桑葉中α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離鑒定及誘變選育

朱孟峰，許 偉，邵 榮，韋 萍

桑葉中α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離鑒定及誘變選育

朱孟峰1,2,3，許 偉2,3,*，邵 榮2,3，韋 萍1,*

（1.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051；3.江蘇省海洋灘涂生物化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鹽城 224051）

從桑葉中篩選出一株糖尿病潛在治療藥物（α-葡萄糖苷酶抑制劑）產(chǎn)生菌，為進(jìn)一步提高抑制劑量，采用常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）技術(shù)進(jìn)行了誘變育種，并初步研究其理化性質(zhì)及穩(wěn)定性。在分離得到的188 株桑葉內(nèi)生菌中，以4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）法篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，篩選到一株細(xì)菌XuW-LB-188，其發(fā)酵上清液對α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)52.67%。根據(jù)菌株形態(tài)特性及16S rDNA序列，初步鑒定為萎縮芽孢桿菌。對此菌株進(jìn)行ARTP誘變，高通量篩選880 株突變株，其中突變株T-690抑制活性較出發(fā)菌株提高了40.61%，抑制率高達(dá)73.25%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該α-葡萄糖苷酶抑制劑主要存在于發(fā)酵液中，是一種極性較大的水溶性胞外產(chǎn)物，且具有良好的熱穩(wěn)定性。

α-葡萄糖苷酶抑制劑；桑葉；內(nèi)生菌；篩選；常壓室溫等離子體誘變；萎縮芽孢桿菌

α-葡萄糖苷酶抑制劑[1]是一類用于治療Ⅱ型糖尿病的口服降糖藥物，其通過可逆性地與小腸刷狀絨毛上的α-葡萄糖苷酶結(jié)合，從而減緩雙糖和寡糖的分解吸收，進(jìn)而降低餐后高血糖，作用溫和、毒副作用小。阿卡波糖和米格列醇為已上市的2 種α-葡萄糖苷酶抑制劑，前者來源于游動(dòng)放線菌（Actinopanes sp.）[2]，后者也存在于淺紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）[3]發(fā)酵液。從早期短葉紅豆杉中分離出產(chǎn)紫杉醇的共生菌[4]，到近期從長春花中分離出產(chǎn)長春堿的共生菌[5]，證明某些內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物具有與宿主植物相同或相似的活性結(jié)構(gòu)及功能。桑葉、桑白皮等作為傳統(tǒng)中藥，具有良好的降血糖功能[6]，鄭麗屏等[7]就從桑樹中分離出一株內(nèi)生真菌，對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性。

微生物是α-葡萄糖苷酶抑制劑較為理想有效的來源，菌種的誘變選育則是改良菌種的重要手段之一。其中，基于大氣壓射頻輝光放電的常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）菌種選育技術(shù)，具有條件溫和、安全性高、操作簡單、誘變迅速、突變率高等特點(diǎn)[8-9]，獲得普遍認(rèn)可和廣泛應(yīng)用。其產(chǎn)生的中能活性粒子不僅可直接改變核苷酸水平的分子結(jié)構(gòu)[10]，還可通過作用于細(xì)胞而間接影響胞內(nèi)遺傳物質(zhì)[11]，阿維菌素[12]、奧利萬星中間體[13]等產(chǎn)生菌經(jīng)ARTP誘變后，產(chǎn)量均大幅提高。本實(shí)驗(yàn)以桑葉為材料，進(jìn)行產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑菌株的分離與鑒定，對篩選到的菌株進(jìn)行ARTP誘變以提高抑制劑產(chǎn)量，并對抑制劑理化性質(zhì)進(jìn)行初步分析，同時(shí)為α-葡萄糖苷酶抑制劑的發(fā)酵條件優(yōu)化及分離純化提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮桑葉采自江蘇、浙江、安徽、云南、廣東等13 省，包括野生桑葉及種植桑葉，共計(jì)41 份樣品。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

酵母粉、蛋白胨 英國Oxoid公司；α-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20，來源于釀酒酵母） 美國Sigma-Aldrich公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG） 上海晶純生化科技股份有限公司。

0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：NaCl 8.00 g/L、KCl 0.20 g/L、Na2HPO41.44 g/L、KH2PO40.24 g/L，調(diào)pH 7.2；甘油-氯化鈉溶液：每升含甘油50 mL、NaCl 8.00 g。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5.00 g、蛋白胨10.00 g、NaCl 10.00 g、蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 7.0～7.2，固體培養(yǎng)基時(shí)加入瓊脂15.00～18.00 g；馬鈴薯-蔗糖培養(yǎng)基：馬鈴薯200.00 g、蔗糖20.00 g、蒸餾水1 000 mL，自然pH值，固體培養(yǎng)基時(shí)加入瓊脂15.00～18.00 g。所有培養(yǎng)基及溶液均121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1D超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；MLS-3751全自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司；JY92-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技福分有限公司；SpecraMax 190酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；Allegra X-30R高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；PB-10酸度計(jì) 德國Sartorius公司；常壓室溫等離子體育種機(jī)無錫思清源生物科技公司；旋渦混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；24深孔板 常州英德生物科技有限公司；250D培養(yǎng)箱 國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)生菌的分離

取桑樹的莖、葉組織，用自來水反復(fù)沖洗至表面無異物，擦干并用無菌水清洗3 次，在75%酒精中浸泡3～5 min，將其取出轉(zhuǎn)入到體積分?jǐn)?shù)為3%的次氯酸鈉溶液中浸泡5 min，無菌水沖洗3 次，備用。

將處理后的桑葉放入無菌研缽中，加PBS研磨，上清液梯度稀釋后涂布于LB和馬鈴薯-蔗糖平板，重復(fù)3 次，分別置于35 ℃和28 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)48 h。其中LB平板用于內(nèi)生細(xì)菌的分離，馬鈴薯-蔗糖平板用于內(nèi)生真菌的分離。最后一次沖洗的無菌水也進(jìn)行上述操作，用于表面無菌的驗(yàn)證[14]。

1.3.2 菌落純化及發(fā)酵培養(yǎng)

通過平板劃線進(jìn)一步純化菌落，挑取純化后單菌落接入LB或馬鈴薯-蔗糖液體培養(yǎng)基中（250 mL錐形瓶內(nèi)含50 mL培養(yǎng)基），分別于35 ℃和28 ℃搖床中100 r/min培養(yǎng)48 h。

1.3.3 菌體胞內(nèi)及胞外產(chǎn)物提取

搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，4 ℃、12 000 r/min離 心10 min，分成上清液及菌絲體，上清液即為微生物胞外產(chǎn)物，冷凍保存，用于α-葡萄糖苷酶抑制活性測定。收集菌體沉淀，用PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）洗滌3 次后，制成菌懸液，于冰水浴中超聲波破碎[15]，將破碎液4 ℃、12 000 r/min離心10 min，所得上清液即為微生物胞內(nèi)提取物，冷凍保存，用于α-葡萄糖苷酶抑制活性測定。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

以PNPG法[16]篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑是一種快速經(jīng)典有效的篩選方法。該方法基于PNPG在α-葡萄糖苷酶催化下生成具有特定光吸收的對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）這一反應(yīng)，其吸光度的變化可用于酶活力及抑制劑活力測試。

具體操作步驟[17]：在96 孔酶標(biāo)板中加入10 μL，1 U/mL（酶活力定義：pH 6.8，37 ℃條件下1 min內(nèi)生成1 μmol葡萄糖的酶量）α-葡萄糖苷酶（緩沖溶液溶解），80 μL，0.1 mol/L磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀（pH 6.8），20 μL測試樣品（陰性對照孔加入空白培養(yǎng)基），37 ℃保溫10 min后，加入40 μL，2 mg/mL PNPG，用酶標(biāo)儀于405 nm波長處分別測定反應(yīng)零時(shí)間OD值（OD1）與反應(yīng)20 min后的OD值（OD2）。抑制率根據(jù)公式（1）計(jì)算。

1.3.5 菌種鑒定

依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[18]與《真菌鑒定手冊》[19]，通過菌落形態(tài)及簡單染色對微生物進(jìn)行初步分類。對篩選出的高抑制率菌株，以引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，以NS1（5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’）、NS8（5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’）擴(kuò)增真菌18S rDNA，克隆測序后，利用GenBank基因數(shù)據(jù)庫的BLAST進(jìn)行序列同源性比較分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.6 ARTP誘變操作

菌懸液的制備：取1 mL對數(shù)生長期的出發(fā)菌株培養(yǎng)液，8 000 r/min離心10 min，棄上清液 ，用無菌PBS洗滌2 次以去除培養(yǎng)基，最后菌體重懸于甘油-氯化鈉溶液中，細(xì)胞終濃度為106～107CFU/mL，用于ARTP處理。

ARTP處理預(yù)實(shí)驗(yàn)[20]：為保證突變的有效性，放電射流區(qū)溫度不應(yīng)高于40 ℃，輸出功率、輻照距離、氣流量等參數(shù)設(shè)定一般推薦為120 W、2 mm、10 L/min[8]。按上述參數(shù)處理樣品載片，分別考察輻照時(shí)間0（對照）、10、20、30、40、50、60 s對細(xì)菌致死率的影響，每個(gè)時(shí)間梯度進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。處理過的樣品稀釋涂平板，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，根據(jù)公式（2）計(jì)算致死率，并獲得致死率曲線。

ARTP具體操作：取10 μL菌懸液均勻涂于無菌樣品載片，在設(shè)定的系統(tǒng)參數(shù)及選取的處理時(shí)間下進(jìn)行樣品誘變，樣品處理完畢后，用無菌鑷子將載片放至裝有1 mL無菌PBS的EP管中。充分振蕩，使附著在菌物載片上的微生物洗脫至液體中，形成新的菌懸液。對新的菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后涂布，35 ℃條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.7 高通量篩選方法

24深孔板培養(yǎng)結(jié)合96 孔酶標(biāo)板抑制率檢測可實(shí)現(xiàn)突變菌株的高通量篩選。根據(jù)菌落生長的大小和豐度，用無菌牙簽挑取單菌落接種于裝有培養(yǎng)基的24深孔板（2 mL/孔），35 ℃、100 r/min培養(yǎng)48 h。菌液一部分用于菌種保藏，另一部分8 000 r/min離心10 min，取上清液，測定α-葡萄糖苷酶抑制率，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 突變株遺傳穩(wěn)定性分析

將經(jīng)過篩選得到的正突變幅度最大（抑制活性最高） 的菌株接種至固體培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)10 代，并將各代菌體分別接種于液體培養(yǎng)基中，35 ℃、100 r/min培養(yǎng)72 h，測其抑制活性，檢測所選突變株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.9 活性物質(zhì)的早期鑒定

活性成分在發(fā)酵液中的分布：分別測定胞內(nèi)產(chǎn)物及發(fā)酵上清液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

熱穩(wěn)定性測試：取發(fā)酵上清液50 mL分裝于5 支試管（50 mL）中，于沸水浴中分別保溫5、10、30、60、120 min，冷卻后用蒸餾水補(bǔ)至原體積，測定原始發(fā)酵液及沸水浴不同時(shí)間后的發(fā)酵液活性，重復(fù)測定3 次。

活性物質(zhì)的極性測試[17]：取4 支試管，每管裝入5 mL發(fā)酵上清液，分別加入5 mL的正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚，多次混勻充分萃取。以原始發(fā)酵上清液為對照，分別檢測各管水相的抑制活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離

通過對13 個(gè)省41 份桑葉樣品進(jìn)行篩選，總計(jì)獲得共生菌189 株，初步鑒定細(xì)菌143 株，真菌46 株，經(jīng)純化后，分別保存于固體斜面。植物中一般都有共生菌的存在，無論是內(nèi)生真菌還是內(nèi)生細(xì)菌，多能使植物獲益，如內(nèi)生固氮、植物促生長和生物防治等作用[21]。此外，越來越多的功能性次級(jí)代謝產(chǎn)物從內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)并得以利用[22]。

2.2 產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑內(nèi)生菌的篩選

圖 1 抑制率分布圖Fig. 1 Distribution of α-glucosidase inhibitory activity of 189 isolates

經(jīng)過對189 株微生物胞外產(chǎn)物及胞內(nèi)提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行測試，抑制率小于10%的共157 株，抑制率為10%～30%的共27 株，抑制率為30%～50%的共4 株，分別為XuW-PSA-06、XuWLB-76、XuW-LB-79（胞內(nèi)）、XuW-LB-91，另有一株共生菌XuW-LB-188發(fā)酵液抑制率高達(dá)52.67%。共生菌抑制率分布情況如圖1所示。本實(shí)驗(yàn)中，抑制α-葡萄糖苷酶活性物質(zhì)多富集于胞外，胞內(nèi)提取物一般無抑制活性，即便有也較低。這與已報(bào)道的產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑微生物中，所產(chǎn)抑制劑多為胞外次級(jí)代謝產(chǎn)物相符[23-25]。

2.3 XuW-LB-188菌落及形態(tài)觀察

圖 2 XuW-LB-188菌落形態(tài)（A～C）、革蘭氏染色（D）及芽孢染色（E）Fig. 2 Colony, Gram staining and spore staining of strain XuW-LB-188

如圖2所示，LB平板上接種XuW-LB-188，35 ℃培養(yǎng)12 h即可見明顯菌落，菌落圓形、不透明、光滑、濕潤，24 h后菌落呈不規(guī)格圓形、乳白色、形成褶皺，48 h后菌落密集處開始產(chǎn)生棕褐色色素，與萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）[26]菌落形態(tài)十分相近。經(jīng)鑒定，XuW-LB-188為革蘭氏陽性菌，細(xì)胞呈桿狀，芽孢呈橢圓形。

2.4 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹

圖 3 XuW-LB-188菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3 PCR amplification of 16S rDNA gene of strain XuW-LB-188

圖 4 XuW-LB-188菌株基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree for strain XuW-LB-188 based on 16S rDNA sequence

以引物27F、1492R，擴(kuò)增16S rDNA全序列，獲得一條1 392 bp的DNA片段，條帶清晰、與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符（圖3）。在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果表明XuW-LB-188與萎縮芽孢桿菌同屬于一個(gè)分支，初步確定XuW-LB-188為萎縮芽孢桿菌。產(chǎn)α-葡萄萄糖苷酶抑制劑的微生物種屬分布較廣，現(xiàn)已報(bào)道的包括曲霉（Aspergillus terreus）[24]、青霉（ Penicillium citreonigrum）[27]、鏈霉菌屬（Streptomyces）[28]、乳酸菌屬（Lactobacillus）[23]、芽孢桿菌屬（Bacillus）[29-30]等。

2.5 ARTP誘變選育

2.5.1 ARTP致死率曲線測定

圖 5 ARTP誘變致死率曲線Fig. 5 Mortality rate curve from ARTP mutation

根據(jù)1.3.6節(jié)中方法測試并繪制致死率曲線，如圖5所示。ARTP照射時(shí)間與XuW-LB-188的致死率存在著明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，與王興吉等[31]誘變枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的致死率曲線相近。在0～30 s，致死率隨照射時(shí)間迅速上升至90%，30 s后，致死率隨照射時(shí)間緩慢升高，50 s后致死率高達(dá)99%以上。有報(bào)道稱[32]較高致死率可提高突變及正突變比例，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)誘變處理時(shí)間選用50 s。

2.5.2 誘變菌株的篩選

圖 6 正突變株及原始菌株抑制活性Fig. 6 α-Glucosidase inhibitory activity of the original and positive mutant strains

以篩選出抑制活性最高的XuW-LB-188為出發(fā)菌株，在輸出功率120 W、輻照距離2 mm、氣流量10 L/min、載樣量10 μL、輻照時(shí)間50 s的條件下，利用24深孔板培養(yǎng)聯(lián)合96 孔酶標(biāo)板檢測，實(shí)現(xiàn)了誘變菌種的高通量篩選。每次實(shí)驗(yàn)篩選88 株突變菌（共4 板，每板設(shè)1 孔接種原始菌種作為對照，1 孔未接種作為空白），先后進(jìn)行10 次實(shí)驗(yàn)，篩選突變菌株880 株，正突變菌株26 株。選取10 株正突變量較高的菌株示于圖6，其中T-690突變株抑制率高達(dá)73.25%，相較于出發(fā)菌株提高了40.61%，說明ARTP誘變對于提高菌株α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)量具有較好的效果。

近年來，科研工作者以PNPG法獲得了一批潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)生菌。此法中以抑制率作為前期篩選及優(yōu)化的參考指標(biāo)行之有效，操作簡單快捷。本實(shí)驗(yàn)中，突變株T-690抑制活性遠(yuǎn)高于枯草芽孢桿菌B2[29]，與萎縮芽孢桿菌S-J-X-4[14]相當(dāng)。

圖 7 T-690遺傳穩(wěn)定性Fig. 7 Genetic stability of strain T-690

2.6 突變菌遺傳穩(wěn)定性研究對突變菌株T-690進(jìn)行固體平板10 次傳代培養(yǎng)，并測試每代的抑制活性，由圖7可知，發(fā)酵上清液對α-葡萄糖苷酶的抑制率變化甚微，說明突變株T-690遺傳穩(wěn)定性良好，活性物質(zhì)產(chǎn)量穩(wěn)定。突變株T-690的高抑制活性及遺傳穩(wěn)定性，為后續(xù)α-葡萄糖苷酶抑制劑的工業(yè)發(fā)酵及分離提供了優(yōu)良的菌種。

2.7 活性物質(zhì)初步分析

圖 8 沸水浴處理時(shí)間對抑制率的影響Fig. 8 Effect of boiling water bath treatment time on α-glucosidase inhibitory activity

胞內(nèi)產(chǎn)物及發(fā)酵上清液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性分別為2.10%和72.83%，說明抑制劑主要存在于發(fā)酵上清液中，為一種胞外產(chǎn)物。發(fā)酵上清液經(jīng)不同時(shí)間熱處理后，抑制率變化如圖8所示。隨著沸水浴時(shí)間的延長，抑制活性變化幅度較小。由此可知，發(fā)酵液中活性組分具有良好的熱穩(wěn)定性，同時(shí)說明此物質(zhì)為非蛋白質(zhì)等易熱變性的組分。在后期分離過程中，可通過熱處理去除發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，也可通過減壓蒸餾的方式進(jìn)行濃縮。

選用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等不同極性的有機(jī)溶劑對發(fā)酵上清液中的活性物質(zhì)進(jìn)行萃取分離，發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)仍主要保留在水相中。結(jié)果表明，潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑是一種極性較大的胞外產(chǎn)物。已知極性對于分離純化有著重要意義，有助于分離方法的選擇及分離方案的設(shè)計(jì)。

桑葉中已知具有降糖活性的物質(zhì)包括黃酮（蕓香苷、槲皮素等）、多糖、生物堿（1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）、N-甲基-1-DNJ等）等[33]，根據(jù)內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物和宿主植物次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及活性的相似性，以及其極性和熱穩(wěn)定性推斷，T-690所產(chǎn)活性物質(zhì)很有可能為DNJ或其結(jié)構(gòu)類似物。

3 結(jié) 論

從13 個(gè)省41 份桑葉樣品中，總計(jì)獲得共生菌189 株，以PNPG法篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，其中XuWLB-188發(fā)酵上清液抑制率高達(dá)52.67%，是一株具有潛在藥用價(jià)值的微生物。16S rDNA序列分析結(jié)果表明，該菌株為萎縮芽孢桿菌。

以XuW-LB-188為出發(fā)菌株，通過ARTP誘變實(shí)驗(yàn)，繪制致死率曲線并確定了最佳誘變時(shí)間為50 s。高通量篩選880 株突變菌株，共獲得26 株正突變菌株，其中突變株T-690抑制率最高，為73.25%，相較于出發(fā)菌株提高了40.61%。同時(shí)，10 次傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其遺傳穩(wěn)定性。

α-葡萄糖苷酶抑制劑分布、熱穩(wěn)定性及極性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：活性物質(zhì)為胞外產(chǎn)物，主要存在于發(fā)酵液中，具有很好的熱穩(wěn)定性，是一種極性較大的水溶性物質(zhì)。

后續(xù)研究工作將對此活性物質(zhì)進(jìn)行分離提純及結(jié)構(gòu)鑒定，并利用響應(yīng)面方法優(yōu)化菌株T-690的發(fā)酵條件，以期提高抑制劑的產(chǎn)量。

[1] RITHOLZ M D, BEVERLY E A, WEINGER K. Digging deeper: the role of qualitative research in behavioral diabetes[J]. Current Diabetes Reports, 2011, 11(6): 494-502. DOI:10.1007/s11892-011-0226-7.

[2] CAMPBELL R K, CAMPBELL L K, WHITE J R. Insulin lispro: its role in the treatment of diabetes mellitus[J]. Annals of Pharmacotherapy, 1996, 30(11): 1263-1271. DOI:10.1177/106002809603001111.

[3] BALITZ D M, BUSH J A, BRADNER W T, et al. Isolation of lavendamycin, a new antibiotic from Streptomyces lavendulae[J]. The Journal of Antibiotics, 1982, 35(3): 259-265. DOI:10.7164/ antibiotics.35.259.

[4] STIERLE A, STROBEL G, STIERLE D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science, 1993, 260: 214-216. DOI:10.1126/science.8097061.

[5] PALEM P P, KURIAKOSE G C, JAYABASKARAN C. Correction: an endophytic fungus, Talaromyces radicus, isolated from Catharanthus roseus, produces vincristine and vinblastine, which induce apoptotic cell death[J]. PLoS ONE, 2016, 10(12): e0144476. DOI:10.1371/ journal.pone.0153111.

[6] 馬麗麗, 鄒欣蓉, 劉瓊, 等. 桑樹資源在預(yù)防和治療2型糖尿病中的作用[J]. 中草藥, 2014, 45(22): 3337-3342. DOI:10.7501/ j.issn.0253-2670.2014.22.023.

[7] 鄭麗屏, 馬燕軍, 張雨青. 一株桑樹內(nèi)生真菌的鑒定及菌絲多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2015, 41(6): 1062-1066. DOI:10.13441/j.cnki.cykx.2015.06.014.

[8] 張雪, 張曉菲, 王立言, 等. 常壓室溫等離子體生物誘變育種及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 化工學(xué)報(bào), 2014, 65(7): 2676-2684. DOI:10.3969/ j.issn.0438-1157.2014.07.027.

[9] ZHANG X, ZHANG C, ZHOU Q Q, et al. Quantitative evaluation of DNA damage and mutation rate by atmospheric and roomtemperature plasma (ARTP) and conventional mutagenesis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(13): 5639-5646. DOI:10.1007/s00253-015-6678-y.

[10] LI H P, SUN W T, WANG H B, et al. Electrical features of radiofrequency, atmospheric-pressure, bare-metallic-electrode glow discharges[J]. Plasma Chemistry and Plasma Processing, 2007, 27(5): 529-545. DOI:10.1007/s11090-007-9079-x.

[11] LI G, LI H P, WANG L Y, et al. Genetic effects of radio-frequency, atmospheric-pressure glow discharges with helium[J]. Applied Physics Letters, 2008, 92(22): 221504. DOI:10.1063/1.2938692.

[12] WANG L Y, HUANG Z L, LI G, et al. Novel mutation breeding method for Streptomyces avermitilis, using an atmospheric pressure glow discharge plasma[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 108(3): 851-858. DOI:10.1111/j.1365-2672.2009.04483.x.

[13] 鄭玲輝, 洪云, 陳曉靜, 等. 奧利萬星中間體A82846B的菌種選育與培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2015, 46(5): 462-466. DOI:10.16522/j.cnki.cjph.2015.05.008.

[14] 武婷婷, 劉萬振, 生吉萍, 等. 產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的桑樹內(nèi)生細(xì)菌分離及鑒定[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(13): 205-208.

[15] 張玲, 劉平懷, 羅寧, 等. 小球藻Chlorella sorokiniana C74營養(yǎng)素分析[J]. 食品研究與開發(fā) , 2016, 37(10): 10-14. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2016.10.003.

[16] YAMAKI K, MORI Y. Evaluation of alpha-glucosidase inhibitory activity in colored foods: a trial using slope factors of regression curves[J]. Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 2006, 53(4): 229-231. DOI:10.3136/nskkk.53.229.

[17] 郎國竣. 微生物源α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選、分離純化及產(chǎn)生菌的鑒定[D]. 上海: 上海師范大學(xué), 2007: 25-27.

[18] 布坎南. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1984: 729-795.

[19] 魏景超. 真菌鑒定手 冊[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1979: 129-135.

[20] 袁軍, 趙犇, 孫夢玉, 等. 常壓室溫等離子體(ARTP)誘變快速選育高產(chǎn)DHA的裂殖壺菌突變株[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2015, 31(10): 199-204. DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.030.

[21] 張旗, 周志娟, 楊冬月, 等. 植物內(nèi)生菌的作用研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2010(9): 36-37. DOI:10.3969/j.issn.1007-5739.2010.09.012.

[22] 牛麗麗, 袁肖寒, 顧成波, 等. 內(nèi)生真菌產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 44(11): 12-16. DOI:10.13989/ j.cnki.0517-6611.2016.11.005.

[23] PANWAR H, CALDERWOOD D, GRANT I R, et al. Lactobacillus, strains isolated from infant faeces possess potent inhibitory activity against intestinal alpha- and beta-glucosidases suggesting anti-diabetic potential[J]. European Journal of Nutrition, 2014, 53(7): 1465-1474. DOI:10.1007/s00394-013-0649-9.

[24] DEWI R T, TACHIBANA S, FAJRIAH S, et al. α-Glucosidase inhibitor compounds from Aspergillus terreus, RCC1and their antioxidant activity[J]. Medicinal Chemistry Research, 2014, 24(2): 737-743. DOI:10.1007/s00044-014-1164-0.

[25] KUMAR P P, RAJ J P P, CHRISTHUDAS I V S N, et al. α-Glucosidase inhibition and antioxidant properties of Streptomyces sp.: in vitro[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology, 2014, 172(3): 1687-1698. DOI:10.1007/s12010-013-0650-z.

[26] 馬頂虹, 龔海燕, 李萌萌, 等. 萎縮芽孢桿菌生理生化特征與檢測鑒定[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2014, 20(7): 33-35.

[27] YUAN W H, WEI Z W, DAI P, et al. Halogenated metabolites isolated from Penicillium citreonigrum[J]. Chemistry and Biodiversity, 2014, 11(7): 1078-1087. DOI:10.1002/cbdv.201300349.

[28] MENG P, ZHOU X X. α-Glucosidase inhibitory effect of a bioactivity guided fraction GIB-638 from Streptomyces fradiae PWH638[J]. Medicinal Chemistry Research, 2012, 21(12): 4422-4429. DOI:10.1007/s00044-012-9984-2.

[29] ZHU Y P, LI X T, TENG C, et al. Enhanced production of α-glucosidase inhibitor by a newly isolated strain of Bacillus subtilis B2 using response surface methodology[J]. Food and Bioproducts Processing, 2013, 91(3): 264-270. DOI:10.1016/j.fbp.2012.09.010.

[30] 白豆, 龍玲, 朱乃碩. 一株產(chǎn)1-脫氧野尻霉素(DNJ)枯草芽孢桿菌黑色變種的誘變育種研究[J]. 復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 55(1): 104-111. DOI:10.15943/j.cnki.fdxb-jns.2016.01.014.

[31] 王興吉, 劉文龍, 錢娟娟. ARTP誘變選育中溫α-淀粉酶高產(chǎn)菌株及其發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 中國釀造, 2016, 35(1): 78-81. DOI:10.11882/ j.issn.0254-5071.2016.01.017.

[32] LU Y, WANG L Y, MA K, et al. Characteristics of hydrogen production of an Enterobacter aerogenes, mutant generated by a new atmospheric and room temperature plasma (ARTP)[J]. Biochemical Engineering Journal, 2011, 55(1): 17-22. DOI:10.1016/j.bej.2011.02.020.

[33] 蘇方華. 桑葉的化學(xué)成分及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2010, 7(14): 9-12. DOI:10.3969/j.issn.1673-7210.2010.14.007.

Isolation, Identification and Mutation Breeding of an Endophytic Strain Producing α-Glucosidase Inhibitor from Mulberry Leaf

ZHU Mengfeng1,2,3, XU Wei2,3,*, SHAO Rong2,3, WEI Ping1,*
(1. School o f Pharmaceutical S ciences, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, China; 2. School of Marine and Biology Engineering, Yancheng Institute of Technology, Yancheng 224051, China; 3. Jiangsu Key Laboratory of Biochemistry and Biotechnology of Marine Wetland, Yancheng Institute of Technology, Yancheng 224051, China)

A strain capable of producing α-glucosidase inhibitor as a potential antidiabetic agent from mulberry leaf was isolated. Subsequently, atmospheric and room temperature plasma (ARTP) was applied to mutagenize the isolated strain for improved production of α-glucosidase inhibitors. At the same time, the physicochemical properties and stability were investigated preliminarily. Out of the 188 isolated strains, a bacterial strain named XuW-LB-188 was selected after examination of α-glucosidase inhibitory activity using 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(PNPG) as a substrate, giving an inhibition percentage of 52.67% in the fermentation supernatant. On the basis of its morphological characteristics and 16S rDNA gene sequence, the strain was preliminarily identi ed as Bacillus atrophaeus. After ARTP mutation breeding and subsequent high-throughput screening, T-690 was selected out of 880 mutant strains, whose inhibition rate (73.25%) against α-glucosidase was increased by 40.61% compared with that of the original strain. The experiment results indicated that the α-glucosidase inhibitor mainly existed in the fermentation broth. Consequently, the inhibitor was an extracellular product. Moreover, it had high polarity and good thermostability.

α-glucosidase inhibitor; mulberry leaf; endophytes; screening; atmospheric and room temperature plasma (ARTP); Bacillus atrophaeus

10.7506/spkx1002-6630-201710019

Q939.97

A

1002-6630（2017）10-0111-06

2016-08-18

江蘇省產(chǎn)學(xué)研前瞻性項(xiàng)目（BY2015057-29）

朱孟峰（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幱梦⑸锖Y選及發(fā)酵。E-mail：278378538@qq.com

*通信作者：許偉（1976—），女，教授，博士，研究方向?yàn)楣I(yè)微生物和酶工程。E-mail：xuweiyc@163.com韋萍（1961—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锎x調(diào)控及天然產(chǎn)物提取。E-mail：weiping@njtech.edu.cn

朱孟峰, 許偉, 邵榮, 等. 桑葉中α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離鑒定及誘變選育[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 111-116. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710019. http://www.spkx.net.cn

ZHU Mengfeng, XU Wei, SHAO Rong, et al. Isolation, identification and mutation breeding of an endophytic strain producing α-glucosidase inhibitor from mulberry leaf[J]. Food Science, 2017, 38(10): 111-116. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710019. http://www.spkx.net.cn