K-ras基因狀態(tài)及ras蛋白表達在胃印戒細胞癌免疫表型分類中的意義*

熊秋迎，熊 欣，胡秀華，涂露霞，熊振芳△

(1.南昌大學第一附屬醫(yī)院病理科，南昌 330006；2.江西省南昌市洪都中醫(yī)院急診科 330038)

K-ras基因狀態(tài)及ras蛋白表達在胃印戒細胞癌免疫表型分類中的意義*

熊秋迎1，熊 欣1，胡秀華2，涂露霞1，熊振芳1△

(1.南昌大學第一附屬醫(yī)院病理科，南昌 330006；2.江西省南昌市洪都中醫(yī)院急診科 330038)

目的 探討K-ras基因狀態(tài)及ras蛋白表達在胃印戒細胞癌免疫表型分類中的意義。方法 應(yīng)用組織芯片免疫組織化學技術(shù)檢測180例胃印戒細胞癌組織中ras蛋白的表達；PCR擴增和DNA直接測序法檢測癌組織中K-ras基因12、13密碼子的突變情況。結(jié)果 ras蛋白陽性50例(27.8%)，ras蛋白陽性表達率在腸型印戒細胞癌中顯著高于胃型和混合型印戒細胞癌(P<0.05)。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組織中， ras蛋白陽性表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織(P<0.05)；隨著腫瘤侵襲、演進及臨床分期的升高，ras蛋白陽性表達率明顯增高(P<0.05)。K-ras基因突變型22例(12.2%)。所有突變位點均位于12密碼子，突變類型包括：GGT→AGT 1例，GGT→TGT 1例，GGT→GCT 2例，GGT→GTT 8例，GGT→GAT 10例。13密碼子未發(fā)現(xiàn)突變。腸型印戒細胞癌K-ras基因突變率顯著高于胃型和混合型印戒細胞癌(P<0.05)。K-ras基因突變型病例ras蛋白陽性表達率明顯高于K-ras基因野生型病例(P<0.05)。Spearman等級相關(guān)分析顯示， ras蛋白表達與K-ras基因突變呈正相關(guān)(r=0.61，P<0.05)。結(jié)論 ras蛋白的過表達可能與胃印戒細胞癌侵襲潛能、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，ras蛋白表達和K-ras基因突變與腫瘤的免疫表型變化存在相關(guān)性，它們在癌細胞表型轉(zhuǎn)化過程中可能起到一定作用。

胃腫瘤；基因，ras；蛋白質(zhì)；印戒細胞癌；K-ras基因；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；靶向治療

胃印戒細胞癌是胃腺癌中特殊的組織學亞型，細胞含豐富黏液，該類型主要呈彌漫侵襲性生長，進展迅速，預(yù)后差。本研究前期資料顯示胃印戒細胞癌的胃腸免疫標記表達模式可能反映腫瘤的演進潛能，說明可能存在不同的分子遺傳學背景[1]。K-ras基因?qū)儆赗as基因超家族，是重要的癌基因，第12、13密碼子點突變是其常見的突變位點，可導致細胞惡性轉(zhuǎn)化。ras蛋白是表皮生長因子受體(EGFR)傳導通路中關(guān)鍵的信號分子，當K-ras基因突變后，ras發(fā)生構(gòu)象變化，從而失去細胞傳導作用，刺激細胞分裂、增殖，導致細胞癌變[2]。目前，K-ras基因已成為結(jié)直腸癌分子靶向治療靶點之一。因此，本研究對腸型印戒細胞癌是否存在K-ras基因突變，并對其生物學行為及個體化治療有關(guān)的問題進行研究。本研究通過檢測K-ras基因狀態(tài)及ras蛋白在不同免疫表型胃印戒細胞癌中表達差異，探討ras蛋白和K-ras基因與印戒細胞癌的胃、腸分型的關(guān)系及其作為分子治療靶點在靶向治療中的可能性，為制訂個性化治療方案和評估預(yù)后提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集南昌大學第一附屬醫(yī)院病理科2004年10月至2010年12月手術(shù)切除的180例胃印戒細胞癌組織，術(shù)前未行放、化療。其中，男74例，女106例；年齡16～84歲，中位年齡47歲；黏膜內(nèi)癌57例，早期黏膜下浸潤癌 40 例，進展期癌 83 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移77例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移103例；有脈管浸潤74例，無脈管浸潤106例；有神經(jīng)浸潤60例，無神經(jīng)浸潤120例；TNM分期中，Ⅰ期91例，Ⅱ期10例，Ⅲ期33例，Ⅳ期46例。胃印戒細胞癌免疫表型分型：本組前期研究[1]根據(jù)胃印戒細胞癌胃、腸免疫表型標記[胃免疫表型特異性標記物：黏液素(MUC)1、MUC5AC、MUC6；腸免疫表型特異性標記物：MUC2、果蠅相關(guān)同源異形框轉(zhuǎn)錄因子(CDX2)]表達差異，將其分為3型：胃型印戒細胞癌(只表達胃免疫表型標記物)67例，腸型印戒細胞癌(只表達腸免疫表型標記物)42例，混合型印戒細胞癌(胃、腸免疫表型標記物均表達)71例。

1.2 方法

1.2.1 ras蛋白檢測 采用Envision-IHC法檢測組織芯片中ras蛋白的表達情況，ras蛋白多克隆抗體購自Novocastra公司，即用型工作液。以細胞質(zhì)或細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽性。

1.2.2 PCR擴增和DNA直接測序法檢測K-ras基因突變 石蠟包埋腫瘤組織DNA提取、PCR擴增，PCR產(chǎn)物在測序儀(ABI PRISM310)上完成測序，測序試劑為Big Dye terminator v2.0,采用DNA Star軟件進行序列分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行處理，計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗、Fisher精確檢驗和 Spearman等級相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 ras蛋白表達與印戒細胞癌免疫表型分類及臨床病理參數(shù)的關(guān)系 180例胃印戒細胞癌中，ras蛋白陽性50例，表達率為27.8%。腸型病例ras蛋白陽性表達率顯著高于胃型和混合型病例，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中，ras蛋白陽性表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著腫瘤侵襲、演進及臨床分期的升高，ras蛋白陽性表達率明顯增高，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

2.2 K-ras基因突變與印戒細胞癌免疫表型分類及臨床病理參數(shù)的關(guān)系 180例癌組織中，K-ras基因突變22例，突變率為12.2%。所有突變位點均位于K-ras基因12密碼子，突變類型包括：GGT→AGT 1例，GGT→TGT 1例，GGT→GCT 2例，GGT→GTT 8例，GGT→GAT 10例。13密碼子未發(fā)現(xiàn)突變。腸型病例K-ras基因突變率顯著高于胃型和混合型病例，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而K-ras基因突變率與臨床病理參數(shù)之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、圖2。

表1 不同免疫表型組K-ras基因狀態(tài)及ras蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

續(xù)表1 不同免疫表型組K-ras基因狀態(tài)及ras蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖1 腫瘤細胞ras蛋白陽性圖(EnVision法，×200)

2.3 K-ras基因突變與ras蛋白表達的關(guān)系 22例K-ras基因突變型病例中，ras蛋白陽性表達13例，陽性率為59.1%。在158例K-ras基因野生型病例中， ras蛋白陽性表達37例，陽性率為23.4%。K-ras基因突變型病例ras蛋白陽性表達率明顯高于K-ras基因野生型病例，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Spearman等級相關(guān)分析顯示，ras蛋白表達與K-ras基因突變呈正相關(guān)(r=0.61，P<0.05)。

A:GGT→GAT；B:GGT→GTT；C：GGT→AGT；D：GGT→TGT；E：GGT→GCT。

圖2 K-ras基因12密碼子突變類型

3 討 論

胃印戒細胞癌發(fā)病率在胃腺癌中占3.4%～39.0%[3-5]。它起源于黏膜固有層內(nèi)腺頸部未分化的干細胞，細胞富含黏液[6]。與其他類型腺癌比較，印戒細胞癌具有分化差、侵襲性強、進展迅速、預(yù)后差等特點，是胃腺癌中最特殊的組織病理學類型。

K-ras基因是重要的原癌基因，編碼相對分子質(zhì)量為21×103的ras蛋白,而ras蛋白是EGFR傳導通路中關(guān)鍵的信號分子，當K-ras基因突變后，ras蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，不受上游EGFR信號通路的控制，不斷刺激細胞無休止地分裂、增殖[7-8]。

在實際工作中，K-ras基因已成為結(jié)直腸癌分子靶向治療的標靶之一，隨著對胃癌基因分子分型研究的不斷深入，其治療的分子標靶逐漸成為研究的熱點?；诖耍菊n題組前期研究即根據(jù)胃印戒細胞癌胃、腸免疫表型標記表達差異，將其分為胃型、腸型和混合型3個不同類型，發(fā)現(xiàn)這3個類型預(yù)后存在差異[1]。而本研究結(jié)果顯示，ras蛋白表達和K-ras基因突變狀態(tài)于3組間亦存在差異。腸型病例中ras蛋白陽性表達率顯著高于胃型和混合型病例，這說明ras蛋白可能與腫瘤的胃、腸免疫表型變化存在相關(guān)性，在癌細胞表型轉(zhuǎn)化過程中可能起到一定作用。Gimori等[9]研究顯示，ras蛋白表達與臨床病理參數(shù)之間無相關(guān)性；Atkar等[10]資料表明， ras蛋白表達程度與腫瘤的分化程度有關(guān)；Okumura等[11]的結(jié)果則說明ras蛋白可能增強腫瘤的浸潤進展、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果顯示，隨著ras蛋白表達升高，瘤組織更易進展、浸潤，且更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說明ras蛋白表達與差的腫瘤生物學行為及腫瘤演進有一定相關(guān)性， ras蛋白可能參與腫瘤細胞浸潤和擴散，在一定程度上能夠反映腫瘤的生物學行為。有文獻報道ras蛋白的高表達可促進癌細胞溶解細胞外基質(zhì)和膠原纖維，使細胞獲得較強的浸潤和轉(zhuǎn)移潛能[12]，這是否能促進癌細胞的血道、淋巴道及遠處轉(zhuǎn)移，尚待進一步研究。

近年來研究者發(fā)現(xiàn)，胃腺癌中也存在一定比例K-ras基因突變，與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是胃癌發(fā)生的早期事件[13-15]。本研究顯示在胃印戒細胞癌中，K-ras基因突變率僅為12.2%，突變率較其他胃腺癌類型偏低，且突變位點集中在12密碼子，13密碼子未發(fā)現(xiàn)突變，說明在印戒細胞癌的發(fā)生發(fā)展中，K-ras基因突變不起主導作用，突變位點較其他類型胃腺癌也存在差異。與胃型和混合型病例相比，腸型病例有較高的K-ras基因突變率，這表明K-ras基因突變對胃、腸表型變化有重要作用，證實了這種免疫表型分型存在不同的分子遺傳學背景。本研究還顯示，K-ras基因突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、臨床分期等均無顯著相關(guān)性，因此進一步研究參與胃印戒細胞癌侵襲、轉(zhuǎn)移的信號傳導通路，闡明腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找新的分子治療靶點具有十分重要的意義。

由于腸型印戒細胞癌存在較高的ras蛋白表達和K-ras基因突變率，對其個體化治療有無價值，需要對ras及相關(guān)信號通路進一步研究。

[1]熊振芳,肖海,譚云山.早期胃印戒細胞癌免疫表型的臨床病理意義[J].中華病理學雜志,2010,39(7):442-446.

[2]Esteller M,Tovota M,Sanche Z,et al.Inactivation of the DNA repair gene with G to A mutations in K-ras in colorectal tumorigenesis[J].Cancer Res,2000,60(9):2368-2371.

[3] Kwon KJ，Shim KN，Song EM，et al． Clinicopathological characteristics and prognosis of signet ring cell carcinoma of the stomach[J]．Gastric Cancer，2014，17(1):43-53．

[4]PhalanusitthephaC，GrimesKL，IkedaH，etal．Endoscopicfeaturesofearlystagesignetringcellcarcinomaofthestomach[J]．WorldJGastrointestEndosc，2015，7(7):741-746.

[5]Cancer Genome Atlas Reseach Network.Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma[J].Nature,2014,513(7517):202-209.

[6] Taghavi S,Jayarajan SN,Davey A,et al.Prognostic significance of signet ring gastric cancer[J].J Clin Oncol,2012,30(28):3493-3498.

[7]Pernot S,Voron T,Perkins G,et al.Signet-ring cell carcinoma of the stomach:impact on prognosis and specific therapeutic challenge[J].World J Gastroenterol,2015,21(40):11428-11438.

[8]Japanese Gastric Cancer A.Japanese gastric cancer treatment guidelines 2010[J].Gastric Cancer,2011,14(2):113-123.

[9]Gimori Y,Inokuchi M,Takagi Y,et al.Prognostic value of RKIP and p-ERK in gastric cancer[J]．J Exp Clin Cancer Res，2012,31(1)：30．

[10]Atkar SS,Durham A,Brice A,et al．Systemic activation of K-Ras rapidly induces gastric hyperplasia and metaplasia in mice[J]．Am J Cancer Res，2011，1(4)：432-445．

[11]Okumura T,Erichsen RE,Takaishi S,et al.K-Ras mutation targeted to gastric tissue progenitor cells results in chronic inflammation，an altered microenvironment，and progression to intraepithelial neoplasia[J]．Cancer Res,2010，70(21)：8435-8445．

[12]Thorgeirsson UP,Turpeenniemi T,Williams JE,et al.NIH/3H3 cells transfected with human tumor DNA containing activated ras oncogenes express the metastatic phenotype in nude-mice[J].Mol Cell Biol,1985,5(1):259-263.

[13]Takahashi N,Yamada Y,Taniguchi H,et al.Clinicopathological features and prognostic roles of KRAS,BRAF,PIK3CA and NRAS mutations in advanced gastric cancer[J].BMC Res Notes,2014,7(1):271.

[14]Zimmermann G,Papke B,Ismail S,et al.Small molecular inhibition of the KRAS-PDE interaction impairs oncogenic KRAS signaling[J].Nature,2013,497(7451):638-642.

[15]Ostrem JM,Peters U,Sos ML,et al.K-Ras (G12C) inhibitors allosterically control GTP affinity and effector interactions[J].Nature,2013,503(7477):548-551.

Significance of K-ras gene status and ras protein expression in immunophenotypic classification of gastric signet ring cell carcinoma*

XiongQiuying1,XiongXin1,HuXiuhua2,TuLuxia1,XiongZhenfang1△

(1.DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China; 2.DepartmentofEmergencyWard,HongduChineseMedicineHospital,Nanchang,Jiangxi330038,China)

Objective To investigate the significance of K-ras gene status and ras protein expression in immunophenotypic classification of gastric signet ring cell carcinoma.Methods The expression of ras protein in 180 cases of gastric signet-ring cell carcinoma was detected by tissue microarray immunohistochemistry.Meanwhile,the mutation in codon 12,13 of K-ras gene was determined by using PCR-based DNA direct sequencing analysis.Results The rate of ras protein expression was 27.8%.The rate of ras protein expression in intestinal phenotype was significantly higher than those in gastric and gastrointestinal phenotypes(P<0.05).The rate of ras protein expression in cases with lymph node metastasis was significantly higher than those in cases without nodal involvement(P<0.05).The rate of ras protein expression was significantly higher in cases with deeper invasion(P<0.05).The frequency of K-ras gene mutation was 22(12.2%).All of them were found in codon 12.The types of mutation included GGT→AGT(1 case)，GGT→TGT(1 case)，GGT→GCT (2 cases),GGT→GTT (8 cases) and GGT→GAT(10 cases).K-ras mutation was significantly associated with intestinal phenotype(P<0.05).The rates of ras protein expression in cases with mutational type of K-ras gene was higher than those in cases with wild type(P<0.05).The ras protein expression was positively associated with K-ras gene mutation(r=0.61,P<0.05).Conclusion The ras protein expression is correlated with nodal involvement and invasion.K-ras gene mutation and expression of ras protein is related to phenotypic classification,and they might influence the phenotypic transformation in gastric signet ring cell carcinoma.

stomach neoplasms；genes,ras；proteins；signet ring cell carcinoma;K-ras gene;lymph node metastasis;targeting therapy

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.004

江西省衛(wèi)生計生委科技計劃項目(20155179)。 作者簡介：熊秋迎(1976-)，主管技師，本科，主要從事腫瘤分子病理學及病理技術(shù)方面研究。△

，E-mail:xiongzhenfang0408@126.com。

R735.2

A

1671-8348(2017)15-2027-03

2016-11-20

2017-01-08)