基于高通量測(cè)序的郫縣豆瓣后發(fā)酵期細(xì)菌多樣性研究

趙紅宇，徐煒楨，楊國(guó)華，劉元福，岳 鵬，張 良,*

基于高通量測(cè)序的郫縣豆瓣后發(fā)酵期細(xì)菌多樣性研究

趙紅宇1，徐煒楨1，楊國(guó)華2，劉元福3，岳 鵬2，張 良1,*

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039；2.四川省丹 丹郫縣豆瓣集團(tuán)股份有限公司，四川省豆瓣釀制技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611732；3.四川友聯(lián)味業(yè)食品有限公司，四川 成都 611732）

為研究郫縣豆瓣后發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌變化規(guī)律，揭示其特有“日曬夜露”工藝的發(fā)酵本質(zhì)，采用MiSeq測(cè)序分析其從后發(fā)酵1 周至后發(fā)酵6 a期間一共8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌群落演替變化情況。結(jié)果表明，郫縣豆瓣后發(fā)酵過(guò)程中共有57 個(gè)門(mén)類(lèi)群、174 個(gè)綱類(lèi)群、321 個(gè)目類(lèi)群、535 個(gè)科類(lèi)群、921 個(gè)屬類(lèi)群的細(xì)菌參與演替變化。后發(fā)酵時(shí)間對(duì)郫縣豆瓣的細(xì)菌群落組成具有重要影響，隨著后發(fā)酵的進(jìn)行腸桿菌科和鏈形菌科持續(xù)減少，而鞘脂單胞菌科、芽孢桿菌科、梭菌科和消化鏈球菌科的細(xì)菌則出現(xiàn)先增加后減少，其峰值大多出現(xiàn)在1～3 a，但后發(fā)酵6 a的郫縣豆瓣細(xì)菌群落較其他樣品呈明顯偏低。該方法發(fā)現(xiàn)了大量的非培養(yǎng)細(xì)菌和未報(bào)道細(xì)菌，所得細(xì)菌多樣信息更接近于樣品微生態(tài)，更能夠全面解析自然發(fā)酵調(diào)味品—郫縣豆瓣的細(xì)菌多樣性，為傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化改造和食品質(zhì)量安全控制提供了科學(xué)支撐。

郫縣豆瓣；細(xì)菌群落；高通量測(cè)序

郫縣豆瓣屬中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品，迄今為止已有300多年的歷史，被列為中國(guó)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。郫縣豆瓣不僅生產(chǎn)工藝獨(dú)特，也以其味辣香醇、黏稠絨實(shí)、紅棕油亮、醬香濃郁等特點(diǎn)在我國(guó)醬類(lèi)產(chǎn)品中獨(dú)樹(shù)一幟，堪稱(chēng)川菜之魂[1-2]。截止2015年末，“郫縣豆瓣”品牌價(jià)值已達(dá)607.16億 元，位列“加工食品類(lèi)地理標(biāo)志產(chǎn)品”全國(guó)第一；當(dāng)年產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)到110萬(wàn)t，實(shí)現(xiàn)工業(yè)產(chǎn)值102億 元，出口世界絕大部分國(guó)家和地區(qū)，創(chuàng)匯超過(guò)4 000萬(wàn)美元[3]。

郫縣豆瓣的生產(chǎn)包括前期發(fā)酵和后熟發(fā)酵兩個(gè)階段，前期發(fā)酵主要是指霉瓣子的制曲和辣椒坯的預(yù)處理[2]。后熟發(fā)酵主要是將成熟霉瓣子和成熟辣椒坯按比例配料混合，加入適量食鹽和水，進(jìn)入發(fā)酵池發(fā)酵，經(jīng)過(guò)一定時(shí)期的翻曬和陳化，即是郫縣豆瓣特有的日曬夜露工藝[4-5]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)利用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）[6]、DNA克隆文庫(kù)[7]、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（terminalrestriction fragment length polymorphism，T-RFLP）分析[8]、16S rRNA基因文庫(kù)[9]等免培養(yǎng)技術(shù)，在分析研究發(fā)酵食品生產(chǎn)過(guò)程中微生物的功能作用方面，作出了大量卓有成效的成績(jī)，其直接從分子水平上研究微生物資源，避免了傳統(tǒng)基于微生物分離培養(yǎng)分析方法的局限性，在分析復(fù)雜環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)中具有優(yōu)勢(shì)。但這些方法都存在一些問(wèn)題，如測(cè)序通量低、操作復(fù)雜、干擾因素多、準(zhǔn)確率不高等，第2代基于宏基因組的深度測(cè)序技術(shù)又稱(chēng)為高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)，具有檢測(cè)通量更高、用時(shí)更少、準(zhǔn)確度更高以及檢測(cè)費(fèi)用更低等優(yōu)點(diǎn)，能更可靠、更全真、更直接地反映微生物的群落構(gòu)成、功能特性、變化演替和多樣性[10]。

目前，HTS技術(shù)在發(fā)酵調(diào)味品研究中得到了一定的應(yīng)用，如韓國(guó)學(xué)者對(duì)海鮮醬[11]、醬粉[12]、泡菜[13]、魚(yú)醬[14]和豆瓣辣醬[15]的發(fā)酵微生物多樣性已經(jīng)進(jìn)行了解析；歐洲學(xué)者更是從宏基因組的角度評(píng)述了該技術(shù)給食品微生物群落變化研究帶來(lái)的重大影響變化[16]。但是，國(guó)內(nèi)外尚鮮有利用該技術(shù)分析郫縣豆瓣后發(fā)酵期細(xì)菌多樣性的研究報(bào)道。

本研究采用MiSeq測(cè)序，對(duì)郫縣豆瓣后發(fā)酵過(guò)程中從入池到發(fā)酵6 a合計(jì)8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行分析，以期揭示郫縣豆瓣不同后發(fā)酵階段的細(xì)菌多樣性，加深對(duì)傳統(tǒng)本土調(diào)味品發(fā)酵機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化改造和食品質(zhì)量安全控制提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品取自郫縣當(dāng)?shù)啬驰h豆瓣生產(chǎn)企業(yè)。選取后發(fā)酵1 周、3 個(gè)月、6 個(gè)月、1、2、3、5、6 a的郫縣豆瓣樣品（共計(jì)8 個(gè)樣品，按發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)短分別編號(hào)為1W、3M、6M、1Y、2Y、3Y、5Y及6Y）。每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的樣品選取同一后發(fā)酵時(shí)間的不同發(fā)酵池進(jìn)行3 次重復(fù)取樣。郫縣豆瓣在后發(fā)酵時(shí)，每隔一定時(shí)間需進(jìn)行攪拌、翻曬，故取樣時(shí)從每個(gè)發(fā)酵池的上層（距表面0～20 cm）、中層（距表面30～50 cm）、下層（距池底0～20 cm）各取25 g左右，混合均勻后密封，低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，于－70 ℃保存?zhèn)溆?。測(cè)序結(jié)果表明來(lái)源于同一批次豆瓣的菌群非常相似（數(shù)據(jù)未列出），所以把同一批次的3 個(gè)重復(fù)樣品的序列合并為一個(gè)數(shù)據(jù)以便進(jìn)行后續(xù)分析。1.2 試劑

土壤DNA提取試劑盒 上海Sangon Biotech公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、16S rRNA通用引物 寶生物工程（大連）有限公司；二代測(cè)序快速DNA建庫(kù)試劑盒美國(guó)Illumina公司。

1.3 儀器與設(shè)備

NanoDrop 2000測(cè)定儀 美國(guó)Thermo公司；臺(tái)式離心機(jī)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國(guó)Eppendorf公司；MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取

豆瓣基因組DNA采用土壤DNA提取試劑盒提取。DNA純度（A260nm/280nm及A260nm/230nm）采用NanoDrop 2000測(cè)定儀測(cè)定。

1.4.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增采用16S rRNA的V4～V5高變區(qū)的通用引物515F（5’-GTGCCAGC MGCCGCGGTAA-3’）和909R（5’-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3’）[17]并在515F引物5’端加不同的barcode。詳細(xì)PCR步驟參考Li Xiangzhen等[18]的方法略作改進(jìn)，PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。

1.4.3 MiSeq測(cè)序

1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，試劑盒回收純化PCR產(chǎn) 物，按等物質(zhì)的量比例混合成測(cè)序文庫(kù)后，用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用QIIME pipeline去除低質(zhì)量原始測(cè)序數(shù)據(jù)，使用Uchime去除嵌合體序列[19]。以16S rRNA序列97%相似度作為操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTUs）的劃分標(biāo)準(zhǔn)。使用QIIME平臺(tái)計(jì)算PD Whole Tree和Chao1多樣性指數(shù)，并進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PcoA）[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 郫縣豆瓣不同后發(fā)酵階段細(xì)菌多樣性分析

表 1 基于97%相似性水平所計(jì)算的多樣性指數(shù)Table 1 Diversity indices calculated based on a cutoff of 97%similarity

測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)軟件拼接、過(guò)濾等處理后，8 個(gè)不同后發(fā)酵階段郫縣樣品平均獲得17 155 條細(xì)菌序列。不同后發(fā)酵階段的樣品細(xì)菌多樣性指數(shù)如表1所示。從表1可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品當(dāng)中的細(xì)菌多樣性總體呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)。但后發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（6 a）的樣品細(xì)菌多樣性最低，與其他后發(fā)酵階段的細(xì)菌多樣性存在明顯差異。

圖 1 豆瓣樣品的稀釋性曲線(xiàn)Fig. 1 Rarefaction curves for Pixian soybean paste samples

樣品稀釋曲線(xiàn)圖1，也與表2情況類(lèi)似，其曲線(xiàn)在小于6 000 條序列時(shí)OTU）數(shù)量隨樣品序列數(shù)的增加迅速變化，在大于14 000 條序列后OTU數(shù)量變化逐漸趨于平緩，這說(shuō)明本測(cè)序深度條件下已覆蓋了8 個(gè)樣本中絕大部分的測(cè)序數(shù)據(jù)，能夠較為全面地反映郫縣豆瓣后發(fā)酵階段的細(xì)菌多樣性變化情況。

群落生態(tài)學(xué)可通過(guò)樣品的OTU和Chao1來(lái)反映微生物群落的豐度和多樣性。產(chǎn)業(yè)界通常將后發(fā)酵6 月以上的郫縣豆瓣視為成熟，但是為保障產(chǎn)品的均一性，出廠(chǎng)前還會(huì)將不同后發(fā)酵期的豆瓣進(jìn)行混合。若將業(yè)界普遍公認(rèn)后發(fā)酵期6 個(gè)月至2 a的郫縣豆瓣作為成熟樣本計(jì)算，本研究通過(guò)MiSeq測(cè)序獲得的平均序列數(shù)和劃分的OTU均顯著高于韓國(guó)辣醬[15]和韓國(guó)泡菜[13]（平均序列數(shù)分別為15 733、1 606、2 656 條，OTU分別為781、144、121），這說(shuō)明本土郫縣豆瓣細(xì)菌的豐富度和多樣性均較 高。

郫縣豆瓣后發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌的多樣性是 特有的區(qū)域環(huán)境條件、霉瓣子制曲工藝、自然接種過(guò)程（“日曬夜露”工藝）與發(fā)酵坯高鹽含量（鹽 含量大于15%）之間強(qiáng)烈選擇和協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品郫縣豆瓣的主產(chǎn)區(qū)郫縣，在川西平原腹心地帶，屬盆地中亞熱帶濕潤(rùn)氣候，年均氣溫15.7 ℃，相對(duì)濕度70%，年降雨量960 mm，多集中在5～9 月，全年無(wú)霜期282 d，平均日照1 286.9 h[21]，該條件為微生物菌群的生存提供了極好的環(huán)境，使細(xì)菌群落豐富性和多樣性極高，造就了郫縣豆瓣獨(dú)特的外觀(guān)品質(zhì)和內(nèi)在風(fēng)味。

2.2 郫縣豆瓣后發(fā)酵期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

對(duì)不同后發(fā)酵階段郫縣豆瓣的8 個(gè)樣品中的細(xì)菌群落，利用Illumina雙末端高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)不同樣品中共有57 個(gè)門(mén)類(lèi)群、174 個(gè)綱類(lèi)群、321 個(gè)目類(lèi)群、535 個(gè)科類(lèi)群、921 個(gè)屬類(lèi)群。

圖 2 門(mén)水平下郫縣豆瓣細(xì)菌群落變化Fig. 2 Changes in bacteria l community in Pixian soybean paste during fermentation at phylum level

如圖2所示，細(xì) 菌群落中門(mén)水平平均含量大于1%的是變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、藍(lán)藻門(mén)（Cyanobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacter oidetes）、泉古菌門(mén)（Crenarchaeota）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）和廣古菌門(mén)（Euryarchaeota），分別平均占總細(xì)菌數(shù)的46.15%、32.22%、4.12%、3.97%、2.86%、2.41%、2.28%和1.11%。發(fā)酵前期主要是厚壁菌門(mén)，而發(fā)酵后期主要是變形菌門(mén)。

圖 3 綱水平下郫縣豆瓣細(xì)菌群落變化Fig. 3 Changes in bacterial community in Pixian soybean paste during fermentation at class level

如圖3所示，綱水平平均含量大于1%的分別是隸屬變形菌門(mén)的γ-變形菌綱（Gamma Proteobacteria）、α-變形菌綱（Alpha Proteobacteria）和β-變形菌綱（Beta Proteobacteria），分別占總細(xì)菌群數(shù)的26.77%、15.59%和2.82%；隸屬厚壁菌門(mén)的芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia），分別平均占總菌群數(shù)的19.99%和12.18%；隸屬藍(lán)藻門(mén)的Chloroplast，占4.05%；隸屬泉古菌門(mén)的奇古菌綱（Thaumarchaeota），占1.83%；隸屬擬桿菌門(mén)的擬桿菌綱（Bacteroidia），占1.81%；隸屬放線(xiàn)菌門(mén)的放線(xiàn)菌綱（Actinobacteria）占1.60%；隸屬綠彎菌門(mén)的厭氧繩菌綱（Anaerolineae），占1.05%。隨著后發(fā)酵的進(jìn)行，γ-變形菌綱、Chloroplast、厭氧繩菌綱逐漸變少，α-變形菌綱、芽孢桿菌綱、梭菌綱、β-變形菌綱、奇古菌綱、擬桿菌綱出現(xiàn)先增多后減少，其峰值大多出現(xiàn)在后發(fā)酵1～2 a。

圖 4 目水平下郫縣豆瓣細(xì)菌群落變化Fig. 4 Changes in bacterial community in Pixian soybean paste during fermentation at order level

如圖4所示，目水平平均含量大于1%的分別有腸桿菌目（Enterobacteriales）20.04%、芽孢桿菌目（Bacillales）14.12%、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）13.56%、梭菌目（Clostridiales）11.78%、乳桿菌目（Lactobacillales）5.23%、鏈形菌目（Streptophyta）3.98%、假單胞菌目（Pseudomonadales）2.46%、伯克氏菌目（Burkholderiales）2.37%、 海洋螺菌目（Oceanospirillales）2.31%、擬桿菌目（Bacteroidales）1.81%、亞硝基球形菌目（Nitrososphaerales）1.78%、放線(xiàn)菌目（Actinomycetales）1.53%和根瘤菌目（Rhizobiales）1.08%。隨著后發(fā)酵的進(jìn)行，腸桿菌目、鏈形菌目均逐漸變少，芽孢桿菌目、鞘脂單胞菌目、梭菌目、乳桿菌目、伯克氏菌目、海洋螺菌目均出現(xiàn)先增多后減小，其中芽孢桿菌目、乳桿菌目、海洋螺菌目的峰值出現(xiàn)在后發(fā)酵3 個(gè)月，而鞘脂單胞菌目、梭菌目和伯克氏菌目的峰值出現(xiàn)在1～3 a。

圖 5 科水平下郫縣豆瓣細(xì)菌群落變化Fig. 5 Changes in bacterial community in Pixian soybean p aste during fermentation at family level

如圖5所示，科水平平均含量大于1%分別有腸桿菌科（Enterobacteriaceae）20.04%、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）13.48%、芽孢桿菌科（Bacillaceae）9.13%、梭菌科（Clostridiaceae）6.91%、鏈形菌科（Streptophyta）3.98%、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）3.48%、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）2.68%、桿狀鹽單胞菌科（Halomonadaceae）2.28%、明串珠菌科（Leuconostocaceae）2.19%、乳桿菌科（Lactobacillaceae）2.06%、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）1.87%、亞硝基球形菌科（Nitrososphaeraceae）1.78%、產(chǎn)堿菌科（Alcaligenaceae）1.03%和草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）1.02%。

Nam等[15]利用高通量測(cè)序技術(shù)研究韓國(guó)辣醬發(fā)現(xiàn)了與以往報(bào)道不一致的結(jié)果，以往認(rèn)為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是韓國(guó)辣椒發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)微生物，但該研究認(rèn)為芽孢桿菌屬（Bacillus species）的微生物在韓國(guó)中心區(qū)域生產(chǎn)的辣醬當(dāng)中是優(yōu)勢(shì)微生物，而其他區(qū)域生產(chǎn)的辣醬當(dāng)中乳酸菌（Lactic acid）才是優(yōu)勢(shì)微生物。Park等[13]利用焦磷酸測(cè)序分析泡菜發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落的演替情況，發(fā)現(xiàn)人工接種和自然發(fā)酵的泡菜細(xì)菌群落在發(fā)酵初期存在差異，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行差異越來(lái)越小，發(fā)酵末期幾乎沒(méi)有明顯差異；造成泡菜當(dāng)中細(xì)菌群落的差異主要原因是生產(chǎn)工藝、泡菜種類(lèi)不同。鄒艷玲[22]利用16S rRNA基因文庫(kù)技術(shù)從后發(fā)酵期的郫縣豆瓣中共得到了102 個(gè)克隆子，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌科、葡萄球菌科和腸桿菌科是主要細(xì)菌。張琦等[6]利用PCR-DGGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)郫縣豆瓣后發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為乳酸菌，魏斯氏菌屬的Weissella confusa和乳酸菌屬的Lactobacillus lactis是發(fā)酵初期的優(yōu)勢(shì)菌，而發(fā)酵后期優(yōu)勢(shì)菌則為乳酸菌屬的Lactobacillus namurensis。趙輝平等[23]應(yīng)用純培養(yǎng)方法和16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析郫縣豆瓣中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性，從所得的209 株純培養(yǎng)細(xì)菌中篩選出35 株典型菌株，共包含8 個(gè)屬，其中Bacillus是優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。張大鳳等[24]將釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳桿菌和耐鹽四聯(lián)球菌共培養(yǎng)制成復(fù)合微生物菌劑用于郫縣豆瓣后熟發(fā)酵，顯著提高了產(chǎn)品品質(zhì)。

本研究結(jié)果表明隨著郫縣豆瓣后發(fā)酵的進(jìn)行，腸桿菌科和鏈形菌科持續(xù)減少，而鞘脂單胞菌科、芽孢桿菌科、梭菌科和消化鏈球菌科則出現(xiàn)先增加后減少的情況，其峰值大多出現(xiàn)在1～3 a。值得注意的是，后發(fā)酵時(shí)間6 a的郫縣豆瓣細(xì)菌群落與其他樣品呈現(xiàn)明顯差異，其多樣性較小，細(xì)菌群落主要集中于腸桿菌科（89.31%）。鑒于郫縣豆瓣后發(fā)酵期細(xì)菌變化研究報(bào)道較少的現(xiàn)狀，本研究結(jié)果與以往研究結(jié)果存在較大差異，可能因?yàn)檑h豆瓣后發(fā)酵期的細(xì)菌群落組成與發(fā)酵管理、取樣季節(jié)、原料來(lái)源、組成配比、所在區(qū)域均具有密切關(guān)系。以往研究由于樣品采集（采集季節(jié)差異和產(chǎn)地差異）、研究方法（分離純化與免培養(yǎng)）等差異造成了不一致，還需要長(zhǎng)期追蹤并積累細(xì)菌演替變化的數(shù)據(jù)，以期進(jìn)一步認(rèn)識(shí)郫縣豆瓣后發(fā)酵過(guò)程當(dāng)中細(xì)菌群落組成差異的原因。

已有研究結(jié)果，無(wú)論是取樣追蹤的時(shí)間跨度，還是所得微生物菌群數(shù)據(jù)豐富程度，以及確定優(yōu)勢(shì)菌群的全面性，與本結(jié)果相比都具有一定局限。這說(shuō)明HTS技術(shù)可以快速、高效地對(duì)郫縣豆瓣中細(xì)菌結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確的分析，尤其是為揭示其一些功能作用的機(jī)制提供了新的研究方法。陳玲等[9]利用16S rDNA克隆文庫(kù)法與高通量測(cè)序法在濃香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析對(duì)比研究過(guò)程中，也得出了與本研究類(lèi)似的結(jié)論。

但是，該技術(shù)仍有一定的不足，盡管該技術(shù)可以提供海量的數(shù)據(jù)，但質(zhì)量有待提高， 而且存在序列讀長(zhǎng)；另外，由于所得測(cè)序數(shù)據(jù)量巨大，經(jīng)軟件拼接、過(guò)濾等處理后，難免出現(xiàn)冗余數(shù)據(jù)和有效數(shù)據(jù)丟失的情況[25]。因此，還需要結(jié)合宏蛋白質(zhì)組學(xué)、風(fēng)味物質(zhì)分析等其他技術(shù)，才能夠更加全面地分析發(fā)酵食品中微生物的作用機(jī)制以及提升傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化水平。

2.3 郫縣豆瓣后發(fā)酵期細(xì)菌演替主坐標(biāo)分析

由于不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣細(xì)菌群落構(gòu)成復(fù)雜，差異較大。為反映長(zhǎng)達(dá)6 a的郫縣豆瓣后發(fā)酵“日曬夜露”過(guò)程中細(xì)菌群落的演替變化情況，本實(shí)驗(yàn)組對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了基于unweighted unifrac的PcoA，既考慮細(xì)菌序列在后發(fā)酵期間的群落中出現(xiàn)過(guò)程，也考慮該相關(guān)序列的豐度變化[26]。具體的說(shuō)，先根據(jù)最大近似法使用FastTree構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，再利用Fastunifrac分析得到樣品間距離矩陣，結(jié)果如圖6所示 。

圖 6 主坐標(biāo)分析結(jié)果Fig. 6 Result of principal coordinate analysis

由圖6可知，后發(fā)酵時(shí)間 對(duì)郫縣豆瓣的細(xì)菌群落組成具有重要影響，大致可以分為3 個(gè)變化階段，即是前3 個(gè)月、發(fā)酵6 個(gè)月至5 a和發(fā)酵6 a。同時(shí)，第2變化階段又可以被分為2 個(gè)過(guò)程，即是發(fā)酵6 個(gè)月至1 a間的細(xì)菌群落，相比發(fā)酵2～5 a第1個(gè)階段細(xì)菌群落多樣性和豐度也存在明顯差異。

目前，業(yè)內(nèi)有一種片面的認(rèn)識(shí)：認(rèn)為后熟周期越長(zhǎng)越好。因此 常出現(xiàn)由于銷(xiāo)售制約而無(wú)限期延長(zhǎng)后發(fā)酵周期的現(xiàn)狀。已有學(xué)者指出，在現(xiàn)有的發(fā)酵條件下，后熟完成后，各種有效成分將會(huì)從高峰降至低谷，綜合成分整體劣變，同時(shí)衛(wèi)生指標(biāo)和理化指標(biāo)也會(huì)相應(yīng)降低，因此應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵周期為6 個(gè)月至1 a[1]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)后發(fā)酵期6 個(gè)月至5 a的郫縣豆瓣細(xì)菌群落演替變化相較于其他階段變化較小，為該觀(guān)點(diǎn)從微生物角度提供了一定理論支撐。

3 結(jié) 論

本研究利用HTS高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)郫縣豆瓣后發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌群落進(jìn)行了分析研究，結(jié)果表明該技術(shù)可以較為有效、全面地評(píng)價(jià)郫縣豆瓣中的細(xì)菌群落。本研究豐富了對(duì)傳統(tǒng)本土調(diào)味品-郫縣豆瓣中細(xì)菌的認(rèn)識(shí)，細(xì)菌群落的多樣性和豐度均顯著高于同屬東亞國(guó)家的韓國(guó)泡菜、辣醬等傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品。發(fā)酵時(shí)間對(duì)郫縣豆瓣后發(fā)酵期的細(xì)菌群落組成有重要影響，無(wú)限期延長(zhǎng)后發(fā)酵周期會(huì)帶來(lái)微生物群落豐度和多樣性的迅速降低。

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Bacterial Community Analysis of Pixian Soybean Paste during Post-Fermentation by High-Throughput Sequencing

ZHAO Hongyu1, XU Weizhen1, YANG Guohua2, LIU Yuanfu3, YUE Peng2, ZHANG Liang1,*
(1. Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan Province, School of Food and Bioengineering , Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Soybean Paste Brewing Technology and Engineering Laboratory of Sichuan Province, Sichuan Dandan Pixian Soybean Paste Co. Ltd., Chengdu 611732, China; 3. Sichuan Youlian Condiment Food Co. Ltd., Chengdu 611732, China)

This study was undertaken to analyze the microbial communities in Pixian soybean paste during the postfermentation process by high-throughput sequencing method. The results revealed that at the taxonomic levels of microbes including phylum, class, order, family, and genus, high-throughput sequencing could detect a total of 57 phyla, 174 classes, 321 orders, 535 families and 921 genera. Post-fermentation time had a significant effect on the bacterial community composition of Pixian soybean paste. During post-fermentation, the quantities of Enterobacteriaceae and Streptophyta continued to decrease whereas Sphingomonadaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae and Peptostreptococcaceae increased first and then decreased, most of which reached their peak values during 1 to 3 years. However, after 6 years of fermentation, the bacterial community of Pixian soybean paste was significantly lower than that of other samples. With this method, a large number of non-cultureable bacteria and unclassified bacteria were detected. The re sults of bacterial diversity analysis were close to the microecology of the samples, which were helpful to better understand the bacterial diversity of Pixian soybean paste and might provide a scientific support for the modernization of the traditional industry and the control of food quality and safety.

Pixian soybean paste; bacterial community; high-throughput sequencing

10.7506/spkx1002-6630-201710020

Q933

A

1002-6630（2017）10-0117-06

2016-08-02

四川省戰(zhàn)略性新興新產(chǎn)品重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2015GZX0021）；四川省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2016NZ0093）；成都市科技惠民技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目（2015-HM01-00003-SF）；成都市農(nóng)業(yè)技術(shù)成果應(yīng)用示范項(xiàng)目（2015-NY01-00001-NC）；成都市農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目（2015-NY02-00097-NC）；成都市產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（2015-YF04-00047-JH）；西華大學(xué)食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目（川教2006-313）

趙紅宇（1992—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：redrain.z@foxmail.com

*通信作者：張良（1982—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zhang-liang@foxmail.com

趙紅宇, 徐煒楨, 楊國(guó)華, 等. 基于高通量測(cè)序的郫縣豆瓣后發(fā)酵期細(xì)菌多樣性研究[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 117-122. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710020. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Hongyu, XU Weizhen, YANG Guohua, et al. Bacterial community analysis of pixian soybean paste during postfermentation by high-throughput sequencing[J]. Food Science, 2017, 38(10): 117-122. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710020. http://w ww.spkx.net.cn