轉(zhuǎn)基因油菜Ms8質(zhì)粒分子的制備

余笑波， 沙躍兵， 張江東， 趙 雷， 陳 怡， 隋志偉

(1.浙江省計量科學(xué)研究院，浙江 杭州 310018； 2.中國計量科學(xué)研究院，北京 100013)

轉(zhuǎn)基因油菜Ms8質(zhì)粒分子的制備

余笑波1， 沙躍兵1， 張江東1， 趙 雷1， 陳 怡1， 隋志偉2

(1.浙江省計量科學(xué)研究院，浙江 杭州 310018； 2.中國計量科學(xué)研究院，北京 100013)

隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的大規(guī)模商業(yè)化和我國大規(guī)模進口油菜籽，有效管控存在的風(fēng)險顯得非常必要和有意義，試驗研究了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMs8的研制過程，包括質(zhì)粒分子的構(gòu)建、純度分析、特異性檢測、均勻性檢驗、穩(wěn)定性考察、定值。結(jié)果表明，該質(zhì)粒分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的內(nèi)源基因和外源基因的均勻性良好，沒有擴增出所選的其他特異性基因，短期穩(wěn)定性在14 d(處理溫度大于25 ℃)發(fā)生顯著變化，長期穩(wěn)定性大于6個月，兩種方法對外源基因拷貝數(shù)的定值結(jié)果相近，因此，pMs8是有準(zhǔn)確量值的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子?？商娲匝芯拷Y(jié)果表明，其可替代基因組作為轉(zhuǎn)基因油菜Ms8定量的陽性標(biāo)準(zhǔn)。

轉(zhuǎn)基因油菜；數(shù)字PCR；質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子；Ms8

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品已經(jīng)大規(guī)模商業(yè)化。目前，加拿大和美國是轉(zhuǎn)基因油菜商業(yè)化的主要分布國，而我國還沒有轉(zhuǎn)基因油菜的商業(yè)化種植。我國平均每年從加拿大進口油菜籽100多萬t，最多時達300萬t，其中轉(zhuǎn)基因油菜籽占比在60%以上。為了更好地對轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品進行管理和風(fēng)險控制，各國也出臺了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因含量標(biāo)識制度[1-2]，我國于2002年出臺《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》，規(guī)定了我國第一批實施標(biāo)識管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄，包括大豆、玉米、油菜籽、棉花種子等產(chǎn)品。Ms8Rf3是由德國拜耳公司利用轉(zhuǎn)基因不育系Ms8(轉(zhuǎn)Barnase與Bar基因)和轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系Rf3(轉(zhuǎn)Barstar與Bar基因)培育的抗草胺膦雜交油菜，轉(zhuǎn)基因油菜Ms8Rf1也由德國拜耳作物科學(xué)公司研制，1994年美國首先批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因油菜Ms8Rf3進行商業(yè)化種植。隨之而來的，就需要對這些產(chǎn)品進行定性和定量檢測。轉(zhuǎn)基因油菜Ms8進行質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子具有以下一些優(yōu)勢，首先，相對于基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，質(zhì)粒分子具有容易獲得，穩(wěn)定性好等特點；其次，通用性更好，研制的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子適用于油菜中轉(zhuǎn)入外源基因Ms8的定性和定量檢測；其三，準(zhǔn)確性好，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子可以排除基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基體效應(yīng)對定值的影響，直接作為產(chǎn)品進行定性、定量檢測[3]?；谏鲜霰尘?，本試驗選取轉(zhuǎn)基因油菜Ms8進行質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備，其標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子不僅可用于產(chǎn)品的定性和定量檢測，也可用于安全評價、儀器計量和實驗室質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及材料

TaqMan*Universal Master Mix購自Applied Biosystems公司；正反向引物、TaqMan 探針均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；質(zhì)粒提取試劑盒購于麥伯生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pUC57simple、Oligo DNA、感受態(tài)細胞(大腸埃希菌)TOP10由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司提供。

1.1.2 實驗儀器

實時熒光定量 PCR儀為 ViiA 7(美國ABI公司)；紫外可見分光光度計Cary60(美國Agilent公司)；微量熒光分光光度計Qubit 2.0(美國Invitrogen公司)；數(shù)字PCR(QuantStudio 3D Digital PCR System，美國Applied biosystems公司)；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(Gel DocTMXR+Gel Documentation System，美國Bio Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒分子的制備

根據(jù)轉(zhuǎn)化體的相關(guān)信息，選取油菜轉(zhuǎn)化體特異性Ms8序列為外源基因，長130 bp[4]，單拷貝；選取CruA基因片段序列為內(nèi)源基因，長101 bp[4]，單拷貝。具體序列見表1。

構(gòu)建的質(zhì)粒pUC57simple(含外源基因和內(nèi)源基因)轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌受體菌TOP10(感受態(tài)細胞)中，篩選標(biāo)記物為氨芐青霉素，確認(rèn)為陽性克隆體后在LB培養(yǎng)液中進行大量培養(yǎng)，培養(yǎng)的菌液用質(zhì)粒提取試劑盒進行提取和純化。

提取的質(zhì)粒分子采用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外可見分光光度計、微量熒光分光光度計來確定純度和濃度，并選取Invitrogen公司進行測序來驗證插入質(zhì)粒片段的正確性。

1.2.2 實時熒光定量PCR法進行檢測

實驗中的內(nèi)/外源引物和探針由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，具體序列見表2。熒光定量PCR的外源擴增體系為：2×MIX(12.5 μL)、正向引物和反向引物(1 μL，10 μmol·L-1)、探針(0.5 μL，10 μmol·L-1)、DNA模板(5 μL)，其余超純水補齊至25 μL。熒光定量PCR的內(nèi)源擴增體系為：2×MIX(12.5 μL)、正向引物和反向引物(0.5 μL，10 μmol·L-1)、探針(0.5 μL，10 μmol·L-1)、DNA模板(5 μL)，其余超純水補齊至25 μL。擴增條件為：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min，45個循環(huán)；95 ℃，15 s，60 ℃，60 s。

表1Ms8和CruA的基因序列

Table 1 Gene sequence ofMs8 andCruA

目標(biāo)Target序列SequenceMs8(130bp)GTTAGAAAAAGTAAACAATTAATATAGCCGGCTATTTGTGTAAAAATCCCTAATATAATCGACGGATCCCCGGGAATTCCGGGGGAAGCTTAGATCCATGGATTTGTTATGATAACCAAAAACACCCTCCCruA(101bp)GGCCAGGGTTTCCGTGATATGCACCAGAAAGTGGAGCACATAAGGACTGGGGACACCATCGCTACACATCCCGGTGTAGCCCAATGGTTCTACAACGACGG

表2 外源基因(Ms8)和內(nèi)源基因(CruA)引物及探針序列

Table 2 Primer and probe sequence of endogenous geneCruAand exogenous gene ofMs8

目標(biāo)Target引物Primer序列(5’?3’)Sequence(5’?3’)擴增片段Amplifiedfragment/bpMs8Ms8?FGTTAGAAAAAGTAAACAATTAATAT?AGCCGG130Ms8?RGGAGGGTGTTTTTGGTTATCMs8?PFAM?AATATAATCGACGGATCCCCGG?GAATTC?TAMCruACruA?FGGCCAGGGTTTCCGTGAT101 CruA?RCCGTCGTTGTAGAACCATTGGCruA?PVIC?AGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTG?GTGCA?TAM

1.2.3 特異性檢驗

為驗證質(zhì)粒分子的特異性，采用不同作物的轉(zhuǎn)化體的內(nèi)源和外源特異性引物對質(zhì)粒分子進行擴增，擴增體系和擴增條件見1.2.2節(jié)。選取轉(zhuǎn)基因玉米NK603、轉(zhuǎn)基因大豆MON89788和轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1三種轉(zhuǎn)化體的內(nèi)、外源引物對質(zhì)粒分子進行檢測。

1.2.4 可替代性實驗

實時熒光定量PCR試驗時，平常實際檢測的是基體轉(zhuǎn)基因作物(基因組DNA)，所以利用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子去定量檢測，存在質(zhì)粒和基體的定量效果是否一致的問題[5]。為了解質(zhì)粒分子是否可以替代基因組DNA對轉(zhuǎn)基因作物進行檢測，分別對質(zhì)粒分子和基因組DNA進行系列濃度的qPCR擴增，擴增體系和擴增條件見1.2.2節(jié)，根據(jù)獲得的結(jié)果，以濃度作為x軸，以拷貝數(shù)或Ct值為y軸，進行線性擬合，主要考察標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴增效率和線性擬合度 (R2)。在比較質(zhì)粒和基因組在擴增效率和擴增線性擬合度的基礎(chǔ)上，分別以pMs8和基因組DNA(100%陽性標(biāo)準(zhǔn)品)為線性標(biāo)準(zhǔn)對樣品基因組DNA(100%陽性樣品)進行外源基因含量的測定，即計算外源基因拷貝數(shù)和內(nèi)源基因拷貝數(shù)的比值。

1.2.5 均勻性分析

pMs8共制備了200管質(zhì)粒分子，每管200 μL。隨機抽取15管，分別標(biāo)記1～15。對15管質(zhì)粒分子(內(nèi)源基因和外源基因)進行實時熒光定量PCR擴增實驗，每管進行3次重復(fù)。利用F方差法對內(nèi)源基因和外源基因擴增的Ct值進行分析。

1.2.6 穩(wěn)定性分析

穩(wěn)定性包括短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性，即在規(guī)定的時間間隔和環(huán)境條件下，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值保持在規(guī)定范圍內(nèi)的性質(zhì)[6]。短期穩(wěn)定性測定：分別將標(biāo)質(zhì)粒分子存儲在-20、4、25和37 ℃下，保存1、3、7、14 d，每個時間點在每個溫度下各取3管，每管設(shè)置3個平行反應(yīng)(N=3，n=3)。以存儲在-40 ℃的作參照，通過qPCR對兩個基因含量進行分析。將某一溫度下的數(shù)據(jù)同-40 ℃(默認(rèn)為穩(wěn)定條件)相比較，分析外源與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的Ct值，通過雙尾T檢驗，置信區(qū)間為0.95，當(dāng)結(jié)果t>2.26(P為95%，n為9時，t=2.26)時表明發(fā)生顯著變化，以*標(biāo)記，即不穩(wěn)定。

長期穩(wěn)定性測定：將制備好的轉(zhuǎn)基因油菜Ms8質(zhì)粒分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)放置在-20 ℃下進行長期穩(wěn)定性考察，分別在1、2、3、6個月進行測定。每個時間點取3管，每管做3個平行，通過qPCR方法進行測定。數(shù)據(jù)經(jīng)格拉布斯檢驗無離群值需要剔除，目前已統(tǒng)計6個月。考察以時間為橫坐標(biāo)(xi)，分別以Ms8轉(zhuǎn)化體特異性基因與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的Ct值為縱坐標(biāo)(yi內(nèi)和yi外)，擬合成一條直線，斜率為b1，截距為b0。

1.2.7 定值

根據(jù)兩種不同原理對轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒進行拷貝數(shù)定值，采用微量熒光分光法(Picogreen法)測定質(zhì)粒DNA的濃度，根據(jù)公式：每微升目標(biāo)基因的拷貝數(shù)=6.022×1023×每微升質(zhì)粒DNA的質(zhì)量/核酸分子量，計算出pMs8的內(nèi)源基因和外源基因的拷貝數(shù)。

利用dPCR[7-8]對內(nèi)外源基因的拷貝數(shù)進行考察，Ms8的數(shù)字PCR擴增體系為：正向引物、反向引物、探針0.3 μL(10 μmol·L-1)，DNA模板1 μL，超純水補齊至15 μL。CruA的數(shù)字PCR擴增體系為：正向引物、反向引物0.6 μL，探針0.3 μL，DNA模板1 μL，超純水補齊至15 μL。擴增條件為：96 ℃，10 min；60 ℃，2 min，39個循環(huán)；96 ℃，30 s；60 ℃，2 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒

2.1.1 質(zhì)粒分子的構(gòu)建

將一系列化學(xué)合成的轉(zhuǎn)化體DNA片段(130 bp)和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因DNA片段(101 bp)通過PCR的方法拼接成所需的序列，并將合成好的序列克隆入pUC57 simple載體(2 710 bp)，其位置在載體中的BglⅡ酶切位點上。

2.1.2 質(zhì)粒分子的純化和質(zhì)量分析

構(gòu)建得到的含目標(biāo)質(zhì)粒的大腸埃希菌，以載體氨芐青霉素(Amp)抗性為篩選標(biāo)記，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中進行大量培養(yǎng)，然后采用質(zhì)粒提取試劑盒進行純化提取。用紫外可見分光光度計測定所提取的DNA的純度，D260/D280值應(yīng)在1.8～2.0，D260/D230值應(yīng)該大于2。測定結(jié)果見表3。

表3 pMs8質(zhì)粒分子的紫外測定結(jié)果

Table 3 The UV measurement results of pMs8

pMs8123456D260/D2302 42 22 42 32 32 2D260/D2801 91 81 81 81 81 9

通過測序分析來驗證構(gòu)建質(zhì)粒片段的正確性及插入的拷貝數(shù)，將提取的質(zhì)粒DNA送到英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行測序分析，結(jié)果表明，連入的片段和設(shè)計的質(zhì)粒一致，且目標(biāo)基因均為單拷貝。

2.1.3 特異性檢測

選取轉(zhuǎn)基因玉米NK603、轉(zhuǎn)基因大豆MON89788和轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1三種轉(zhuǎn)化體的內(nèi)、外源引物對質(zhì)粒分子進行檢測，結(jié)果見圖1。除了pMs8質(zhì)粒分子的內(nèi)外源基因有擴增條帶，為陽性之外，其他作物檢測結(jié)果集空白對照(NTC)為陰性，因此，pMs8質(zhì)粒分子的內(nèi)外源基因針對其他引物特異性良好。

2.2 可替代性研究

2.2.1 qPCR擴增效率的分析評價

采用t檢測(雙尾)分析，一般認(rèn)為在95%的置信區(qū)間內(nèi)，取a=0.05，即臨界P值。在實驗次數(shù)為3次的情況下，其P值為2.78，若計算得的P值<2.78，即在95%的區(qū)間內(nèi)，認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)沒有差別；若計算得的P值>2.78，即在小概率區(qū)間內(nèi)，認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)有顯著性差別。比較基因組DNA和質(zhì)粒DNA的擴增效率(表4)發(fā)現(xiàn)，兩者的內(nèi)外源基因的擴增效率并沒有顯著差別，表明質(zhì)粒DNA的擴增效率與基因組 DNA的擴增效率是相似的。

M， Marker; 1， CruA; 2， zSSIIb; 3， RBE4; 4， lec; 5， NTC; 6， Ms8; 7， NK603; 8， TT51-1; 9， MON89788; 10， NTC圖1 CruA內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)片段和pMs8外源片段特異性擴增Fig.1 Specific amplification of endogenous gene CruA and exogenous gene Ms8

2.2.2 線性擬合度的分析評價

由試驗數(shù)據(jù)分析轉(zhuǎn)基因基體Ms8標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)粒分子pMs8的線性擬合度，并進行了比較。由表5可知，兩者的內(nèi)源線性擬合度和外源線性擬合度均無顯著差異 (P<2.78) 。由上面分析可知，轉(zhuǎn)基因基體Ms8標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)粒分子pMs8的擴增效率和線性擬合度都具有相似性。在實際定量操作中可以互相替代作為陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

2.2.3 定值驗證

采用1.2.2節(jié)的擴增條件，將pMs8和基因組DNA稀釋到合適的濃度梯度，對樣品基因組DNA進行定值(外源基因拷貝數(shù)和內(nèi)源基因拷貝數(shù)的比值)測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線每個濃度點進行3次重復(fù)，取其平均值作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值，再根據(jù)線性公式和樣品的Ct值，計算出同一樣品在pMs8和基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)的外源基因與內(nèi)源基因的比值，具體數(shù)據(jù)見表6和表7。

由表7可知，同一陽性樣品在以質(zhì)粒Ms8標(biāo)準(zhǔn)分子為標(biāo)準(zhǔn)模板的情況下，其外源基因拷貝數(shù)和內(nèi)源基因拷貝數(shù)的比值為110.6%，在以基因組Ms8標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)模板的情況下，其外源基因拷貝數(shù)和內(nèi)源基因拷貝數(shù)的比值為94.5%。進一步驗證了pMs8可以替代基因組Ms8標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來對轉(zhuǎn)基因油菜進行比值定量檢測。

表4 基因組 DNA和質(zhì)粒 DNA的擴增效率的比較

Table 4 Comparison of amplification efficiency of genomic DNA and plasmid DNA

基因組DNA和質(zhì)粒DNAGenomicDNAandplasmidDNA123AVERAGESDRSD/%P外源基因組DNAExogenousgenomicDNA0 940 960 910 940 0252 70 346外源質(zhì)粒DNAExogenousplasmidDNA0 930 910 920 920 0101 1內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因組DNAEndogenousgenomicDNA0 900 910 900 900 0060 70 374內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNAEndogenousplasmidDNA0 910 920 900 910 0101 1

表5 轉(zhuǎn)基因基體Ms8標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)粒分子pMs8的線性擬合度比較

Table 5 Comparison of linear fitting of pMs8 and transgenic matrixMs8

基因組DNA和質(zhì)粒DNAGenomicDNAandplasmidDNA123AVERAGESDRSD/%P外源基因組DNAExogenousgenomicDNA0 9960 9930 9970 9950 0020 20 225外源質(zhì)粒DNAExogenousplasmidDNA0 9970 9950 9970 9960 0010 1內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因組DNAEndogenousgenomicDNA0 9980 9910 9930 9940 0040 40 329內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNAEndogenousplasmidDNA0 9900 9920 9900 9910 0010 1

表6 以pMs8和基因組為標(biāo)準(zhǔn)模板的內(nèi)外源基因擴增結(jié)果

Table 6 Amplified results of PCR about endogenous gene and exogenous gene of DNA template pMs8 and genomics

標(biāo)準(zhǔn)模板Ct值內(nèi)源基因CruA外源基因Ms8濃度內(nèi)源基因CruA外源基因Ms8線性內(nèi)源基因CruA外源基因Ms8pMs819 9620 33100000100000y=-3 161x+35 81y=-3 211x+36 4423 2623 68100001000026 3126 841000100029 4829 98100100基因組DNA22 5823 027400074000y=-3 169x+38 16y=-2 966x+37 65 25 9726 267400740029 3729 5574074032 0131 817474

表7 以pMs8和基因組為標(biāo)準(zhǔn)模板的同一陽性基因組樣品的外源/內(nèi)源比值

Table 7 The ratio ofCruAtoMs8 for one positive sample which DNA template are pMs8 and genomics

標(biāo)準(zhǔn)模板Ct值內(nèi)源基因CruA外源基因Ms8比值/%pMs826 4626 15112 826 3525 97106 326 3426 02111 426 3226 00112 1基因組DNA26 4026 0190 6 26 3625 9387 926 3126 0096 626 2926 08104 5

2.3 均勻性檢測

采用F檢驗的方法對實時定量PCR所獲得的外源Ct值和內(nèi)源Ct值進行分析，結(jié)果如表8和表9，從中可以看出，F(xiàn)

2.4 穩(wěn)定性檢測

按ISO導(dǎo)則35 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性進行評價，圖2為pMs8標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)兩個目標(biāo)基因?qū)?yīng)Ct值及統(tǒng)計分析結(jié)果。將-40 ℃默認(rèn)為穩(wěn)定條件，以此為參照，由圖2可知，25和37 ℃條件下存放至第14天，外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)?yīng)的Ct比值都發(fā)生了顯著變化。因此pZJIM-01標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在7 d內(nèi)沒有發(fā)生顯著變化。

表8 pMs8外源基因熒光定量PCR擴增值均勻性分析

Table 8 The homogeneous of exogenous gene pMs8 by using FQ-PCR

差異源VariableSSdfMSFP?valueFcrit組間Intergroup0 44164140 0315461 513720 165872 0374組內(nèi)Intragroup0 6252300 02084總計Total1 0668444

表9 pMs8內(nèi)源基因熒光定量PCR擴增值均勻性分析

Table 9 The homogeneous of endogenous gene pMs8 by using FQ-PCR

差異源VariableSSdfMSFP?valueFcrit組間Intergroup0 571764140 040841 614810 132152 0374組內(nèi)Intragroup0 75873300 02529總計Total1 330544

圖2 pMs8內(nèi)源基因(CruA)和外源基因(Ms8)短期穩(wěn)定性檢測結(jié)果(Ct值)Fig.2 The result(Ct value) of short term stability for pMs8(endogenous gene CruA and exogenous gene Ms8)

2.5 定值

本研究構(gòu)建的是一個含內(nèi)源基因CruA和外源基因Ms8的質(zhì)粒DNA，采用核酸染料結(jié)合DNA雙鏈，再進行熒光分光法定值。根據(jù)熒光分光法測定的濃度，采用濃度換算成拷貝數(shù)公式，算出拷貝數(shù)濃度。同時，采用dPCR對內(nèi)外源基因的拷貝數(shù)進行考察。

表10 穩(wěn)定性內(nèi)源基因和外源基因檢驗結(jié)果

Table 10 The results of long term stability for endogenous gene and exogenous gene

時間(月)Time(month)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Endogenousgene外源基因Exogenousgene0(-40℃)17 9519 66117 7219 89217 8119 63317 7119 65617 6719 61|b1|0 0370 024S0 0190 025

2.5.1 熒光分光法確定內(nèi)外源基因拷貝數(shù)參考值

熒光分光法對分裝管中的原始溶液濃度進行平行重復(fù)4次測定，其平均值為3.36 ng·μL-1，根據(jù)其初始濃度，換算成拷貝數(shù)濃度，結(jié)果為內(nèi)源基因和外源基因的拷貝數(shù)約為1.0×109copies·μL-1，測序結(jié)果表明插入的內(nèi)外源拷貝數(shù)均為單拷貝。

圖3 pMs8內(nèi)源基因和外源基因長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)統(tǒng)計Fig.3 The data statistics of long term stability for pMs8

2.5.2 dPCR法確定內(nèi)外源基因拷貝數(shù)參考值

根據(jù)其初始濃度(微量熒光分光光度計測定)，稀釋到所需濃度100～2 000 copies·μL-1，利用dPCR對內(nèi)源基因和外源基因拷貝數(shù)進行6次測定，結(jié)果顯示，內(nèi)源基因的平均拷貝數(shù)為8.38×108copies·μL-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.4%，外源基因的平均拷貝數(shù)為9.42×108copies·μL-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.7%。

3 討論

本試驗采用兩種方法對樣品進行濃度定值，結(jié)果表明數(shù)字PCR的外源基因及內(nèi)源基因拷貝數(shù)和微量熒光分光光度計的測定值的拷貝數(shù)比較接近。通過微量熒光分光光度法來計算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)，進而確定其外源基因片段和內(nèi)源基因片段的拷貝數(shù)，結(jié)果為1.0×109copies·μL-1。通過dPCR的方法來計算外源基因片段和內(nèi)源基因片段的拷貝數(shù)，其外源基因片段和內(nèi)源基因片段的拷貝數(shù)分別為9.42×108copies·μL-1和8.38×108copies·μL-1，分裝的各個單元具有良好的均勻性和穩(wěn)定性。本文的可替代性研究表明，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMs8可作為替代基體轉(zhuǎn)基因油菜Ms8的陽性標(biāo)準(zhǔn)品，可用于實驗室質(zhì)量控制、儀器計量和轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品的定性、定量分析。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Development of a reference plasmid of genetically modified rapeseedMs8

YU Xiaobo1， SHA Yuebing1， ZHANG Jiangdong1， ZHAO Lei1， CHEN Yi1， SUI Zhiwei2

(1.ZhejiangProvinceInstituteofMetrology，Hangzhou310018，China; 2.NationalInstituteofMetrology，Beijing100013，China)

With the commercialization of genetically modified organism (GMO) and large scale of rapeseed imported to China， it was essential to manage and control existing risks. In this paper， genetically modified rapeseedMs8 was prepared including analysis on preparation， purity， homogeneity， stability and certified value. The results showed that the homogeneity of endogenous gene and exogenous gene of reference molecule was well. No other selective specific gene had been amplified by PCR. Short term stability of reference molecule was obviously changed which were stored at room temperature for 14 days， and long term stability of reference molecule was more than 6 months. The certified value of exogenous gene of reference molecule determined by microspectrophotometric method and digital PCR method was similar. Thus， pMs8 can be used as reference material， and the reference molecule is suitable for the rapid identification of modified rapeseedMs8 in unknown samples.

transgenic rapeseed; digital PCR; reference plasmid;Ms8

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.02

2016-12-29

浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局一般項目(20150211)

余笑波(1985—)，男，浙江杭州人，碩士，工程師，主要從事生物化學(xué)分析儀器的檢定和生物化學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制。E-mail: yuxiaobo.123@163.com

S634.3

A

1004-1524(2017)05-0694-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 694-700

余笑波， 沙躍兵， 張江東，等. 轉(zhuǎn)基因油菜Ms8質(zhì)粒分子的制備[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，29(5)： 694-700.