚撈出，觀察記錄。瀕死魚內(nèi)臟用血瓊脂平板進行細菌分離。

1.4 病原菌的生化及分子鑒定

諾卡氏菌分離株的鑒定參照伯杰氏細菌鑒定手冊及中科院微生物研究所放線菌分類組的方法[12-14]，內(nèi)容包括菌株的酶類產(chǎn)生、水解活性、碳源利用及溫度、鹽度和pH耐受性等。

分離自革胡子鯰的2株菌株，分別用細菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen)提取DNA，方法參考試劑盒說明書，DNA于-20 ℃保存。以提取的基因組DNA為模板用針對16S rRNA的引物進行PCR擴增，上游引物序列為：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′，下游引物序列為：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。擴增體系為50 μL，反應條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃ 30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)后72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠回收試劑盒進行純化后，將回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，由廣州艾基生物技術(shù)有限公司進行測序。測序結(jié)果應用BLAST進行序列比對，使用ClustalW1.8 軟件， 與NCBI登錄的不同諾卡氏菌16S rRNA進行多序列比對， 并采用MEGA 4.0軟件包構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[15-16]。

1.5 病理學觀察

剪取出現(xiàn)結(jié)節(jié)附近組織，直接壓片，于顯微鏡下觀察是否有肉芽腫結(jié)構(gòu)存在；抗酸染色法對壓片進行染色，顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。感染特征明顯的脾、腎等組織，樣品用Bouin’s 液固定24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。輪轉(zhuǎn)式切片機連續(xù)切片，厚度為3 μm，H&E常規(guī)染色，光學顯微鏡觀察，了解其顯微結(jié)構(gòu)差異[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚的癥狀表現(xiàn)

養(yǎng)殖魚塘水體濁，可見部分病魚漂浮于水面，體色發(fā)暗，對外界擾動的反應較為遲緩；病魚體表大多有疣狀凸起，大小不一，有的凸起潰破發(fā)紅，剪開或可見膿狀物；解剖魚體，發(fā)現(xiàn)脾臟和頭腎腫大，且可在腎、脾、肝、心等處發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)狀增生物，其中以腎臟和脾臟尤為明顯(圖1)。

壓片發(fā)現(xiàn)，患病革胡子鯰的脾臟、腎臟、皮下等組織均可觀察到結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)存在，結(jié)節(jié)的大小不一，外有明顯的膜狀結(jié)構(gòu)包圍，呈散在分布(圖2-A)。抗酸染色法可在病變組織壓片中將諾卡氏菌染成紫紅色，細菌呈線狀，菌絲纏繞成團存在(圖2-B)；部分菌絲出現(xiàn)分枝；菌絲能觀察到許多隔斷，將其分成若干桿狀菌體。

2.2 細菌分離

肝、腎、脾、皮下等組織均可分離到菌落形態(tài)一致的細菌。該菌在體外生長緩慢，28 ℃條件下，血瓊脂平板上要2～4 d才出現(xiàn)可見菌落，而在腦心浸汁瓊脂上則要4～7 d。該菌菌落形態(tài)特征十分明顯，隨培養(yǎng)時間增加而變大增厚，向外突出呈沙粒狀，質(zhì)地與干酪類似，不透明，顏色為白色。

2.3 回歸感染

感染早期試驗魚活動、攝食均表現(xiàn)正常。感染10 d后，部分個體游動緩慢，并出現(xiàn)體色發(fā)暗等癥狀，有的鰭基發(fā)紅，并逐漸發(fā)現(xiàn)有個體死亡。解剖瀕死感染魚，在腹腔中有大量的結(jié)節(jié)病變，除了肝、脾、腎等重要組織，腸系膜上也有很多白色結(jié)節(jié)出現(xiàn)；組織壓片在顯微鏡下也可觀察到結(jié)節(jié)病變，說明細菌感染能復制出了諾卡氏菌病的典型病變癥狀。在不同病變組織中都分離到了菌落形態(tài)與感染菌一致的細菌，并通過分子鑒定確認為鰤諾卡氏菌。至感染第23天，2個濃度組的感染魚全部死亡，表明分離的菌株為感染革胡子鯰致死的病原菌。

A： 感染革胡子鯰的外觀癥狀； B：腎臟的結(jié)節(jié)病變(箭頭示)； C：脾臟上的大量結(jié)節(jié)(箭頭示)A， The visible symptom of diseased Clarias gariepinus; B， off-white nodules dispersed in the kidney; C， a large amount of nodules on the spleen圖1 感染革胡子鯰內(nèi)臟可見結(jié)節(jié)病變Fig.1 The typical nodular structures in internal organs of diseased African catfish

2.4 病原菌的生理生化和分子鑒定及其系統(tǒng)進化分析

該病原菌不溶血，不能使牛奶凝固或明膠液化，不還原硝酸鹽，酪氨酸酶、氧化酶、溶菌酶陰性，過氧化氫酶陽性，水解七葉靈，能以D-葡萄糖、檸檬酸鹽為碳源生長；50 ℃處理8 h后轉(zhuǎn)接培養(yǎng)不生長。該菌生化特性、生長溫度、耐鹽性、水解以及碳源利用詳細試驗結(jié)果見表1。通過與Wang等[4]和Chen等[7]關(guān)于鰤諾卡氏菌(Nocardiaseriolae)研究的相關(guān)資料比較(表1)，發(fā)現(xiàn)其生理生化特性與上述結(jié)果基本一致。

2株革胡子鯰來源的實驗菌株目的基因經(jīng)測序，均獲得1 492 bp的16S rRNA序列，且序列完全相同。經(jīng)BLAST比對，獲得的序列與分離自高體鰤(Seriolaedumerili)的鰤諾卡氏菌16S rRNA基因(NCBI登錄號：AB255698)同源性達100%。結(jié)合本研究獲得菌株的生理生化分析以及病例感染特征等結(jié)果，進一步說明感染革胡子鯰的細菌為鰤諾卡氏菌。在此基礎上，下載NCBI登錄的不同諾卡氏菌16S rRNA基因，應用MEGA4.0軟件包構(gòu)建諾卡氏菌屬的分子進化樹(圖3)，表明依據(jù)獲得的序列能將不同諾卡氏菌區(qū)分，也一定程度呈現(xiàn)了本研究獲得菌株的分類關(guān)系[15-17]。

2.5 組織病理變化

組織切片在不同器官均發(fā)現(xiàn)了肉芽腫結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)多為近圓形，中間一般有明顯的壞死中心，外層為類上皮細胞特化而成的膜，其組織結(jié)構(gòu)與壓片觀察到的結(jié)節(jié)形狀相吻合。各主要器官伴有不同程度的組織病理變化，其中脾臟最為嚴重。脾臟被膜較為完整，紅髓和白髓沒有明顯分界，整個脾臟實質(zhì)都發(fā)現(xiàn)纖維細胞包膜的肉芽腫(圖2-C)，排列較為松散，主要由纖維結(jié)締組織和胞體較大的細胞組成；腎臟結(jié)節(jié)較脾臟少，主要由纖維細胞組成結(jié)締組織包膜包圍著壞死細胞(圖2-D)，結(jié)構(gòu)較為致密。綜合壓片和病理切片的結(jié)果分析，革胡子鯰的組織病理變化和諾卡氏菌的感染特征相符。

表1 獲得菌株的生理生化特性

Table 1 Physiological-biochemical characteristic of the isolated strain

指標Traits分離菌株Isolate參照菌株N．seriolaeATCC43993指標Traits分離菌株Isolate參照菌株N．seriolaeATCC43993碳源利用Growthonsolecarbonsources50℃放置8h-- L?阿拉伯糖Arabinose--Survivalat50℃for8h 麥芽糖Maltose--生長溫度Temperature 鼠李糖Rhamnose-- 20℃++ 海藻糖Trehalose-- 28℃++ 檸檬酸鹽Citrate++ 40℃-- 山梨醇Sorbitol--耐鹽性Salttolerance D?甘露醇Mannitol-- 1%NaCl+N D?葡萄糖D?Glucose+ 4%NaCl-- D?果糖D?fructose-水解Hydrolysis 棉籽糖Raffinose-七葉苷Aesculin++ 蔗糖Sucrose-淀粉Starch-- 乳糖Lactose-尿素Urea--H2S產(chǎn)生H2Sproduction-次黃嘌呤Hypoxanthine--溶菌酶Lysozyme-黃嘌呤Xanthine--氧化酶Oxidase--明膠液化Gelatinliquefaction--酪氨酸酶Tyrosinase--牛奶凝固Milkcoagulation+酪素Casein--硝酸鹽還原Nitratereduction--過氧化氫酶Catalase++牛奶胨化Milkpeptonization-

“+”，陽性；“-”，陰性；“N”，未測。

“+”， positive; “-”， negative; “N”， not detected.

A，脾臟直接壓片，觀察到明顯的結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)(箭頭示)； B，組織壓片的抗酸染色，成團染成深紅色的菌絲； C，脾臟切片中的肉芽腫病變，結(jié)構(gòu)松散，纖維細胞(箭頭示)包圍著類上皮細胞，中間為壞死組織(N)； D，腎臟切片，示肉芽腫結(jié)構(gòu)，中央為壞死細胞(N)，外層少量纖維細胞包圍(箭頭)A， Typical granulomas were observed in spleen via wet mount preparations; B， Hypha clustedred together in bright red were observed after acid fast stain; C， Granuloma in the spleen， necrotic area (N) was surrounded by epithelioid cells. D， Typica granuloma with marked central necrosis (N) in the kidney圖2 諾卡氏菌感染引起的革胡子鯰組織病理變化Fig.2 Histopathology of nocardiosis in African catfish

圖3 基于16s rRNA基因的諾卡氏菌屬系統(tǒng)進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of Nocardia based on 16s rRNA genes

3 討論

患病的革胡子鯰體表出現(xiàn)膿泡，主要內(nèi)臟器官均觀察到結(jié)節(jié)狀增生物，且直接壓片發(fā)現(xiàn)了典型的肉芽腫病變，這與其他魚類的諾卡氏菌感染癥狀非常接近；從病魚體內(nèi)分離到的細菌可感染革胡子鯰，復制出類似癥狀，且經(jīng)生化鑒定和分子鑒定確認為鰤諾卡氏菌，說明革胡子鯰所患為諾卡氏菌病。諾卡氏菌引起的感染是典型的慢性病，該菌可在魚體內(nèi)隱匿，一定程度上或可與魚體長期共存，一般不會導致大規(guī)模的死亡。而患病革胡子鯰每天的死亡量不多，但持續(xù)時間長，提示同一魚塘里有不同感染狀態(tài)的魚存在，這與諾卡氏菌的感染特征非常相似。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，鰤諾卡氏菌具廣泛的宿主范圍，已有大口黑鱸、烏鱧、大黃魚、七星鱸、高體鰤、卵形鯧鲹等多種魚類感染的相關(guān)報道[2-4，7-9]，宿主范圍涉及海水到淡水的不同魚類。本研究為首次于革胡子鯰病魚中分離到鰤諾卡氏菌，并證實其具感染性，而基于16S rRNA分析也發(fā)現(xiàn)該菌株與分離自海水魚鰤諾卡氏菌有較高的同源性，提示海水和淡水來源的鰤諾卡氏菌或有較近的親緣關(guān)系?，F(xiàn)有資料也表明，該菌一般不導致宿主的急性死亡，且能在魚體內(nèi)長期存在，這或為其跨物種傳播提供基礎，而傳播過程中隱含的感染、宿主病原相互作用、協(xié)同進化等均是值得研究和分析的重要問題。由于革胡子鯰價格較低，且生命力頑強，養(yǎng)殖戶多收集市場畜禽、水產(chǎn)屠宰的下腳料和廢棄物為飼料以節(jié)約成本，使得病原通過投喂飼料進入養(yǎng)殖系統(tǒng)成為可能。而諾卡氏菌作為一種條件性致病菌，能在環(huán)境中長期存在，通常水質(zhì)惡化成為該病發(fā)生的重要誘因，革胡子鯰由于耐低氧，養(yǎng)殖池塘一般不配備增氧設施，且養(yǎng)殖者為提高效益，其養(yǎng)殖密度非常大，日投喂量也多，使得水質(zhì)條件非常惡劣，這直接影響革胡子鯰的機能，也可能增加諾卡氏菌病發(fā)生的概率?，F(xiàn)有的養(yǎng)殖模式和條件或是該菌病發(fā)生的原因。

肉芽腫是魚類諾卡氏菌病最重要的病理特征，由巨噬細胞及其演變而來的類上皮細胞、多核巨細胞和諾卡氏菌菌體構(gòu)成[8]，其形成或是病原與宿主相互作用的結(jié)果：宿主為抵抗病原入侵聚集大量免疫細胞，并以上皮細胞包圍病灶以束縛細菌的擴散，這與海分枝桿菌感染形成的典型病變非常相似[18]。大量研究表明，肉芽腫雖能將細菌限制在一定范圍內(nèi)，但不能將細菌徹底清除，或成為細菌在宿主體內(nèi)的庇護所和棲息地，其在機體和病原的相互作用過程自相矛盾的功能應是疾病慢性化發(fā)展的原因，也與該類病反復難治密切相關(guān)[19-22]。從組織病理看，革胡子鯰在多個器官均發(fā)現(xiàn)了肉芽腫病變，能觀察到纖維細胞包膜、壞死細胞層等結(jié)構(gòu)，但其排列較為松散，相對也小，纖維層和壞死層不夠明顯，其病理變化不如烏鱧的諾卡氏菌病典型。魚類諾卡氏菌致死率不高，能在養(yǎng)殖環(huán)境中長期存在，珠江三角洲地區(qū)鱧科魚類諾卡氏菌病已流行多年，其病原和宿主的相互作用已適應或經(jīng)歷復雜的過程。而對于革胡子鯰而言，鰤諾卡氏菌是新的病原，其在魚體內(nèi)與免疫細胞的相互作用關(guān)系有待進一步研究。

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(責任編輯 盧福莊)

Nocardiaseriolaeinfection in the African catfishClariasgariepinus

WANG Fang1， CHANG Ouqin1， YAN Yuanyi2， JIANG Lan1， LIU Chun1， LI Kaibin1，*

(1.PearlRiverFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Guangzhou510380，China; 2.GuangdongProvincialAquaticAnimalEpidemicDiseasePreventionandControlCenter，Guangzhou510222，China)

Nocardiosis is a long-term and problematic bacterial disease that can infect many kinds of culture fishes and cause great economic losses to the aquaculture. The nodular disease was identificated in pond farming African catfishClariasgariepinus. The fish were dark in color， some presented with skin ulceration， and the off-white nodules dispersed throughout the internal organs， such as liver and kidney. Many typical granuloma were characterized under the light microscope via wet mount preparations， and the bacteria were observed clustedred together in bright red after acid fast stain onto a slides. Histopathology revealed nodular lesion in internal organs， and associated with different degrees of pathologic lesion. A characteristic bacterial strain were isolated， which could experimently infect African catfish and induce histopathological changes similar to the natural cases. Based on the biological characteristics and phylogenetic analysis， the isolated bacteria were identified asNocardiaseriolae. To our knowledge， this was the first report of nocardiosis in African catfish， it might be closely relate to the breeding pattern of the fish in south China.

Nocardiaseriolae;Clariasgariepinus; granuloma; infection

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.09

2016-11-26

水科院基本科研業(yè)務費項目(2013A0609，2014A06XK08)

王芳(1980—)，女，助理研究員，從事魚類病害及其控制相關(guān)研究。E-mail: fwang3612 @126.com

*通信作者，李凱彬，E-mail:likaibins@126.com

S941.42

A

1004-1524(2017)05-0744-07

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 744-750

王芳， 常藕琴， 顏遠義，等. 革胡子鯰的鰤諾卡氏菌感染[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2017，29(5): 744-750.