利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯水稻基因

原文霞，王栩鳴，李冬月，3，周 潔，嚴(yán)成其，*，陳劍平，*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321004； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江省有害生物防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，農(nóng)業(yè)部植保生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省植物病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310021； 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯水稻基因

原文霞1，2，王栩鳴2，李冬月2，3，周 潔2，嚴(yán)成其1，2，*，陳劍平1，2，*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321004； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江省有害生物防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，農(nóng)業(yè)部植保生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省植物病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310021； 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

以現(xiàn)有水稻CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)為起點(diǎn)，優(yōu)化改造了相應(yīng)的載體及其構(gòu)建方法，實(shí)現(xiàn)了兩步法構(gòu)建基因敲除載體。利用新的載體和方法，針對(duì)水稻日本晴(OryzasativaL.spp.Japonicacv. Nipponbare)D3基因的3個(gè)靶向位點(diǎn)分別構(gòu)建了相應(yīng)的CRISPR/Cas9載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化成功獲得一系列轉(zhuǎn)基因植株。T0代轉(zhuǎn)基因植株靶位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果顯示，靶位點(diǎn)DDRC1包括5種突變類型，植株的突變率為35.48%；靶位點(diǎn)DDRC2包括5種突變類型，植株的突變率為25.00%；靶位點(diǎn)DDRC3包括1種突變類型，植株的突變率為20.00%。利用T1代純合突變植株，進(jìn)一步研究了所得純合突變體的株高、分蘗數(shù)表型與CRISPR/Cas9編輯后基因型之間的關(guān)系，探討了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯效率、位置效應(yīng)和突變類型等特點(diǎn)，為進(jìn)一步利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)展具有不同農(nóng)藝性狀的水稻種質(zhì)材料提供了參考。

水稻；CRISPR/Cas9；D3基因；基因編輯

對(duì)于植物基因功能特征和農(nóng)作物的遺傳改良研究來講，基因編輯技術(shù)(genome editing)是一項(xiàng)具有非常誘人前景的技術(shù)[1]。為提高動(dòng)植物基因編輯的效率，研究人員開發(fā)了人工核酸內(nèi)切酶(engineered endonuclease，EEN)，EEN可以在DNA靶位點(diǎn)處產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double strand breaks，DSBs)，它通過控制DNA的修復(fù)途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定點(diǎn)編輯，DNA 損傷后產(chǎn)生的DSBs能夠激活細(xì)胞內(nèi)固有的修復(fù)機(jī)制非同源末端連接(non-homologous ending-joining，NHEJ)或同源重組(homologous recombination，HR)，該修復(fù)機(jī)制可以對(duì)損傷的DNA 進(jìn)行修復(fù)[2]，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定點(diǎn)編輯。兩種最常見的人工核酸內(nèi)切酶是鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)，二者都成功地在多個(gè)物種上實(shí)現(xiàn)了打靶。無論是ZFN還是TALEN，都能夠精確地調(diào)控靶基因的表達(dá)，但是，這些技術(shù)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)有較高要求[3-4]。2013年初，出現(xiàn)了一種新型的人工核酸內(nèi)切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要依據(jù)細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成[5]。CRISPR/Cas系統(tǒng)因其操作技術(shù)要求簡(jiǎn)單、專一性好、基因定點(diǎn)突變效率高，目前已經(jīng)獲得了廣泛的研究，并被成功運(yùn)用于如擬南芥、煙草、番茄、小麥和玉米等多種物種的基因編輯中[6-9]。

依據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，CRISPR/Cas系統(tǒng)可以分為3大類型(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型系統(tǒng))。三者的共同特點(diǎn)是，由RNA介導(dǎo)的核酸酶可以特異性地切割外源入侵的DNA，包括噬菌體和質(zhì)粒DNA[10]。其中，Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，目前被廣泛應(yīng)用于真核細(xì)胞的基因組編輯研究中。在該系統(tǒng)中，由單一的蛋白Cas9、crRNA、tracrRNA形成RNA-蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物執(zhí)行對(duì)外源DNA進(jìn)行有效識(shí)別和切割特定位點(diǎn)的功能[11]。CRISPR/Cas9的剪切位點(diǎn)位于crRNA互補(bǔ)序列下游鄰近的PAM區(qū)(protospacer-adjacent motif，PAM)的5′-G-N19-NGG-3′特征區(qū)域的NGG位點(diǎn)，這種特征的序列在每128 bp的隨機(jī)DNA序列中就重復(fù)出現(xiàn)一次[12]。

近幾年，CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻基因功能研究方面也有長(zhǎng)足的發(fā)展，目前在全球范圍內(nèi)，CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻中的運(yùn)用主要聚焦于基因功能研究。雖然從技術(shù)上講，采用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯水稻基因組改變水稻各種農(nóng)藝性狀已不再具有不可逾越的障礙，但是目前對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻育種中的實(shí)用化研究還處于起步階段，相關(guān)的研究也比較少。為實(shí)現(xiàn)從基礎(chǔ)研究到生產(chǎn)應(yīng)用的銜接，為水稻育種實(shí)踐提供更直接的助力，充分了解CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的特性顯然已成為當(dāng)前亟待解決的重要課題。本研究以現(xiàn)有CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)[13]為起點(diǎn)，優(yōu)化改造了CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建方法，并采用改造后的載體對(duì)水稻日本晴(OryzasativaL.spp.Japonicacv. Nipponbare)的D3基因[14-18]進(jìn)行了基因編輯研究。通過分析所得突變體的株高、分蘗數(shù)表型與CRISPR/Cas9編輯后基因型之間的關(guān)系，探討了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯效率、位置效應(yīng)和突變類型等特點(diǎn)，為進(jìn)一步利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)展具有不同農(nóng)藝性狀的水稻種質(zhì)材料奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸埃希菌菌株(Escherichiacoli， DH5α)，根瘤農(nóng)桿菌菌株(Agrobacteriumtumefaciens， EHA105)，水稻品種日本晴(OryzasativaL. ssp.Japonicacv. Nipponbare)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。本研究中所用的pOsU6-SK和p35s-Cas9-SK基礎(chǔ)載體由美國(guó)加州大學(xué)朱健康教授提供。雙元載體骨架為pCAMBIA1300，由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。其他市售試劑包括Klenow fragment (NEB，Beverly，MA)、Phusion DNA polymerase (NEB，Beverly，MA)、TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)、質(zhì)粒提取試劑盒(Promega，Madison，USA)、ccdBr2感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。研究所用其他限制性內(nèi)切酶均采用NEB(北京)公司產(chǎn)品。研究中所用引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，相關(guān)測(cè)序工作由鉑尚生物技術(shù)(杭州)有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大腸埃希菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化

本研究所用大腸埃希菌DH5α熱擊感受態(tài)細(xì)胞的制備，轉(zhuǎn)化均按Innova法操作[19]。

1.2.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備

本研究所用農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室自行制備，步驟如下：取25 μL農(nóng)桿菌菌液接種于5 mL YEP/Str+液體培養(yǎng)基中(含鏈霉素50 μg·mL-1)，28 ℃，230 r·min-1培養(yǎng)過夜；取1 mL新鮮菌液接種至200 mL YEP/Str+液體培養(yǎng)基中，28 ℃，230 r·min-1培養(yǎng)至D600≈0.6；然后于4 ℃ 4 000 r·min-1條件下離心10 min；棄去上清，沉淀采用20 mL新鮮配制并經(jīng)冰浴的HEPES(1 mmol·L-1，pH 7.0)重懸；重復(fù)以上離心重懸清洗步驟2～3次后，用8 mL冰浴的10%甘油重懸；最后將其分裝到1.5 mL離心管中，每管分裝100 μL，置于液氮中速凍，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 CRISPR/Cas9載體優(yōu)化

為了提高載體構(gòu)建效率，實(shí)現(xiàn)兩步法構(gòu)建CRISPR/Cas9載體，我們對(duì)朱健康教授實(shí)驗(yàn)室提供的載體進(jìn)行了優(yōu)化。首先以pX2E載體(基于Gateway技術(shù)的低成本植物雙分子熒光互補(bǔ)分析系統(tǒng))為模板，采用FastCas-F1、FastCas-R1擴(kuò)增了包含氯霉素抗性基因和ccdB自殺基因的片段；然后，以此PCR產(chǎn)物為模板，再用FastCas-F2、FastCas-R2擴(kuò)增引入了BaeⅠ酶切位點(diǎn)。在片段擴(kuò)增的同時(shí)，我們采用BbsⅠ內(nèi)切酶對(duì)pOsU6-SK載體進(jìn)行酶切，并用Klenow fragment對(duì)酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行補(bǔ)平，獲得的線性化平末端載體與包含氯霉素抗性基因和ccdB自殺基因片段的PCR產(chǎn)物相連接。此后，按文獻(xiàn)[13]步驟，采用KpnⅠ-Hind Ⅲ對(duì)獲得的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到的產(chǎn)物與Hind Ⅲ-EcoR Ⅰ酶切的p35-Cas9-SK載體及KpnⅠ-EcoRⅠ雙酶切后的pCAMBIA1300載體進(jìn)行三片段連接。連接產(chǎn)物采用熱擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入ccdBr2感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化流程按Invitrogen公司手冊(cè)進(jìn)行。整體改造流程如圖1-A所示，相關(guān)引物見表1，最終獲得CRISPR/Cas9載體命名為pOsFastCas9，其T-DNA邊界內(nèi)功能區(qū)結(jié)構(gòu)如圖1-B所示。

1.2.4 靶位點(diǎn)選擇及引物設(shè)計(jì)

從網(wǎng)站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上獲得水稻日本晴D3(Os06g0154200)基因序列，并在序列中尋找Cas9潛在靶向位點(diǎn)，即符合5′-GN19NGG-3′的序列，根據(jù)靶位點(diǎn)的位置及GC含量，篩選D3基因序列12、1 445、2 068 bp處的NGG前20 bp作為3個(gè)靶向序列，分別命名為DDRC1、DDRC2、DDRC3。以篩選到的靶向核苷酸序列5′-GN19NGG-3′中NGG前的20 bp為基礎(chǔ)，按照5′-GN19GTTTT-3′，3′-ACACACN19-5′的模板編輯正向和反向引物，使引物經(jīng)退火后能夠形成如圖2所示的結(jié)構(gòu)，具體引物信息如表2。

1.2.5 CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建

靶序列正反向引物經(jīng)退火(95 ℃，3 min；22 ℃，1 min，降溫速率，0.1 ℃·s-1；22 ℃，∞)生成接頭；將接頭產(chǎn)物與CRISPR/Cas9基因編輯載體BaeⅠ酶切產(chǎn)物用T4連接酶置于25 ℃反應(yīng)2 h，獲得相應(yīng)CRISPR/Cas9表達(dá)載體。取5 μL連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌熱激感受態(tài)DH5α中，涂布于LB/K+平板上(含卡那霉素50 μg·mL-1)，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜，挑取克隆培養(yǎng)6～12 h，用載體上的通用引物M13-F與靶序列的下游引物DDRCN-R進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽(yáng)性鑒定正確后，將菌液送鉑尚生物技術(shù)(杭州)有限公司測(cè)序(引物信息見表2)。

1.2.6 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及其介導(dǎo)的水稻日本晴遺傳轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建得到的CRISPR/Cas9表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA通過電擊轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中。電擊轉(zhuǎn)化時(shí)將感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍，將2 μL純化過的質(zhì)粒DNA加入感受態(tài)細(xì)胞，混勻后加入到預(yù)冷的電擊杯中，并采用Eppendorf Eporator電轉(zhuǎn)儀在12 500 V·cm-1電場(chǎng)電擊；電擊后迅速加入800 μL無抗生素的YEP培養(yǎng)液，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中于28 ℃ 230 r·min-1振蕩培養(yǎng)；2 h后取100 μL菌液，涂布于YEP/K+平板上(含卡那霉素50 μg·mL-1)，28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24～48 h。挑取克隆培養(yǎng)6～12 h，用載體上的通用引物M13-F與靶序列的下游引物DDRCN-R進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽(yáng)性鑒定正確后，再將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入日本晴的愈傷組織中，經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。

A，p35-Cas9-SK導(dǎo)入含氯霉素抗性基因和ccdB致死基因片段流程圖。Cm(R)，氯霉素抗性基因；ccdB，ccdB致死基因；BbsI，BbsI內(nèi)切酶；Klenow，DNA聚合酶Klenow片段；Ligation，T4 DNA連接酶介導(dǎo)的連接反應(yīng)；BaeI，BaeI內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)；FastCas-F1、FastCas-R1、FastCas-F2和FastCas-R2，擴(kuò)增用的引物；B，pOsFastCas9載體T-DNA邊界內(nèi)功能區(qū)結(jié)構(gòu)。 T-Border(R) 和T-Border(L)，T-DNA邊界；OsU6-2 Promoter，水稻U6啟動(dòng)子；BaeI Cuts，BaeI內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)；Cm(R)，氯霉素抗性基因；ccdB，ccdB致死基因；Terminator T，終止子；gRNA，向?qū)NA序列；2×35S，2×35S啟動(dòng)子；3×Flag，3×Flag標(biāo)簽；NLS，核定位信號(hào)；Cas9，Cas9酶；NOS，NOS終止子；35S Promoter，35S啟動(dòng)子；Hygromycin(R)，潮霉素抗性基因；35S PolyA，35S polyA終止子A， Flowchart of p35-Cas9-SK inserted chloramphenicol resistance genes and the lethal gene ccdB; Cm(R), the resistance genes of chloramphenicol; ccdB， the lethal gene ccdB; BbsⅠ， the restriction enzymes of BbsⅠ; Klenow， DNA polymerase Klenow fragment; Ligation， the ligase chain reaction mediated by T4 DNA ligase; BaeⅠ， the recognition site of BaeⅠ; FastCas-F1， FastCas-R1， FastCas-F2 and FastCas-R2， the primers for amplificationB， Structure of T-DNA of pOsFastCas9vector between T-borders. T-Border(R) and T-Border(L)， the border of T-DNA; OsU6-2 Promoter， the U6 promoter of rice; BaeⅠ Cuts， the restriction enzymes of BaeⅠ; Cm(R)， the resistance genes of chloramphenicol; ccdB， the lethal gene of ccdB; Terminator T， the terminator; gRNA， the sequence of guide RNA; 2×35S， 2×35S promoter; 3×Flag， 3×Flag label; NLS， nuclear localization signal; Cas9， the enzyme of Cas9; NOS， the terminator of NOS; 35S Promoter， the promoter of 35S; Hygromycin(R)， the resistance genes of Hygromycin; 35S PolyA， the terminator of 35S polyA圖1 pOsFastCas9載體改造流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of pOsFastCas9 construction workflow

表1 pOsFastCas9載體改造引物序列

Table 1 Nucleotide sequence of pOsFastCas9 vector transformation primer

名稱Name引物核苷酸序列Nucleotidesequenceofprimers(5′→3′)FastCas?F1TTGGCAGCATCACCCGAFastCas?R1GCTGTGTATAAGGGAGFastCas?F2GAGGCAGCAGACACAGGTATCGCGATAGACGGGTAAGTTGGCAGCATCACFastCas?R2TGATAAGGAGACGGCCGTACCGTTGACCTGCAGACTGGCTGTGTATAAGG

圖2 粘性接頭結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Schematic diagram of linker

表2 靶向位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)引物核苷酸序列

Table 2 Nucleotide sequence of target site and the corresponding primer

名稱Name核苷酸序列Nucleotidesequence(5′→3′)DDRC1GGAGTAGACGTCGCCCATGGCGGDDRC2GTGCCATTTGCAACACTGCAGGGDDRC3GCGGGACATGCAGTTGCGGGAGGDDRC1?FGGAGTAGACGTCGCCCATGGGTTTTDDRC1?RCCATGGGCGACGTCTACTCCACACADDRC2?FGTGCCATTTGCAACACTGCAGTTTTDDRC2?RTGCAGTGTTGCAAATGGCACACACADDRC3?FGCGGGACATGCAGTTGCGGGGTTTTDDRC3?RCCCGCAACTGCATGTCCCGCACACAM13?FCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC

“ ”表示PAM位點(diǎn)。

The underlined represents PAM site.

1.2.7 轉(zhuǎn)基因水稻植株突變體檢測(cè)

在靶序列上下游200 bp左右處設(shè)計(jì)正向引物與反向引物，作為鑒定是否發(fā)生突變的特異性引物，用于擴(kuò)增包含靶序列在內(nèi)的目的片段(引物具體信息如表3)。以粗提轉(zhuǎn)基因植株的總DNA為模板，用相應(yīng)的特異性引物PCR擴(kuò)增目的片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物送到鉑尚生物技術(shù)(杭州)有限公司進(jìn)行測(cè)序，最終通過序列比對(duì)鑒定獲得的突變植株。

表3 測(cè)序引物核苷酸序列

Table 3 Nucleotide sequence of sequencing primer

名稱Name引物核苷酸序列Nucleotidesequenceofprimers(5′→3′)DDRC1?Seq?FAAGGGAGAGCTGTCGAGTATATCACDDRC1?Seq?RACCTCACGTCCGTCAGGAAGCTCAGDDRC2?Seq?FCCTACTCTCAAGGAAGTCACTGTCTDDRC2?Seq?RACCATAGGGAGAGTGACCTGAGCATDDRC3?Seq?FACTTTGTATGAATTGGACTACTGGCDDRC3?Seq?RTTTTGTGCCCACATAACTAATCATC

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建

D3基因在根、葉片和花中顯著表達(dá)，并參與調(diào)控葉片衰老和細(xì)胞死亡過程，現(xiàn)有的研究顯示，其突變會(huì)導(dǎo)致分蘗增多，株高矮化等表型[14-18]。為分析CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)基因功能的影響，我們選擇在該基因CDS的不同位置進(jìn)行基因編輯。如圖3所示，D3基因包括4個(gè)外顯子，其CDS序列位于第1個(gè)外顯子上。篩選設(shè)計(jì)的三個(gè)靶位點(diǎn)均位于D3基因的CDS序列上，DDRC1位于CDS序列的12 bp處，DDRC2位于CDS序列1 445 bp處，DDRC3位于CDS序列的2 068 bp處。正向引物與反向引物通過退火生成粘性接頭，并與BaeⅠ酶切的線性CRISPR/Cas9基因編輯載體連接，測(cè)序結(jié)果表明D3基因的三個(gè)靶向序列DDRC1、DDRC2、DDRC3的CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建成功。

DDRC1、DDRC2、DDRC3為D3基因CDS序列上篩選設(shè)計(jì)的三個(gè)CRISPR/Cas9基因編輯載體作用的靶位點(diǎn)DDRC1， DDRC2， DDRC3: three CRISPR/Cas9 target sites in the CDS of D3 gene圖3 水稻D3基因結(jié)構(gòu)及CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)示意圖Fig.3 Schematic diagram of D3 gene structure and CRISPR/Cas9 target site

2.2 優(yōu)化的CRISPR/Cas9載體能有效編輯水稻基因組

為了驗(yàn)證構(gòu)建的CRISPR/Cas9基因編輯載體能否有效對(duì)預(yù)設(shè)靶位點(diǎn)進(jìn)行編輯，我們對(duì)野生型日本晴植株和轉(zhuǎn)基因T0代植株的基因靶序列進(jìn)行了測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果顯示，T0代植株中檢測(cè)到了預(yù)期的突變。為精確分析突變類型，我們繁育了T1代轉(zhuǎn)基因材料。結(jié)合T0和T1代材料的測(cè)序數(shù)據(jù)，得出如下結(jié)果，DDRC1經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化得到31株轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)測(cè)序鑒定有11株植株的靶序列發(fā)生突變，突變率為35.48%，包括5種突變類型，突變方式Mutant1為缺失2個(gè)堿基(AT)，突變方式Mutant2為缺失1個(gè)堿基(A)，突變方式Mutant3為插入1個(gè)堿基(T)，突變方式Mutant4為插入1個(gè)堿基(G)，突變方式Mutant5為插入1個(gè)堿基(A)；DDRC2經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化得到24株轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)測(cè)序鑒定有6株植株的靶序列發(fā)生突變，突變率為25.00%，包括5種突變類型，突變方式Mutant1為缺失3個(gè)堿基(TTG)，突變方式Mutant2為缺失3個(gè)堿基(AGT)，突變方式Mutant3為缺失2個(gè)堿基(GT)，突變方式Mutant4為缺失2個(gè)堿基(TG)，突變方式Mutant5為缺失4個(gè)堿基(GTGT)；DDRC3經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化得到10株轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)測(cè)序鑒定有2株植株的靶序列發(fā)生突變，突變率為20.00%，包括1種突變類型，突變方式Mutant1為缺失8個(gè)堿基(CAGTTGCG)；總突變率為29.23%，共產(chǎn)生11種突變。具體突變方式如圖4所示。

在檢測(cè)突變類型的同時(shí)，我們還對(duì)CRISPR/Cas9基因編輯載體作用后產(chǎn)生的突變的遺傳特性進(jìn)行了分析，經(jīng)過對(duì)部分突變植株的T1代靶向序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了純合突變植株，這說明變異可以穩(wěn)定地遺傳到子代中。DDRC1中選取1種缺失突變(突變方式Mutant1)，命名為株系a；選取1種插入突變(突變方式Mutant3)，命名為株系b；DDRC2中選取1種缺失突變(突變方式Mutant2)，命名為株系c；DDRC3中選取1種缺失突變(突變方式Mutant1)，命名為株系d。這4個(gè)株系擴(kuò)繁后，分別對(duì)各自得到的10株T1代植株進(jìn)行突變檢測(cè)，結(jié)果顯示，株系a的10株T1代植株中有2株為純合突變，命名為a1、a2；株系b的10株T1植株中有1株為純合突變，命名為b1；株系c的10株T1植株中有1株為純合突變，命名為c1；株系d的10株T1植株中有2株為純合突變，命名為d1、d2；并且，T1代植株的突變方式與相對(duì)應(yīng)的T0代突變方式相同，具體測(cè)序比對(duì)結(jié)果如圖5。

“ ”表示PAM位點(diǎn)，“-”表示堿基缺失突變，“+”表示堿基插入突變；A，DDRC1 T0代31株植株中有11株發(fā)生突變，包括5種突變類型。WT為靶向的野生型水稻D3的基因序列；Mutant1為缺失2個(gè)堿基(AT)；Mutant2為缺失一個(gè)堿基(A)；Mutant3為插入1個(gè)堿基(T)；Mutant4為插入1個(gè)堿基(G)；Mutant5為插入1個(gè)堿基(A)。B，DDRC2 T0代24株植株中有6株發(fā)生突變，包括5種突變類型。WT為靶向的野生型水稻D3的基因序列；Mutant1為缺失3個(gè)堿基(TTG)；Mutant2為缺失3個(gè)堿基(AGT)；Mutant3為缺失2個(gè)堿基(GT)；Mutant4為缺失2個(gè)堿基(TG)；Mutant5為缺失4個(gè)堿基(GTGT)。C，DDRC3 T0代10株植株中有2株發(fā)生突變，包括1種突變類型。WT為靶向的野生型水稻D3的基因序列；Mutant1為缺失8個(gè)堿基(CAGTTGCG)“_”， PAM site; “-”， base deletion ; “+”， base insertion; A， 11 mutations were identified in 31 transgenic plants of DDRC1， including 5 mutation type; WT, the sequence of D3 in wild rice; Mutant1, 2 bases deleted (AT); Mutant2, 1 base deleted (A); Mutant3, 1 base inserted (T); Mutant4, 1 base inserted (G); Mutant5, 1 base inserted (A). B， 6 mutations were identified in 24 transgenic plants of DDRC2， including 4 mutation type; WT, the sequence of D3 in wild rice; Mutant1, 3 bases deleted (TTG); Mutant2, 3 bases deleted (AGT); Mutant3, 2 bases deleted (GT); Mutant4, 2 bases deleted (TG); Mutant5, 4 bases deleted (GTGT). C， Two mutations were identified in 10 transgenic plants of DDRC3， including 1 mutation type; WT, the sequence of D3 in wild rice; Mutant1, 8 bases(CAGTTGCG) deleted圖4 T0代轉(zhuǎn)基因植株具體突變類型Fig.4 The mutation type of T0 transgenic lines

A為株系a，DDRC1(Mutant1)純合突變植株a1和a2的測(cè)序結(jié)果；B為株系b，DDRC1(Mutant3)純合突變植株b1的測(cè)序結(jié)果；C為株系c，DDRC2(Mutant2)純合突變植株c1的測(cè)序結(jié)果；D為株系d，DDRC3(Mutant1)純合突變植株d1和d2的測(cè)序結(jié)果A， the sequencing result of the homozygous mutant plants a1and a2 of the DDRC1(Mutant1); B， the sequencing result of the homozygous mutant plant b1 of DDRC1(Mutant3); C， the sequencing result of the homozygous mutant plant c1 of DDRC2(Mutant2); D， the sequencing result of the homozygous mutant plants d1and d2 of DDRC3(Mutant1)圖5 T1代轉(zhuǎn)基因植株的測(cè)序結(jié)果Fig.5 The sequencing results of T1 transgenic lines

2.3 轉(zhuǎn)基因水稻突變體植株表型鑒定

如表4與圖6所示，3周齡T1代純合突變植株中，a1和a2對(duì)應(yīng)的靶位點(diǎn)為DDRC1，突變方式為缺失2個(gè)堿基(AT)，與野生型日本晴相比，株高及分蘗數(shù)沒有明顯變化；b1對(duì)應(yīng)的靶位點(diǎn)為DDRC1，突變方式為插入一個(gè)堿基(T)，與野生型日本晴相比，也無明顯的表型差異；c1對(duì)應(yīng)的靶位點(diǎn)為DDRC2，突變方式為缺失3個(gè)堿基(AGT)，與野生型日本晴相比，也無明顯的表型差異；d1和d2對(duì)應(yīng)的靶位點(diǎn)為DDRC3，突變方式為缺失8個(gè)堿基(CAGTTGCG)，與野生型日本晴相比，株高明顯變矮，分蘗數(shù)增多。3周齡T1代純合突變植株中，只有靶向位點(diǎn)DDRC3的純合突變植株表型有明顯變化，靶向位點(diǎn)DDRC1 與DDRC2的純合突變植株表型沒有明顯變化，推測(cè)其可能與靶位點(diǎn)的位置及其突變方式有關(guān)系。T1代純合突變植株a1、a2、b1的缺失或者插入突變破壞了CDS序列的起始密碼子ATG，但在序列分析中我們發(fā)現(xiàn)，靶位點(diǎn)DDRC1下游135 bp處有還存在一個(gè)ATG序列，這個(gè)ATG序列可能替代上游的ATG位點(diǎn)重新起始了基因的表達(dá)。由于新的表達(dá)框只導(dǎo)致基因5’部分缺失，很可能對(duì)基因功能只產(chǎn)生了較小的影響，因而沒有產(chǎn)生明顯的表型變化。而T1代純合突變植株c1缺失的3個(gè)堿基(AGT)位于D3基因CDS序列的1 441～1 443 bp處，引起了一個(gè)三聯(lián)密碼子的缺失，對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基缺失很可能不能顯著影響基因的功能，因此突變體的表型也沒有受到明顯的影響。DDRC3位點(diǎn)上的突變體d1和d2產(chǎn)生明顯的形態(tài)變化，則表明較長(zhǎng)的片段缺失能夠更有效地改變基因功能，從而影響植物的表型。這些發(fā)現(xiàn)，提示我們?cè)趯?duì)單個(gè)基因功能進(jìn)行研究時(shí)，如果僅產(chǎn)生一種類型的突變，有可能無法確定基因的功能，需要通過獲得多種類型的突變，來相互印證以確?；蚬δ芊治龅臏?zhǔn)確性。而在突變類型的選擇上，要盡可能避免選擇少量缺失或變化較小的突變類型。

表4 T1代純合突變植株的突變方式及其表型對(duì)應(yīng)表

Table 4 The corresponding table of genotype and phenotype of T1homozygous mutants

純合突變植株名稱Homozygousmutantplantsname靶點(diǎn)位置Targetposition突變方式Mutationpattern與野生型日本晴相比株高變化Heightchangecomparedwithwildtype與野生型日本晴相比分蘗數(shù)變化Tillernumberchangecomparedwithwildtypea1DDRC1缺失兩個(gè)堿基Twobasesdeleted(AT)無明顯變化Nosignificantchange無變化Nochangea2DDRC1缺失兩個(gè)堿基Twobasesdeleted(AT)無明顯變化Nosignificantchange無變化Nochangeb1DDRC1插入一個(gè)堿基onebaseinserted(T)無明顯變化Nosignificantchange無變化Nochangec1DDRC2缺失三個(gè)堿基Threebasesdeleted(AGT)無明顯變化Nosignificantchange無變化Nochanged1DDRC3缺失八個(gè)堿基Eightbasesdeleted(CAGTTGCG)較矮Shorter增多Increasedd2DDRC3缺失八個(gè)堿基Eightbasesdeleted(CAGTTGCG)較矮Shorter增多Increased

A、B、C和D中的植株a1、a2、b1、c1與野生型日本晴wt相比，表型沒有明顯變化；E和F中的植株d1、d2與野生型日本晴wt相比，表型變化明顯，株高變矮，分蘗數(shù)增多A， B， C and D， the phenotype of the plant (a1， a2， b1 and c1) did not change significantly compared with wild type; E and F， the phenotype of the plant (d1 and d2) changed significantly compared with wild type， the plant height became shorter， and the tiller number became more圖6 T1代轉(zhuǎn)基因植株的表型Fig.6 The phenotype of T1 transgenic plants

3 討論

水稻新品種培育的基礎(chǔ)在于現(xiàn)有優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，而其成功的關(guān)鍵在于準(zhǔn)確選擇合適的基因進(jìn)行改造。植物生長(zhǎng)發(fā)育、抵御不良環(huán)境和抗病防衛(wèi)反應(yīng)中同時(shí)存在著正向和負(fù)向調(diào)控基因，因此可以考慮通過導(dǎo)入正向調(diào)控基因或敲除負(fù)向調(diào)控基因來實(shí)現(xiàn)水稻抗病性的提升。根據(jù)目前的技術(shù)水平，CRISPR/Cas9在水稻中的基因敲除效率比基于該技術(shù)的基因敲入/替換效率要高得多[20]。因此，選擇水稻特定的調(diào)控基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，顯然是目前最為簡(jiǎn)潔有效的策略。

本研究結(jié)果表明，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)能以較高效率成功編輯水稻靶向DNA 序列，同時(shí)靶向編輯效率受靶向位置影響。并且，同一靶向位點(diǎn)，可以產(chǎn)生多種突變方式，靶位點(diǎn)PAM前發(fā)生堿基缺失或者插入，發(fā)生堿基缺失占總突變的比例為72.23%。此外，我們還發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9基因編輯載體靶向的基因序列的位置的不同，導(dǎo)致純合突變體植株呈現(xiàn)出的表型也不盡相同。由以上結(jié)果可見，基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)發(fā)展的遺傳材料往往存在不同的突變方式，能為進(jìn)一步研究提供豐富的遺傳材料。值得注意的是，CRISPR/Cas9獲得的材料中有部分有明確的基因型突變，但是卻無明顯的表型差異。這一現(xiàn)象提示我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)，不僅能發(fā)展基因功能研究的基礎(chǔ)材料，同時(shí)也具有重大的應(yīng)用價(jià)值。以水稻抗病育種為例，水稻基因組中存在大量抗病負(fù)調(diào)控基因，如pi21、OsWAK112d、Ob-fold等基因[21-24]均為稻瘟病的負(fù)向調(diào)控基因，根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，定向地編輯這些基因，使得這些基因功能缺失或改變將有助于水稻抗病性的提升。此外，從我們的研究可以看出，針對(duì)同一基因，不僅不同位點(diǎn)的編輯會(huì)產(chǎn)生不同的效果，即便是同一位點(diǎn)的編輯也能產(chǎn)生不同的突變類型。因此，基于現(xiàn)有的優(yōu)良種質(zhì)針對(duì)這些靶位點(diǎn)進(jìn)行改造，顯然能夠幫助我們以相當(dāng)高的效率衍生出一系列綜合性狀優(yōu)良，同時(shí)兼具不同特性的新種質(zhì)，從而加快水稻抗病育種進(jìn)程。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Application of the technology of CRISPR/Cas9 edit rice gene

YUAN Wenxia1，2， WANG Xuming2， LI Dongyue2，3， ZHOU Jie2， YAN Chengqi1，2，*， CHEN Jianping1，2，*

(1.CollegeofChemistryandLifeSciences，ZhejiangNormalUniversity，Jinhua321004，China；2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl，MOAKeyLaboratoryforPlantProtectionandBiotechnology，ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofVirology，InstituteofVirologyandBiotechnology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 3.CollegeofPlantProtection，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，China)

In this study， the CRISPR/Cas9 vector system was optimized in order to construct gene editing constructors in two steps. With optimized CRISPR/Cas9 system， three genome editing constructors targeting different sites ofD3 gene in rice (OryzasativaL. spp.Japonicacv. Nipponbare) were generated， and the transgenic plants were successfully produced byAgrobacterium-mediated transformation. The sequencing results of T0transgenic plants showed that the mutation rate of target site DDRC1 was 35.48%， and five mutation types were detected; the mutation rate of target site DDRC2 was 25.00%， and also with five mutation types; the mutation rate of target site DDRC3 was 20.00%， and only one mutation type was detected. The phenotype， height and tiller number， together with the genotypes of homozygous mutants were investigated， and the gene editing efficiency of the optimized CRISPR/Cas9 system along with the position effect and mutation patterns were also analyzed and discussed. In summary， the findings in this research provided important information for further developing and utilizing of rice germplasm on variety agronomic trait with the optimized CRISPR/Cas9 system.

rice; CRISPR/Cas9;D3 gene; gene editing

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.01

2017-03-09

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0100601，2016YFD0200804)；浙江省自然基金(2014C140001，2016C110017)

原文霞(1990—)，女，山西汾陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail: yuanwenxia5@163.com

*通信作者，嚴(yán)成其，E-mail: yanchengqi@163.com；陳劍平，E-mail: jpchen2001@126.com

S511；Q789

A

1004-1524(2017)05-0685-09

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 685-693

原文霞，王栩鳴，李冬月，等. 利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯水稻基因[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(5)： 685-693.