甲狀腺激素T3對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后NGF和BDNF表達(dá)的影響研究*

竇 超，張 敏，趙源征，郭亞培，吳世陶，劉恒方

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，鄭州 450000)

甲狀腺激素T3對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后NGF和BDNF表達(dá)的影響研究*

竇 超，張 敏，趙源征，郭亞培，吳世陶，劉恒方△

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，鄭州 450000)

目的 探討甲狀腺激素T3對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。方法 雄性SD大鼠分為假手術(shù)+生理鹽水組、假手術(shù)+T3組、大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)+生理鹽水組、MCAO+T3組。應(yīng)用MCAO法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，分別于缺血后1 h及再灌注后6 h給予腹腔注射甲狀腺激素10 μg/100 g，生理鹽水為安慰劑。再灌注24 h后，觀察不同組別大鼠神經(jīng)功能損傷情況，梗死體積變化，以及缺血側(cè)腦皮質(zhì)中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的mRNA及蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果 與MCAO+生理鹽水組比較，MCAO+T3組大鼠神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)減輕，腦梗死體積減小，NGF、BDNF的mRNA和蛋白表達(dá)上升(P<0.05)。結(jié)論 甲狀腺激素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制與增加腦缺血再灌注損傷中NGF、BDNF的表達(dá)相關(guān)。

腦缺血；再灌注損傷；甲狀腺激素類(lèi)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；神經(jīng)保護(hù)作用；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

缺血性腦血管病是目前威脅人類(lèi)健康與生存的主要疾病之一。及時(shí)恢復(fù)腦組織血液供應(yīng)是修復(fù)腦組織損傷的最佳辦法，但缺血后血流再通又可能導(dǎo)致缺血再灌注損傷，因此減輕再灌注損傷并促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)已成為目前研究熱點(diǎn)之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)水平增加，通過(guò)激活不同的信號(hào)系統(tǒng)，促進(jìn)受損神經(jīng)元再生及分化，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)[2-3]。甲狀腺激素在嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟的過(guò)程中至關(guān)重要[4]。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)其對(duì)成年甚至老年期中樞神經(jīng)系統(tǒng)亦有至關(guān)重要的作用[5-6]。Mendes-De-Aguiard等[7]將甲狀腺激素T3加入培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，T3可增加其對(duì)抗高濃度谷氨酸毒性的能力，并增加與膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)神經(jīng)元的存活率，可見(jiàn)T3對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元有保護(hù)作用。但對(duì)T3在腦缺血再灌注損傷中的作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究T3對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織中NGF和BDNF表達(dá)的影響，探討T3對(duì)腦缺血再灌注損傷是否存在保護(hù)作用及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)成年SD大鼠32只，雄性，8周，體質(zhì)量250～280 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑 T3購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子抗體(anti-NGF)和兔抗腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子抗體(anti-BDNF)購(gòu)自英國(guó)abcam公司；兔抗β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；NGF、BDNF及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；Western blot相關(guān)試劑購(gòu)自中國(guó)博士德公司；HotStarTaq Master Mix試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；TaqMan Reverse Transcription Reagents試劑盒購(gòu)自加拿大Abm公司；紅四氮唑(TTC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 主要儀器 Nonodrop超微量分光光度計(jì)和CL31.1R低溫超速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；普通/梯度PCR儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；DYY-6C水平電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠；Mini-PROTEAN Tetra蛋白垂直電泳儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；Amersham Imager 600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GE公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將32只SD大鼠分為4組，每組8只。分別為：假手術(shù)+生理鹽水組、假手術(shù)+T3組、大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)+生理鹽水組、MCAO+T3組。分別于缺血后1 h及再灌注后6 h腹腔注射T3 10 μg/100 g，以及等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠腦缺血再灌注模型制備 根據(jù)改良的Longa法通過(guò)MCAO制備腦缺血再灌注損傷模型[8]。大鼠用10%水合氯醛(30 mg/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，常規(guī)消毒，頸部正中切口。分離右側(cè)頸總、頸外及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總及頸外動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端用動(dòng)脈夾夾閉后，在頸總動(dòng)脈分叉距頸內(nèi)動(dòng)脈0.5 cm處作1個(gè)切口，將尼龍線導(dǎo)入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入線栓深度約為(18.0±0.5)mm，感到輕微阻力時(shí)立即停止插線?？p合傷口，留置線頭于體外，2 h后將線栓提至頸總動(dòng)脈內(nèi)，完成再灌注。假手術(shù)各組采用相同的手術(shù)步驟，但不插入線栓。術(shù)后將室溫控制在22～25 ℃，將動(dòng)物置于放有清潔墊料的鼠籠中，自由進(jìn)食、水。

1.2.3 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 參照Longa等[8]的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：(1)無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀、活動(dòng)正常者，0分；(2)不能完全伸展左側(cè)前爪，1分；(3)動(dòng)物爬行時(shí)出現(xiàn)向左轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象)，2分；(4)身體向左側(cè)傾倒者，3分；(5)不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失者，4分。評(píng)分為0分和4分者均被剔除，神經(jīng)功能評(píng)價(jià)在再灌注后24 h取材前進(jìn)行。

1.2.4 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色梗死體積測(cè)量 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分完成后，斷頭取腦，-20 ℃速凍30 min，從額極后2 mm處行連續(xù)冠狀切片，厚2 mm。將切片放入2%TTC溶液中，37 ℃避光染色30 min后，用4%多聚甲醛固定24 h后拍照，正常腦組織染色后呈鮮紅色，而梗死區(qū)呈蒼白色。采用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算梗死面積，將各腦片的梗死面積與厚度的乘積進(jìn)行累加，獲得梗死體積。

1.2.5 RT-PCR技術(shù)

1.2.5.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)大鼠基因組序列設(shè)計(jì)引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，見(jiàn)表1。

1.2.5.2 RT-PCR 取缺血側(cè)皮層腦組織置于1.5 mL RNA-free EP管中，利用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA水平，采用TaqMan Reverse Transcription Reagents試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用HotStarTaq Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin為內(nèi)參照，觀測(cè)其表達(dá)水平變化。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 取缺血側(cè)皮層腦組織，置于組織勻漿器中，加入適量RIPA蛋白提取裂解液，置于冰上低溫勻漿裂解。裂解完全后，將裂解液移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液，置于-80 ℃保存。二喹啉甲酸 (BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，按相同蛋白濃度等量體積依次上樣。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，然后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，之后4 ℃過(guò)夜孵育特異性兔抗NGF(1∶1 000)、兔抗BDNF(1∶1 000)、兔抗β-actin(1∶1 000)、TBST洗膜3次后，HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1：1 000)室溫孵育1 h后，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，Amersham Imager 600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。以β-actin為內(nèi)參，用Image J圖像處理系統(tǒng)分析蛋白條帶的相對(duì)灰度值，觀測(cè)不同組別目的蛋白表達(dá)水平變化。

2 結(jié) 果

2.1 T3對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響 大鼠腦缺血再灌注損傷24 h后，假手術(shù)+生理鹽水組和假手術(shù)+T3組均無(wú)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，Longa評(píng)分0分；MCAO+生理鹽水組大鼠可見(jiàn)明顯的左側(cè)偏癱樣表現(xiàn)，左側(cè)追尾，軀體向左側(cè)傾倒，Longa評(píng)分(2.71±0.56)分，明顯高于假手術(shù)各組(P<0.05)；MCAO+T3組神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)減輕，Longa評(píng)分(1.63±0.58)分，較MCAO+生理鹽水組降低(P<0.05)。

2.2 T3對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響 大鼠腦缺血再灌注損傷24 h后，假手術(shù)+生理鹽水組和假手術(shù)+T3組TTC染色呈均勻橘紅色，無(wú)缺血梗死灶。MCAO+生理鹽水組和MCAO+T3組腦組織均有不同程度的缺血梗死，TTC染色可見(jiàn)梗死灶成白色，周邊組織呈橘紅色。與MCAO+生理鹽水組[(45.12±2.32)%]相比，[MCAO+T3組(26.36±1.04)%]大鼠的腦梗死體積百分比減少(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A:MCAO+生理鹽水組;B：MCAO+T3組。

圖1 腦缺血再灌注大鼠腦組織TTC染色

2.3 T3對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織NGF和BDNF mRNA表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)+生理鹽水組和假手術(shù)+T3組相比，MCAO+生理鹽水組大鼠NGF和BDNF mRNA水平均增加(P<0.05)；而與MCAO+生理鹽水組相比，MCAO+T3組大鼠NGF和BDNF mRNA水平進(jìn)一步升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

A：NGF mRNA；B：BDNF mRNA。*：P<0.05，與假手術(shù)+生理鹽水組比較；#：P<0.05，與MCAO+生理鹽水組比較。

圖2 各組大鼠腦組織NGF和BDNF mRNA水平

2.4 T3對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織NGF和BDNF蛋白表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)+生理鹽水組和假手術(shù)+T3組相比，MCAO+生理鹽水組大鼠NGF和BDNF蛋白表達(dá)水平均增加(P<0.05)；而與MCAO+生理鹽水組相比，MCAO+T3組大鼠NGF和BDNF表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

A：NGF蛋白；B：BDNF蛋白。*：P<0.05，與假手術(shù)+生理鹽水組比較；#：P<0.05，與MCAO+生理鹽水組比較。

圖3 各組大鼠腦組織NGF和BDNF蛋白表達(dá)水平

3 討 論

腦血管病是目前危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病之一，其中80%約為缺血性腦血管病。本研究通過(guò)MCAO建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，觀察甲狀腺激素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，結(jié)果顯示，甲狀腺激素T3對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，可減輕缺血再灌注損傷所致神經(jīng)缺損表現(xiàn)，減少梗死體積，保護(hù)受損神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元再生等作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，T3的這種神經(jīng)保護(hù)作用與增加腦組織中NGF和BDNF的表達(dá)水平，促進(jìn)新生神經(jīng)元再生相關(guān)。

腦缺血再灌注損傷所致局部梗死灶主要由中心壞死區(qū)和周邊缺血半暗帶組成[9-10]。缺血早期，中心區(qū)的神經(jīng)元壞死，神經(jīng)功能完全喪失；而周邊區(qū)神經(jīng)元暫時(shí)處于休眠狀態(tài)[11-12]，只要盡早恢復(fù)其血供，即可及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞。NGF和BDNF均屬于神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族，在中樞神經(jīng)發(fā)育過(guò)程至關(guān)重要[13-14]。Tongiorgi等[15]發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性硬化癥患者中，BDNF可通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路，維持神經(jīng)元生存。Li等[16]發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血后，BDNF通過(guò)調(diào)節(jié)TrkB相關(guān)信號(hào)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元再生。此外，BDNF還可通過(guò)NMDA受體及胞核鈣信號(hào)拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性反應(yīng)[17]。據(jù)報(bào)道，NGF可作用于NMDA受體，降低細(xì)胞內(nèi)的Ca2+超載，加速自由基清除、減輕興奮性氨基酸毒性，從而保護(hù)神經(jīng)元[18]?？梢?jiàn)，適度增加腦組織中NGF和BDNF表達(dá)水平，對(duì)維持神經(jīng)元存活、促進(jìn)受損神經(jīng)修復(fù)、減輕神經(jīng)毒性是有利的。

甲狀腺激素，特別是T3，在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟的過(guò)程中至關(guān)重要，它已被證實(shí)參與胚胎腦細(xì)胞的增殖分化、樹(shù)突軸突生長(zhǎng)、神經(jīng)元遷移及髓鞘形成等[4,19]。然而，其作用并不局限于幼年個(gè)體。近年來(lái)，人們逐漸開(kāi)始關(guān)注甲狀腺激素對(duì)于成年動(dòng)物腦組織的影響[5-6,20]。研究發(fā)現(xiàn)，成年人甲狀腺激素水平紊亂(過(guò)低或過(guò)高)會(huì)導(dǎo)致情緒障礙、癡呆或混亂[21]。慢性脫髓鞘動(dòng)物模型中，給予外源性的T3能夠促進(jìn)癥狀的緩解和髓鞘再生修復(fù)[22]。Deb等[23]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺激素可通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮和pERK1/2信號(hào)通路保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞免受嗎啡誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，T3通過(guò)一種非基因組機(jī)制，減輕神經(jīng)毒性反應(yīng)[7,24]。綜上所述，甲狀腺激素對(duì)正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)維持及損傷神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)均具有保護(hù)作用，然而其在腦缺血再灌注后損傷中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究通過(guò)大鼠腦缺血再灌注模型，觀測(cè)甲狀腺激素對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用。結(jié)果表明，甲狀腺激素T3可通過(guò)增加腦組織中NGF和BDNF表達(dá)水平，促進(jìn)神經(jīng)元再生、修復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞、減輕腦梗死體積，從而對(duì)缺血再灌注大鼠起到神經(jīng)保護(hù)作用。

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The influence of thyroid hormones on the expression of NGF and BDNF after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats*

DouChao,ZhangMin,ZhaoYuanzheng,GuoYapei,WuShitao,LiuHengfang△

(DepartmentofNeurology，theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou，Henan450000,China)

Objective To investigate the neuroprotective effect of thyroid hormones T3 on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats and its mechanism．Methods SD rats were divided into four groups:sham+saline group,sham+T3 group,MCAO+saline group,MCAO+T3 group.The cerebral ischemia-reperfusion injury rat models were established by right middle cerebral artery occlusion.Thyroid hormones (10 μg/100 g) or normal saline were given respectively by intraperitoneal injection twice at 1 h after the onset of ischemia and 6 h after reperfusion.Neurobehavioral score was evaluated at 24 h after reperfusion;TTC staining was used to label infarction area;RT-PCR was used to detect the mRNA level of nerve growth factor (NGF) and brain derived neurotrophic factor (BDNF) in brain tissue;Western blot was employed to determine alterations in protein levels of NGF and BDNF.Results Compared with MCAO+saline group,the neurological deficit and the volume of cerebral infarction of MCAO+T3 group was decreased,and the mRNA and protein expression of NGF and BDNF of MCAO+T3 group were increased(P<0.05).Conclusion Thyroid Hormones could promote the nerve repair,stimulate the nerve regeneration and improve the nervous behavioral function by up-regulating the expression of NGF and BDNF.

brain ischemia；reperfusion injury；thyroid hormones；nerve growth factor;neuroprotective effect;brain-derived neurotrophic factor

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.005

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(16A310021)。 作者簡(jiǎn)介：竇超(1988-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事腦血管疾病方面研究?！?/p>

，E-mail：liuhf1965@163.com。

R743.3

A

1671-8348(2017)15-2030-04

2016-11-26

2017-01-12)