超高壓處理對(duì)消減乳源酪蛋白抗原性影響的體外模擬研究

曲志華,張小強(qiáng),*,周亞盼,梁曉瑜,張 妍,王 旭,劉 靜

(1.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇南京 210009; 2.東南大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210009)

超高壓處理對(duì)消減乳源酪蛋白抗原性影響的體外模擬研究

曲志華1,2,張小強(qiáng)1,2,*,周亞盼1,2,梁曉瑜1,2,張 妍1,2,王 旭1,2,劉 靜1,2

(1.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇南京 210009; 2.東南大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210009)

目的:研究超高壓結(jié)合不同模擬胃腸消化對(duì)于消減乳源酪蛋白抗原性的影響。方法:以乳源酪蛋白為研究對(duì)象,采用不同的壓力、溫度、保壓時(shí)間、超高壓次數(shù)來(lái)處理酪蛋白,并對(duì)處理后的酪蛋白進(jìn)行模擬成人、嬰兒胃腸消化,用間接酶聯(lián)免疫吸附法來(lái)檢測(cè)經(jīng)過(guò)處理后酪蛋白過(guò)敏原消減效果,并且使用正交設(shè)計(jì)確定消減酪蛋白過(guò)敏原最優(yōu)處理?xiàng)l件組合。結(jié)果:在相同超高壓處理?xiàng)l件下,對(duì)酪蛋白進(jìn)行模擬成人、嬰兒胃腸消化環(huán)境,其結(jié)果顯示成人比嬰兒胃腸消化后酪蛋白過(guò)敏原消減的效果更好;高壓結(jié)合模擬成人胃腸消化的最佳條件組合是:350 MPa、溫度30 ℃、保壓時(shí)間15 min、高壓3次,抑制率為22.67%;高壓結(jié)合模擬嬰兒胃腸消化的最佳條件組合是:350 MPa、溫度30 ℃、保壓時(shí)間20 min、高壓1次,抑制率為39.95%。結(jié)論:高壓結(jié)合不同胃腸消化后都可以消減酪蛋白過(guò)敏反應(yīng),而且結(jié)合成人胃腸消化比結(jié)合嬰兒胃腸消化對(duì)過(guò)敏原的消減效果更好。

乳源酪蛋白,超高壓結(jié)合胃腸消化,過(guò)敏原消減,酶聯(lián)免疫

酪蛋白是牛奶中主要的蛋白之一,其消化后能產(chǎn)生許多具有生理功能的活性肽,如阿片樣肽、阿片樣拮抗肽、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽、免疫調(diào)節(jié)肽、抗菌肽、抗血栓肽、礦物元素結(jié)合肽等[1],除此之外,近幾年還發(fā)現(xiàn)抗炎肽[2-3],這些成分的發(fā)現(xiàn)無(wú)疑是有益于人們的健康的。但是酪蛋白是導(dǎo)致嬰幼兒牛奶過(guò)敏主要的過(guò)敏原之一[4-5],其主要的臨床表現(xiàn)為皮膚癥狀,如蕁麻疹、血管神經(jīng)性水腫、濕疹;其次是胃腸道表現(xiàn),如血絲便、拒食[6-7]。因此,降低酪蛋白的過(guò)敏反應(yīng)具有重要意義。

研究表明,酶水解酪蛋白及其亞型可以降低酪蛋白抗原反應(yīng)[8-9],并且不同的蛋白酶對(duì)于酪蛋白抗原性影響不同[10]。超高壓技術(shù)具有降低食品致敏性的作用[11-12]。研究表明,超高壓對(duì)蝦過(guò)敏原蛋白有消減作用,經(jīng)過(guò)超高壓處理的蝦與煮沸蝦相比,其結(jié)合IgE的能力降低了73.59%[13],先高壓再水解和超高壓下直接酶處理對(duì)過(guò)敏原的消減效果更好[14]。超高壓可以降低嬰兒配方大豆分離蛋白的致敏性,與未處理組相比其在300 MPa、15 min的條件下大豆分離蛋白的變應(yīng)原性降低了48.6%[15]。超高壓處理魷魚(yú),可以減少I(mǎi)gE和IgG與抗原表位的結(jié)合,降低其過(guò)敏反應(yīng),并且兩次循環(huán)超高壓可以引起有意義的降低[16]?；谝陨涎芯克悸泛捅尘?采用多次超高壓處理技術(shù),結(jié)合適合的壓力、溫度、保壓時(shí)間、高壓次數(shù)來(lái)處理酪蛋白,并體外模擬消化、探討酪蛋白在不同條件下過(guò)敏性反應(yīng)的情況,同時(shí)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到降低酪蛋白過(guò)敏的最佳高壓次數(shù)、壓力、時(shí)間、溫度組合,對(duì)消減乳源酪蛋白抗原性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白 美國(guó)Sigma公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶 南京生興生物技術(shù)有限公司;兔抗酪蛋白單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG 英國(guó)Abcam公司;脫脂奶粉 美國(guó)BD公司;吐溫-20 美國(guó)Amresco公司;TMB顯色液(ELISA HRP顯色專用) 碧云天生物公司;三羥甲基氨基甲烷 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;濃鹽酸、NaOH等均為分析純。

S-IL-100-850-9-W超高壓處理系統(tǒng) 英國(guó)SFP公司;RT-6000酶標(biāo)分析儀 美國(guó)Rayto公司;PH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;智能生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;無(wú)菌采樣袋(12 cm×18 cm) 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超高壓處理酪蛋白 稱取100 mg酪蛋白加入10 mL pH8.0的Tris-HCl緩沖液混合均勻,密封于無(wú)菌采樣袋中(不留氣泡),將其放入超高壓設(shè)備中,并完全浸沒(méi)于傳壓介質(zhì)中,高壓后的樣品立即放入-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.1 不同的壓力處理乳源酪蛋白 施壓溫度為25 ℃,保壓時(shí)間為20 min,高壓次數(shù)1次,分別選取100、200、300、400 MPa的壓力條件處理乳源酪蛋白。

1.2.1.2 不同的施壓溫度處理乳源酪蛋白 處理壓力為200 MPa,保壓時(shí)間為20 min,高壓次數(shù)1次,分別選取15、25、35、45 ℃的溫度條件來(lái)處理乳源酪蛋白。

1.2.1.3 不同的保壓時(shí)間處理乳源酪蛋白 處理壓力為200 MPa,施壓溫度是25 ℃,高壓次數(shù)1次,分別選取10、20、30、40 min的保壓時(shí)間處理乳源酪蛋白。

1.2.1.4 不同的高壓次數(shù)處理乳源酪蛋白 處理壓力為200 MPa,施壓溫度是25 ℃,保壓時(shí)間是20 min,分別選取1、2、3次的高壓次數(shù)來(lái)處理乳源酪蛋白。

1.2.1.5 超高壓處理乳源酪蛋白的條件優(yōu)化 選取處理壓力、施壓溫度、保壓時(shí)間和高壓次數(shù)作為實(shí)驗(yàn)因素,正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 超高壓處理乳源酪蛋白正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.2 模擬不同的胃腸消化實(shí)驗(yàn) 模擬成人胃腸消化實(shí)驗(yàn):將高壓處理后的乳源酪蛋白,用0.2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0,在37 ℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱,加入胃蛋白酶4 mg,恒溫消化2 h;然后用0.2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)樣液pH至7.5,添加4 mg胰蛋白酶,放入37 ℃恒溫水浴鍋中,恒溫消化4 h。最后100 ℃沸水浴滅活10 min,4000 r/min離心10 min,放入-4 ℃冰箱保存[17]。

模擬嬰兒胃腸消化實(shí)驗(yàn):將高壓處理后的乳源酪蛋白,用0.2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.0,在37 ℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱,加入胃蛋白酶4 mg,恒溫消化2 h;然后用0.2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)樣液pH至7.0,添加4 mg胰蛋白酶,放入37 ℃恒溫水浴鍋中,恒溫消化4 h。最后100 ℃沸水浴滅活10 min,4000 r/min離心10 min,放入-4 ℃冰箱保存[18-19]。

1.2.3 乳源酪蛋白水解物抗原性的測(cè)定 間接競(jìng)爭(zhēng)Elisa法:將未處理抗原包被96孔酶標(biāo)板,設(shè)置空白對(duì)照組,放入冰箱4 ℃過(guò)夜;用5 g/100 mL封閉液37 ℃封閉2 h,PBST洗板后加入1∶5000稀釋的單克隆抗體和稀釋50倍的待測(cè)抗原,37 ℃競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)2 h;再次洗板后加入1∶100000 HRP標(biāo)記的二抗,37 ℃競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)1 h;洗板后加入TMB顯色液顯色,用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)370 nm處的吸光度。抗原水平抑制率計(jì)算公式:

圖1 不同因素對(duì)乳源酪蛋白過(guò)敏原消減作用的影響Fig.1 Effects of different factors on casein from bovine milk allergen elimination注:*表示數(shù)據(jù)與對(duì)照組相比有顯著性差異,圖2同。

抑制率(%)=(1-B/B0)×100=(OD空白對(duì)照-OD待測(cè)樣品)/OD空白對(duì)照×100

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓結(jié)合模擬成人胃腸消化的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 高壓條件單因素實(shí)驗(yàn) 在對(duì)乳源酪蛋白進(jìn)行超高壓處理時(shí),控制其壓力、溫度、時(shí)間、次數(shù),并結(jié)合模擬成人胃腸消化,其過(guò)敏原消減結(jié)果如圖1:

壓力條件對(duì)于酪蛋白過(guò)敏原消減的影響如圖1A:壓力為100、200、300、400 MPa與對(duì)照組相比,其抗原性顯著降低(p<0.05),且壓力在300 MPa時(shí),過(guò)敏原消減最為顯著。

溫度條件對(duì)于酪蛋白過(guò)敏原消減的影響如圖1B:溫度為15、25、35、45 ℃與對(duì)照組相比,其抗原性顯著降低(p<0.05),且溫度在25 ℃的條件下,過(guò)敏原消減最為顯著。

保壓時(shí)間對(duì)于酪蛋白過(guò)敏原消減的影響如圖1C:與對(duì)照組相比,保壓時(shí)間為10、20、30、40 min時(shí),抗原性顯著降低(p<0.05),且保壓時(shí)間20 min時(shí),過(guò)敏原消減最為顯著。

高壓次數(shù)對(duì)于酪蛋白過(guò)敏原消減的影響如圖1D:高壓次數(shù)為1、2、3次與對(duì)照組相比,其抗原性顯著降低(p<0.05),且高壓次數(shù)為3次時(shí),過(guò)敏原消減最為顯著。

酪蛋白抗原性的減弱或增強(qiáng)可能是由于壓力、超高壓與熱處理共同作用、保壓時(shí)間、高壓循環(huán)次數(shù)的變化,酪蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使存在于酪蛋白抗原表面的表位被掩蓋或破壞,或是原包埋的酪蛋白分子內(nèi)部的抗原表位被暴露,形成新的抗原表位[11,20-21]。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表2可知,通過(guò)高壓處理乳源酪蛋白,結(jié)合模擬成人胃腸消化所得產(chǎn)物,經(jīng)過(guò)間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè),得出4種因素對(duì)酪蛋白抗原性的影響大小為A>B>C>D,即壓力>溫度>保壓時(shí)間>高壓次數(shù),較好的實(shí)驗(yàn)方案為A3B3C1D3,即壓力350 MPa、溫度30 ℃、保壓時(shí)間15 min、高壓次數(shù)3次,此條件下的抑制率為22.67%。與對(duì)照組相比其酪蛋白過(guò)敏原消減情況已經(jīng)有了很大程度的降低,說(shuō)明超高壓技術(shù)結(jié)合成人胃腸消化對(duì)于酪蛋白過(guò)敏原的消減起到一定的作用。

表2 高壓處理結(jié)合模擬成人胃腸消化對(duì)過(guò)敏原消減效果的正交實(shí)驗(yàn)研究±s)

圖2 不同條件下乳源酪蛋白過(guò)敏原消減作用Fig.2 Casein from bovine milk allergen elimination under different conditions

2.2 超高壓結(jié)合模擬嬰兒胃腸消化的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 高壓條件單因素實(shí)驗(yàn) 在對(duì)乳源酪蛋白進(jìn)行超高壓處理時(shí),控制其壓力、溫度、時(shí)間、次數(shù),并結(jié)合模擬嬰兒胃腸消化,其過(guò)敏原消減結(jié)果如圖2所示。

壓力條件對(duì)于酪蛋白過(guò)敏原消減的影響如圖2A:當(dāng)壓力為200、300 MPa時(shí)，與對(duì)照組相比,其抗原性顯著降低(p<0.05),且壓力在300 MPa時(shí),過(guò)敏原消減最為顯著。

溫度條件對(duì)于酪蛋白過(guò)敏原消減的影響如圖2B:溫度在15、25 ℃時(shí)與對(duì)照組相比,其抗原性顯著降低(p<0.05),且溫度在25 ℃的條件下,過(guò)敏原消減最為顯著。

保壓時(shí)間對(duì)于酪蛋白過(guò)敏原消減的影響如圖2C:保壓時(shí)間20、30 min與對(duì)照組相比,其抗原性顯著降低(p<0.05),且保壓時(shí)間在20 min時(shí),過(guò)敏原消減最為顯著。

高壓次數(shù)對(duì)于酪蛋白過(guò)敏原消減的影響如圖2D:高壓次數(shù)1、2、3次與對(duì)照組相比,其抗原性顯著降低(p<0.05),且高壓次數(shù)為3次時(shí),過(guò)敏原消減最為顯著。

酪蛋白抗原性的減弱,可能是由于壓力、溫壓結(jié)合、保壓時(shí)間、高壓循環(huán)次數(shù)的變化,破壞酪蛋白的空間結(jié)構(gòu),進(jìn)而可以破壞蛋白的構(gòu)象性表位,導(dǎo)致其抗原性降低[22],而酪蛋白抗原性的增加可能是由于,破壞維持酪蛋白構(gòu)象的作用力,使酪蛋白結(jié)構(gòu)伸展,暴露更多的芳香族和疏水性氨基酸殘基,使被掩蓋的抗原表位重新暴露到蛋白結(jié)構(gòu)上面,增加抗原抗體的結(jié)合[23]。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表2可知,通過(guò)高壓處理乳源酪蛋白,結(jié)合模擬嬰兒胃腸消化所得產(chǎn)物,經(jīng)過(guò)間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè),得出4種因素對(duì)酪蛋白抗原性的影響大小為A>B>D>C,即壓力>溫度>高壓循環(huán)次數(shù)>保壓時(shí)間,較好的實(shí)驗(yàn)方案為A3B3C2D1,即壓力350 MPa、溫度30 ℃、保壓時(shí)間20 min、高壓次數(shù)1次,此條件下的抑制率為39.95%。與對(duì)照組相比其酪蛋白過(guò)敏原消減情況已經(jīng)有了很大程度的降低,說(shuō)明超高壓技術(shù)結(jié)合嬰兒胃腸消化對(duì)于酪蛋白過(guò)敏原的消減起到一定的作用。

表3 高壓處理結(jié)合模擬嬰兒胃腸消化對(duì)過(guò)敏原消減效果的正交實(shí)驗(yàn)研究±s)

3 結(jié)論

在相同超高壓處理?xiàng)l件下,對(duì)酪蛋白進(jìn)行模擬成人、嬰兒胃腸消化環(huán)境,在單因素基礎(chǔ)上應(yīng)用正交設(shè)計(jì)對(duì)超高壓處理酪蛋白條件進(jìn)行優(yōu)化。單因素結(jié)果顯示:超高壓結(jié)合成人、嬰兒胃腸消化后都可以消減酪蛋白過(guò)敏反應(yīng)。高壓結(jié)合模擬成人胃腸消化的最佳條件組合是:350 MPa、溫度30 ℃、保壓時(shí)間15 min、高壓3次,此時(shí)的抑制率為22.67%;高壓結(jié)合模擬嬰兒胃腸消化的最佳條件組合是:350 MPa、溫度30 ℃、保壓時(shí)間20 min、高壓1次,此時(shí)的抑制率為39.95%,因此可以看出:結(jié)合成人胃腸消化比結(jié)合嬰兒胃腸消化對(duì)過(guò)敏原的消減效果更好。期望通過(guò)本研究,可以進(jìn)一步對(duì)牛奶中酪蛋白過(guò)敏原進(jìn)行消減,研發(fā)出更利于嬰兒飲用的液態(tài)奶以及其低過(guò)敏性酪蛋白相關(guān)產(chǎn)品。

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Imitative study on the effects of ultra high pressure treatment on the elimination of allergens from bovine caseininvitro

QU Zhi-hua1,2,ZHANG Xiao-qiag1,2,*,ZHOU Ya-pan1,2, LIANG Xiao-yu1,2,ZHANG Yan1,2,WANG Xu1,2,LIU Jing1,2

(1.School of Public Health,Southeast University,Nanjing 210009,China; 2.Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering of Ministry of Education,Southeast University,Nanjing 210009,China)

Objective:The effects of ultra high pressure(UHP)treatment on elimination of allergens in casein from bovine milk were studied by gastrointestinal digestion models. Method:Casein from bovine milk were pretreated at different pressure level,temperature,pressure dwell time and pressure cycle,following by digested at the imitative condition of adult or infant gastrointestinal environment,respectively. The eliminating effectiveness of allergens was detected by indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Orthogonal array design were used to optimize the operating conditions. Result:After the same UHP treatment,the bovine casein was digested in an imitative adult or infant gastrointestinal environment,respetively.The results showed that casein allergen reduction in adult gastrointestinal digestive models was better than in infant’s. The optimal UHP combined with adult gastrointestinal digestive models treatment was performed at the condition of 350 MPa,30 ℃,15 min,3 times cycle,and the inhibition rate was 22.67%. The optimal UHP combined with infant gastrointestinal digestive models treatment was performed at the condition of 350 MPa,30 ℃,20 min,1 times cycle,and the inhibition rate was 39.95%. Conclusion:These results demonstrated that UHP treatment followed by adult and infant gastrointestinal digestion had eliminating effect on allergens in casein from bovine milk,and UHP treatment combined with adult gastrointestinal digestion model was more effective in elimination allergens in casein from bovine milk.

casein from bovine milk;ultra high pressure combined gastrointestinal digestion models;allergen elimination;ELISA

2016-12-06

曲志華(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：功能食品研究，E-mail：annaqu198997@163.com。

*通訊作者:張小強(qiáng)(1968-)，男，博士，副教授，研究方向：功能食品研究，E-mail：zhangxq7843@126.com。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助和江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃(SJZZ15_0025)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)09-0070-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.005