麥胚多肽-鈣螯合物制備工藝優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)表征

丁媛媛，王 莉，張新霞，王 韌，羅小虎，李亞男，李永富，李 娟，陳正行

麥胚多肽-鈣螯合物制備工藝優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)表征

丁媛媛，王 莉*，張新霞，王 韌，羅小虎，李亞男，李永富，李 娟，陳正行*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室，江蘇 無錫 214122）

為減少小麥胚芽的資源浪費(fèi)，提高其附加值，同時解決居民缺鈣的問題，對麥胚多肽與鈣離子螯合的工藝進(jìn)行研究。以小麥胚芽為原料，以螯合率為考察指標(biāo)，設(shè)計單因素試驗和正交試驗，考察溫度、麥胚多肽與鈣離子物質(zhì)的量比、時間、pH值對螯合率影響。結(jié)果表明，在溫度65 ℃、麥胚多肽與鈣離子物質(zhì)的量比3∶1、時間60 min、pH 9.5的條件下，螯合率達(dá)到最大，為86.21%。對最佳條件下制備的麥胚多肽-鈣螯合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，紅外光譜表明麥胚多肽的氨基和羧基都參與了螯合反應(yīng)；圓二色譜表明螯合物的二級結(jié)構(gòu)由原來的無序結(jié)構(gòu)向有序、緊密的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變；掃描電子顯微鏡表明螯合物的分子有明顯的聚集現(xiàn)象。

麥胚多肽；螯合鈣；結(jié)構(gòu)表征

小麥胚芽是面粉加工業(yè)的副產(chǎn)物，含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪、維生素以及礦物元素，被營養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為“人類天然的營養(yǎng)寶庫”[1]。其中，碳水化合物含量占45%左右[2]，蛋白質(zhì)含量占30%左右[3]。麥胚蛋白是一種完全蛋白，含有8 種人體所需的必需氨基酸[4]，尤其富含其他谷物缺乏的賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸[5]。而且，必需氨基酸配比與世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的模式值基本接近[6]，營養(yǎng)價值可與雞蛋蛋白媲美。除此之外，麥胚中還富含生理活性物質(zhì)，如谷胱甘肽[7]、黃酮類物質(zhì)[8]、麥胚凝集素[9]、二十八烷醇[10]等。盡管如此，小麥胚芽并沒有得到有效利用，常常被作為下腳料處理，造成資源浪費(fèi)，環(huán)境污染。

目前，小麥胚芽的蘊(yùn)藏量達(dá)到200～300萬 t，有很大的開發(fā)空間。相關(guān)學(xué)者為了節(jié)糧減損，對麥胚資源進(jìn)行深入研究，以期增加其附加值。例如，通過酶解的方式釋放多種生物活性的肽段，其中抗氧化活性肽[11-13]、降血壓活性肽[14]以及金屬螯合活性肽[15-16]都有相關(guān)的報道。目前，國內(nèi)外的學(xué)者對鋅螯合肽[17-19]、鐵螯合肽[20-21]研究較多，但是鈣螯合肽的研究主要集中于動物蛋白[22-23]中，由于動物蛋白存在潛在的過敏源，所以迫切需要新的蛋白源，而麥胚蛋白作為來源廣、成本低、質(zhì)優(yōu)的植物蛋白，成為鈣螯合肽很有開發(fā)前景的原料來源。

市面上的補(bǔ)鈣劑主要有無機(jī)鈣、有機(jī)鈣和氨基酸鈣[24]：1）無機(jī)鈣，如磷酸鈣、碳酸鈣、氯化鈣等，這類補(bǔ)鈣劑溶解性差，吸收率低，對胃有刺激作用；2）有機(jī)鈣，如葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、檸檬酸鈣等，這類補(bǔ)鈣劑鈣含量低，總體利用率不高；3）氨基酸鈣，如甘氨酸鈣、谷氨酸鈣等，這類補(bǔ)鈣劑鈣吸收率顯著提高，但易被植酸以及磷酸沉淀。肽鈣作為新型的補(bǔ)鈣劑，如酪蛋白肽鈣，這類補(bǔ)鈣劑中鈣離子與小肽結(jié)合，借助小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收機(jī)制以配合物的形式被小腸吸收，能顯著促進(jìn)鈣的利用率[25]。因此，以麥胚蛋白源為原料，使鈣離子與麥胚多肽螯合，借助小肽吸收理論，促進(jìn)鈣離子和多肽的吸收利用具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究以小麥胚芽為原料，麥胚分離蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解獲得麥胚多肽，向其加入鈣源，制備麥胚多肽-鈣螯合物。通過單因素試驗和正交試驗，確定最佳的螯合條件；利用傅里葉紅外光譜、圓二色譜、掃描電子顯微鏡對多肽及其螯合物進(jìn)行分析，旨在為補(bǔ)鈣劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂小麥胚芽 河南安陽漫天雪食品有限公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g） 廣西南寧龐博生物工程有限公司；HCl、NaOH、CaCl2、無水乙醇、NaCl、茚三酮、鈣紅指示劑（均為分析純） 國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MP-501A超級恒溫循環(huán)槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；COULTER Avanti J-26XP冷凍離心機(jī) 美國貝克曼公司；Beta 2-8LDplus CHRIST凍干機(jī) 德國Marin Christ公司；FEI Quanta? 200掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；FTIR傅里葉紅外光譜 美國Thermo Electron公司；MOS-450圓二色光譜儀 法國生物公司。

1.3 方法

1.3.1 麥胚多肽制備

1.3.1.1 麥胚分離蛋白提取及酶解

麥胚分離蛋白提取根據(jù)堿溶酸沉[26]的方法，脫脂小麥胚芽粉分散于去離子水中（料液比1∶10（g/mL）），用1 mol/L NaOH溶液將懸濁液調(diào)至并穩(wěn)定在pH 9.5，40 ℃攪拌2 h，5 000 r/min離心10 min，去除沉淀。收集上清液，用1 mol/L HCl溶液調(diào)到pH 4.0，靜置60 min，使蛋白絮凝沉淀，5 000 r/min離心10 min，收集蛋白沉淀，沉淀水洗兩次，將蛋白調(diào)回pH 7.0。提取的麥胚分離蛋白于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥備用。

麥胚分離蛋白用堿性蛋白酶水解，水解條件[26]：蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶-底物質(zhì)量比1∶50、溫度50 ℃、pH 8.0，連續(xù)水解300 min，水解結(jié)束后沸水浴中滅酶10 min，5 000 r/min離心10 min，收集上清液冷凍干燥備用。

1.3.1.2 麥胚分離蛋白酶解多肽水解度和分子質(zhì)量的測定

水解度的測定根據(jù)pH-Stat法[27]，計算如式（1）、（2）所示：

式中：α為α-NH2的平均解離度；B為水解過程中消耗的NaOH的體積/mL；Nb為NaOH濃度/（mol/L）；Mp為參與水解的蛋白質(zhì)量/g；htot表示每克原料蛋白質(zhì)的總肽鍵數(shù)，8.3 mmol/g。

多肽分子質(zhì)量分布的測定：在Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)上采用凝膠過濾色譜柱TSK G2000 SWXL（7.8 mm×300 nm）測定。測定條件：流動相為V（乙腈）∶V（水）=3∶7，流速0.5 mL/min，紫外檢測波長220 nm。標(biāo)準(zhǔn)蛋白：GGG（189 D）、GGYR（451 D）、桿菌肽（1 450 D）、抑肽酶（6 500 D）、細(xì)胞色素C（12.5 kD）。

1.3.2 麥胚多肽與鈣離子的螯合工藝流程

麥胚多肽→調(diào)節(jié)螯合條件（溫度、pH值、麥胚多肽與鈣離子物質(zhì)的量比、時間）→螯合→3 倍冷無水乙醇沉淀螯合物→10 000×g離心15 min，收集沉淀→用無水乙醇洗滌至上清液加入鈣指示劑不變色，加入茚三酮指示劑加熱后不變紫[28]→測定螯合物中鈣的含量。

鈣含量的測定采用原子吸收分光光度法[29]，螯合率計算如式（3）所示：

1.3.3 單因素試驗

將麥胚多肽溶于20 mmol/L的Tris-HCl溶液中，配制成不同濃度的多肽溶液，添加一定量的50 mmol/L的CaCl2溶液，恒溫水浴一定時間。溶液分別以多肽與鈣離子物質(zhì)的量比（0.3∶1、2∶1、3∶1、6∶1、9∶1、12∶1）、反應(yīng)液pH值（3、4、5、6、7、8、9、10）、溫度（10、20、30、40、50、60、70 ℃）、時間（10、30、60、90、120 min）為影響因素，以螯合率為指標(biāo)，考察各因素對螯合反應(yīng)的影響。反應(yīng)基本條件為：pH 7.8、溫度40 ℃、時間60 min、多肽與鈣離子物質(zhì)的量比3∶1。

1.3.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取合適的因素水平，以鈣螯合率為指標(biāo)，設(shè)計四因素三水平正交試驗。

表 1 正交試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array experiments

1.3.5 麥胚多肽-鈣螯合物的表征

1.3.5.1 傅里葉紅外光譜分析

在最佳螯合條件下，制備麥胚多肽-鈣螯合物，取適量麥胚多肽和螯合物分別與光譜純級KBr混合并研磨，壓制成透明薄片，在4 000～400 cm－1波段內(nèi)對樣品進(jìn)行掃描，分辨率0.1 cm－1，分析特征峰。

1.3.5.2 圓二色譜分析

將在最佳條件下制備的螯合物以及麥胚多肽分別溶解于去離子水中，多肽和螯合物的溶液在遠(yuǎn)紫外區(qū)域（190～250 nm）進(jìn)行觀察。二級結(jié)構(gòu)（包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲）由圓二色譜程序軟件分析。

1.3.5.3 掃描電子顯微鏡觀察

在最佳螯合條件下，制備麥胚多肽-鈣螯合物，取適量麥胚多肽和螯合物分別均勻涂抹于樣盤，噴金鍍膜處理，處理好的樣品放入掃描電子顯微鏡觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果利用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，Origin 8.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度、螯合率及多肽分子質(zhì)量變化

圖 1 水解度和螯合率隨水解時間的變化Fig. 1 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis and metal chelating activity

由圖1可知，在整個水解過程中，隨著水解時間的延長，水解度不斷增大，在300 min時水解度達(dá)到最大值（15.35±0.19）%。前60 min是水解快速反應(yīng)的階段，在此階段內(nèi)肽鍵大量斷裂，水解度快速升高，之后由于可水解的催化位點(diǎn)變少，水解速度放緩。另一方面，隨著水解時間的延長，螯合率先增加后減少，在240 min時達(dá)到最大值（48.26±0.53）%，此時水解度為（14.70±0.27）%。這說明在堿性蛋白酶的作用下，麥胚分離蛋白隨著水解時間的延長釋放出越來越多的多肽片段，這些多肽由于暴露出更多的螯合位點(diǎn)所以比大分子的蛋白更有利于螯合。但是，過度水解形成的游離氨基酸并不利于螯合[30]。為了進(jìn)一步驗證該結(jié)論，對不同水解時間的多肽組分進(jìn)行分子質(zhì)量的分析。

表 2 不同水解時間酶解液中多肽分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular weight distribution of wheat germ polypeptides at different hydrolysis times

分別對水解60～300 min的麥胚多肽的分子質(zhì)量分布進(jìn)行測定（表2）。水解240 min時，螯合率最高，此時的多肽混合物的組成成分與水解60、120、180 min相比較，大分子的多肽（大于1 000 D）較少，小分子的多肽（小于1000 D）較多，說明大分子的多肽并不利于螯合；然而水解300 min時鈣螯合率下降，與240 min相比，300 min的組成成分中小肽或氨基酸（小于500 D）所占比例提高，說明過度水解形成的小分子也不利于螯合?？傊?，要達(dá)到較好的螯合效果，要求水解形成的多肽分子質(zhì)量不能太大或太小，本研究中選擇240 min作為制備多肽的最佳水解時間，該結(jié)論與相關(guān)的研究[15]一致。

2.2 單因素試驗結(jié)果

圖 2 麥胚多肽與鈣離子物質(zhì)的量比對螯合率的影響Fig. 2 Effect of ratio of wheat germ polypeptide to Ca2+on chelation efficiency

2.2.1 麥胚多肽與鈣離子物質(zhì)的量比對螯合率的影響從圖2可以分析出，當(dāng)麥胚多肽與鈣離子物質(zhì)的量比為0.3∶1時，螯合率較低，說明此時的鈣離子過量，大量的鈣離子未參與螯合；提高二者比值，螯合率成直線上升，當(dāng)麥胚多肽與鈣離子物質(zhì)的量比超過2∶1后，螯合率增速減緩，說明此時多肽的添加量已經(jīng)接近飽和，繼續(xù)添加多肽對螯合率影響不大，但多肽的有效利用率下降。最終確定多肽與鈣離子物質(zhì)的量比范圍2∶1～6∶1。這與氨基酸-金屬離子螯合物略有差別，可能由于麥胚分離蛋白水解物的組成成分復(fù)雜，既有氨基酸，又有分子質(zhì)量不同大小的多肽，所以，發(fā)生螯合反應(yīng)時不像氨基酸反應(yīng)那樣單一，不是嚴(yán)格的按照2∶1的比例。

2.2.2 pH值對螯合率的影響

圖 3 pH值對螯合率的影響Fig. 3 Effect of pH on chelation efficiency

由圖3可知，pH值對于螯合率有較大影響，在pH 3～10的范圍內(nèi)，螯合率先下降后上升，在強(qiáng)堿性條件下又下降?？赡艿脑蚴窃趶?qiáng)酸性條件下，多肽分子完全展開，暴露出供電基團(tuán)（如—C＝O、—NH2），這些供電基團(tuán)有一定的吸引鈣離子的能力。在弱酸環(huán)境，H+結(jié)合在多肽分子表面，使某些基團(tuán)帶上正電，從而對鈣離子形成排斥作用，不利于螯合物的形成[28]。在弱堿性條件下，—COOH電離失去H+帶負(fù)電，—NH2也能吸引帶正電的離子，這些都也有利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行，使螯合率升高[31]。在強(qiáng)堿性條件下，OH－與多肽中的供電子基團(tuán)爭奪鈣離子，生成了氫氧化鈣沉淀，螯合率降低。適宜的反應(yīng)pH值范圍是8～10。

2.2.3 溫度對螯合率的影響

圖 4 溫度對螯合率的影響Fig. 4 Effect of temperature on chelation efficiency

從圖4可知，隨溫度的升高，螯合率先增加后減少，在60 ℃附近達(dá)到最大值。這是因為適當(dāng)提高反應(yīng)溫度有利于增加多肽與鈣離子碰撞的次數(shù)，使螯合反應(yīng)順利進(jìn)行。但是，溫度過高，多肽易發(fā)生羰氨反應(yīng)[31]，減少了鈣離子的螯合位點(diǎn)，而且氨基酸或小肽與金屬離子的螯合為放熱反應(yīng)[32]，過高的溫度不利于螯合。適宜的溫度范圍是50～70 ℃。

2.2.4 時間對螯合率的影響

圖 5 時間對螯合率的影響Fig. 5 Effect of reaction time on chelation efficiency

從圖5可以看出，螯合率隨反應(yīng)時間的延長先增加后基本維持不變。在30 min時，螯合率已經(jīng)達(dá)到較高的值，30 min之后螯合率上升緩慢，說明螯合反應(yīng)是快速的反應(yīng)。適宜的時間范圍是30～90 min。

2.3 正交試驗結(jié)果

表3顯示，各因素對螯合率的主次影響順序為：pH值＞溫度＞麥胚多肽與鈣離子物質(zhì)的量比＞時間；優(yōu)化后的最優(yōu)組合為A3B3C2D2，即pH 9.5、溫度65 ℃、多肽與鈣離子物質(zhì)的量比3∶1、時間60 min。對優(yōu)化得到的最佳的螯合條件進(jìn)行驗證，在此條件下鈣螯合率為86.21%。

表 3 麥胚多肽與鈣離子螯合的正交試驗Table 3 Orthogonal array design with experimental values of chelation efficiency

2.4 麥胚多肽-鈣螯合物的表征

2.4.1 麥胚多肽及其螯合物的紅外光譜分析

3 399.88 cm－1主要由N—H的伸縮振動所致；1 652.63 cm－1屬于酰胺Ⅰ帶，主要由C＝O的伸縮振動引起；1 400.08 cm－1屬于氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)—COO－的吸收峰。由圖6可以看出，特征區(qū)—NH2的N—H吸收峰由3 399.88 cm－1移動到3 419.51 cm－1；酰胺Ⅰ帶C＝O吸收峰由1 652.63 cm－1移動到1 648.40 cm－1；—COO－吸收峰由1 400.08 cm－1移動到1 409.75 cm－1，麥胚多肽-鈣螯合物的紅外光譜發(fā)生了明顯的變化，說明多肽中氨基和羧基均參與了鈣的螯合反應(yīng)[33]。

圖 6 麥胚多肽（A）及其螯合物（B）的紅外光譜Fig. 6 Infrared spectra of wheat germ polypeptides (A) and calciumchelating wheat germ polypeptides (B)

2.4.2 麥胚多肽及其螯合物的二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)多肽鏈之間可形成α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲等立體結(jié)構(gòu)，外界條件可引起這些二級結(jié)構(gòu)的改變。麥胚多肽及其螯合物的二級結(jié)構(gòu)用圓二色譜儀進(jìn)行分析（圖7和表4）。麥胚多肽的二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲（97.8%）為主，以無序的形式存在；而螯合物的二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角所占的比例明顯上升，無規(guī)則卷曲所占的比例明顯降低。說明螯合反應(yīng)改變了麥胚多肽原有的二級結(jié)構(gòu)，由原來的無序結(jié)構(gòu)（柔性結(jié)構(gòu)）向更加有序、規(guī)則、緊密的結(jié)構(gòu)（剛性結(jié)構(gòu)）轉(zhuǎn)變。

圖 7 麥胚多肽及其螯合物的圓二色譜Fig. 7 Far-UV circular dichroism spectra of wheat germ polypeptides and calcium-chelating wheat germ polypeptides

表 4 麥胚多肽及其螯合物的二級結(jié)構(gòu)Table 4 Secondary structure contents of wheat germ polypeptides and calcium-chelating wheat germ polypeptides

2.4.3 掃描電子顯微鏡分析

圖 8 麥胚多肽（A）及螯合物（B）的掃描電子顯微鏡圖Fig. 8 Scanning electron micrographs of wheat germ polypeptides (A) and calcium-chelating wheat germ polypeptides (B)

多肽的微觀結(jié)構(gòu)反映其分子的聚集情況，由圖8可見，麥胚多肽呈疏松多孔的小顆粒狀，而螯合物呈大的不均勻的團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，這表明螯合反應(yīng)能破壞多肽的結(jié)構(gòu)，使之發(fā)生聚集。這種聚集主要由于鈣離子與多肽分子的羧基氧原子和氨基氮原子發(fā)生作用產(chǎn)生的（圖9），多肽之間通過鈣離子連接發(fā)生交聯(lián)，形成較大的顆粒，而且這些顆粒之間相互吸引進(jìn)而發(fā)生聚集。

圖 9 麥胚多肽與鈣離子結(jié)合機(jī)理推測圖Fig. 9 Predicted mechanism of complexation of wheat germ polypeptides with calcium ion

3 結(jié) 論

本實驗以小麥胚芽為原料，利用堿性蛋白酶水解麥胚分離蛋白產(chǎn)生麥胚多肽，將多肽與鈣離子進(jìn)行螯合。通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化出最佳的螯合條件為pH 9.5、溫度65 ℃、麥胚多肽與鈣離子物質(zhì)的量比3∶1、時間60 min，此條件下的螯合率為86.21%。該螯合率較豬皮膠原多肽螯合鈣[34]、白鰱魚骨膠原多肽螯合鈣[31]等要高，對提高鈣的利用率有重要意義。對螯合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，紅外光譜說明麥胚多肽的氨基和羧基都參與了螯合反應(yīng)；圓二色譜表明螯合物的二級結(jié)構(gòu)與原來的多肽相比由無序結(jié)構(gòu)（柔性結(jié)構(gòu)）向有序、緊密的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變（剛性結(jié)構(gòu)）；掃描電子顯微鏡則說明螯合物較原來多肽分子有聚集現(xiàn)象?？傊?，本研究對提高小麥胚芽的附加值，具有重要的經(jīng)濟(jì)和理論意義。

[1] GE Y Q, SUN A D, NI Y Y, et al. Some nutritional and functional properties of defatted wheat germ protein[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(12): 6215-6218. DOI:10.1021/ jf000478m.

[2] ADEBOWALE K, LAWAL O. Foaming, gelation and electrophoretic characteristics of mucuna bean (Mucuna pruriens) protein concentrates[J]. Food Chemistry, 2003, 83(2): 237-246. DOI:10.1016/ S0308-8146(03)00086-4.

[3] ARSHAD M U, ANJUM F M, ZAHOOR T. Nutritional assessment of cookies supplemented with defatted wheat germ[J]. Food Chemistry, 2007, 102(1): 123-128. DOI:10.1016/j.foodchem.2006.04.040.

[4] 蔡秋聲. 小麥胚芽油: 四[J]. 糧食與油脂, 1993(4): 52-56.

[5] ZHU K X, ZHOU H M, QIAN H F. Proteins extracted from defatted wheat germ: nutritional and structural properties[J]. Cereal Chemistry, 2006, 83(1): 69-75. DOI:10.1094/CC-83-0069.

[6] 程云輝, 王璋, 許時嬰. 麥胚蛋白的研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2006, 22(2): 105-108. DOI:10.3969/j.issn.1003-5788.2006.02.032.

[7] SATO M, HOSOKAWA T, YAMAGUCHI T, et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from wakame (Undaria pinnatifida) and their antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(21): 6245-6252. DOI:10.1021/jf020482t.

[8] 于長青, 張東杰, 牟光慶, 等. 麥胚黃酮類提取物對血脂和抗氧化的影響[J]. 營養(yǎng)學(xué)報, 2001, 23(4): 390-392. DOI:10.3321/ j.issn:0512-7955.2001.04.045.

[9] MATSUI T, LI C, OSAJIMA Y. Preparation and characterization of novel bioactive peptides responsible for angiotensinⅠ-converting enzyme inhibition from wheat germ[J]. Journal of Peptide Science, 1999, 5(7): 289-297. DOI:10.1002/(SICI)1099-1387(199907)5:7＜289::AID-PSC196＞3.0.CO;2-6.

[10] RAND N T, COLLINS V K. Improving cereals with defatted wheat germ[J]. Food Technology, 1958, 12(11): 586-589.

[11] 劉振家, 朱科學(xué), 周惠明. 超聲波輔助酶解脫脂小麥胚芽制備抗氧化肽的研究[J]. 中國油脂, 2009, 34(5): 38-41. DOI:10.3321/ j.issn:1003-7969.2009.05.011.

[12] 王丹丹, 胡蓉. 脫脂小麥胚芽酶解及其水解物抗氧化性研究[J]. 現(xiàn)代面粉工業(yè), 2009, 23(5): 44-47. DOI:10.3969/ j.issn.1674-5280.2009.05.016.

[13] ZHU K, ZHOU H, QIAN H. Antioxidant and free radical-scavenging activities of wheat germ protein hydrolysates (WGPH) prepared with alcalase[J]. Process Biochemistry, 2006, 41(6): 1296-1302. DOI:10.1016/j.procbio.2005.12.029.

[14] ZHOU C, MA H, YU X, et al. Pretreatment of defatted wheat germ proteins (by-products ofour mill industry) using ultrasonic horn and bath reactors: effect on structure and preparation of ACE-inhibitory peptides[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2013, 20(6): 1390-1400. DOI:10.1016/j.ultsonch.2013.04.005.

[15] LIU F R, WANG L, WANG R, et al. Calcium-binding capacity of wheat germ protein hydrolysate and characterization of peptidecalcium complex[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(31): 7537-7544. DOI:10.1021/jf401868z.

[16] ZHU K X, WANG X P, GUO X N. Isolation and characterization of zinc-chelating peptides from wheat germ protein hydrolysates[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 12: 23-32. DOI:10.1016/ j.jff.2014.10.030.

[17] CHEN D, LIU Z, HUANG W, et al. Puri cation and characterisation of a zinc-binding peptide from oyster protein hydrolysate[J]. Journal of Functional Foods, 2013, 5(2): 689-697. DOI:10.1016/j.jff.2013.01.012. [18] WANG C, LI B, LI H. Zn (Ⅱ) chelating with peptides found in sesame protein hydrolysates: identification of the binding sites of complexes[J]. Food Chemistry, 2014, 165: 594-602. DOI:10.1016/ j.foodchem.2014.05.146.

[19] XIE N, HUANG J, LI B, et al. Af nity puri cation and characterisation of zinc chelating peptides from rapeseed protein hydrolysates: possible contribution of characteristic amino acid residues[J]. Food Chemistry, 2015, 173: 210-217. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.10.030.

[20] 段秀, 楊成濤, 孫云, 等. 羅非魚皮膠原蛋白肽亞鐵螯合修飾及螯合物性質(zhì)的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(18): 157-160. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.025.

[21] 黃賽博, 林慧敏, 鄧尚貴. 響應(yīng)面法優(yōu)化帶魚蛋白多肽螯合亞鐵制備工藝[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(4): 266-270; 277. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2016.04.045.

[22] CHEN D, MU X, HUANG H, et al. Isolation of a calcium-binding peptide from tilapia scale protein hydrolysate and its calcium bioavailability in rats[J]. Journal of Functional Foods, 2014, 6: 575-584. DOI:10.1016/j.jff.2013.12.001.

[23] ZHAO L, HUANG Q, HUANG S, et al. Novel peptide with a specific calcium-binding capacity from whey protein hydrolysate and the possible chelating mode[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(42): 10274-10282. DOI:10.1021/jf502412f.

[24] 黃海. 鯉魚卵鈣離子結(jié)合活性肽的制備及鈣結(jié)合機(jī)制的研究[D].青島: 中國海洋大學(xué), 2014.

[25] 蘇純陽, 董仲華, 香紅星. 微量元素氨基酸(小肽)螯合物的研究應(yīng)用進(jìn)展[J]. 飼料工業(yè), 2002, 23(1): 15-18. DOI:10.3969/j.issn.1001-991X.2002.01.007.

[26] LIU F, CHEN Z, WANG L, et al. Effects of protein solubilisation and precipitation pH values on the functional properties of defatted wheat germ protein isolates[J]. International Journal of Food Science & Technology, 2013, 48(7): 1490-1497. DOI:10.1111/ijfs.12117.

[27] ADLER-NISSEN J, ERIKSEN S, OLSEN H S. Improvement of the functionality of vegetable proteins by controlled enzymatic hydrolysis[J]. Plant Foods for Human Nutrition, 1983, 32(3/4): 411-423. DOI:10.1007/BF01091198.

[28] 肖珊, 黃立新, 趙璧秋. 乳清多肽螯合鈣的制備與結(jié)構(gòu)表征[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(24): 253-257. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.24.073.

[29] 衛(wèi)生部, 國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會. 食品中鈣的測定: GB/T 5009.92—2003[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

[30] WANG C, LI B, AO J. Separation and identi cation of zinc-chelating peptides from sesame protein hydrolysate using IMAC-Zn2+and LCMS/MS[J]. Food Chemistry, 2012, 134(2): 1231-1238. DOI:10.1016/ j.foodchem.2012.02.204.

[31] 劉閃, 劉良忠, 李小娜, 等. 白鰱魚骨膠原多肽螯合鈣的工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué), 2014, 35(10): 76-81. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201410014.

[32] 崔瀟, 江虹銳, 劉小玲, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化羅非魚魚皮膠原多肽螯合鎂的工藝條件的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(15): 238-241. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.15.024.

[33] 付文雯. 牛骨膠原多肽螯合鈣的制備及其結(jié)構(gòu)表征[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010. DOI:10.7666/d.Y1799742.

[34] 許先猛, 董文賓, 孫皎皎. 豬皮膠原多肽螯合鈣的制備及其結(jié)構(gòu)表征[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(20): 309-313. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2015.20.055.

Optimized Preparation and Structural Characterization of Calcium-Chelating Polypeptides from Wheat Germ Protein Hydrolysate

DING Yuanyuan, WANG Li*, ZHANG Xinxia, WANG Ren, LUO Xiaohu, LI Yanan, LI Yongfu, LI Juan, CHEN Zhengxing*
(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

This study aimed to reduce the waste of wheat germ resource and simultaneously achieve its value-added utilization for the purpose of solving the problem of calcium deficiency in some populations. Wheat germ protein hydrolysates was prepared by enzymatic hydrolysis using alkaline protease and then chelated with calcium ions to obtain calcium-chelating polypeptides. One-factor-at-a-time and orthogonal array experiments were devised to investigate the in uence of reaction temperature, molar ratio between polypeptides and calcium ions, reaction time and pH on the chelation efficiency. The optimal conditions that provided maximum chelation efficiency (86.21%) were determined as follows: reaction at 65 ℃ and pH 9.5 for 60 min with a molar ratio of polypeptide to calcium of 3:1. Infrared spectroscopic analysis con rmed the coordination reaction between calcium and carboxyl/amino groups in the polypeptides. Circular dichroism spectra indicated that the calcium-chelating polypeptides lost their disordered secondary structure and formed compact and ordered conformations compared to the control group. Scanning electron microscopy observation con rmed significant aggregation of calcium-chelating polypeptides.

wheat germ polypeptides; chelated calcium; structural characterization

10.7506/spkx1002-6630-201710036

TS201.2

A

1002-6630（2017）10-0215-07引文格式：

丁媛媛, 王莉, 張新霞, 等. 麥胚多肽-鈣螯合物制備工藝優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)表征[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 215-221.

10.7506/spkx1002-6630-20171036. http://www.spkx.net.cn

DING Yuanyuan, WANG Li, ZHANG Xinxia, et al. Optimized preparation and structural characterization of calciumchelating polypeptides from wheat germ protein hydrolysate[J]. Food Science, 2017, 38(10): 215-221. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710036. http://www.spkx.net.cn

2016-08-08

國家自然科學(xué)基金面上項目（31471616）；江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程項目（SJZZ15-0143）；全國糧食行業(yè)青年拔尖人才服務(wù)行業(yè)需求自主選題項目（LQ2016301）

丁媛媛（1991—），女，碩士研究生，研究方向為糧食精深加工。E-mail：1048327395@qq.com

*通信作者：王莉（1981—），女，副教授，博士，研究方向為糧食精深加工。E-mail：legend0318@hotmail.com陳正行（1960—），男，教授，博士，研究方向為糧食精深加工。E-mail：zxchen2007@126.com