泛素特異性蛋白酶4對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響*

陳 燕，章 杰

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院皮膚外科，杭州 310020；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面整形外科，南昌 330006)

泛素特異性蛋白酶4對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響*

陳 燕1，章 杰2△

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院皮膚外科，杭州 310020；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面整形外科，南昌 330006)

目的 探討泛素特異性蛋白酶4(USP4)對(duì)增生性瘢痕(HS)成纖維細(xì)胞增殖的影響。方法 體外培養(yǎng)人HS成纖維細(xì)胞(HSFB)，并取第4代細(xì)胞用于試驗(yàn)。利用Vialinin A(USP4抑制劑)干預(yù)HS成纖維細(xì)胞，Western blot檢測(cè)干預(yù)細(xì)胞中不同時(shí)間段(0、12、24、48 h)USP4、TβRI及Smad7蛋白的表達(dá)，四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)法檢測(cè)Vialinin A對(duì)HS成纖維細(xì)胞增殖的影響，分為試驗(yàn)組和對(duì)照組(不作干預(yù))。結(jié)果 Vialinin A作用后，隨著時(shí)間推移，HSFB中的USP4蛋白表達(dá)逐漸減低，TβRI的蛋白也逐漸減低，在作用12 h后明顯降低(P<0.05)；Smad7的蛋白表達(dá)則逐漸升高(P<0.05)。Vialinin A同一濃度作用后，隨著時(shí)間推移，HSFB增殖活性逐漸受到抑制，試驗(yàn)組與對(duì)照組同一時(shí)間段比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 USP4可能通過(guò)調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路影響瘢痕細(xì)胞增殖，抑制其表達(dá)可使HS成纖維細(xì)胞增殖減慢。

泛素化；瘢痕，肥大性；成纖維細(xì)胞；泛素特異性蛋白酶4；增生性瘢痕；Vialinin A；增殖

增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是人體對(duì)創(chuàng)傷過(guò)度愈合反應(yīng)的結(jié)果，在臨床上非常多見，常表現(xiàn)為瘢痕形狀不規(guī)則、質(zhì)地堅(jiān)硬，嚴(yán)重影響外觀，有時(shí)伴有功能障礙，部分患者還會(huì)有疼痛和瘙癢感，甚至產(chǎn)生瘢痕潰爛、癌變可能[1-2]。雖然增生瘢痕的危害很大，但其病因和發(fā)病機(jī)制目前仍未完全清楚。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)的重要生物學(xué)功能正逐漸引起人們的重視。創(chuàng)面愈合過(guò)程中，TGF-β/Smad信號(hào)通路的持續(xù)激活，會(huì)導(dǎo)致HS的形成[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，泛素特異性蛋白酶(USP)4可增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路的水平，并與TβRI結(jié)合，抑制其泛素化降解，進(jìn)而提高胞膜上TβRI的表面分布水平[4]。但其在HS成纖維細(xì)胞中的影響少見報(bào)道。而Vialinin A是一種半選擇性的泛素特異性蛋白酶抑制劑，可較強(qiáng)地抑制USP4及USP5[5-6]，最初是從中國(guó)云南省發(fā)現(xiàn)的一種可食用的蘑菇蓮座革菌分離出來(lái)的小分子化合物，是一種三聯(lián)苯衍生物[6]。本試驗(yàn)從HS患者中切取HS組織，體外培養(yǎng)HS成纖維細(xì)胞，加入泛素特異性蛋白酶抑制劑Vialinin A抑制USP4表達(dá)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病理組織 取自2014年4至7月于本科行HS整形手術(shù)患者，男10例，女5例，年齡6～16歲。均體質(zhì)健康，近期未使用任何瘢痕藥物治療；瘢痕組織處于穩(wěn)定期(形成時(shí)間6～16個(gè)月)；以四肢、頸部為主，高于周圍正常皮膚，質(zhì)地硬，局部無(wú)感染及潰瘍，經(jīng)臨床和病理證實(shí)為HS組織并無(wú)惡變。本試驗(yàn)均征得患者同意并已簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，Vialinin A(美國(guó)Cayman公司)，胰蛋白酶-含0.25%乙二胺四乙酸(EDTA,美國(guó)Gibco公司)，二甲基亞砜(DMSO，北京Solarbio公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(北京Solarbio公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，美國(guó)Gibco公司)，兔抗人USP4多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，兔抗人TβRI多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，兔抗人Smad7多克隆抗體(武漢Boster公司)，兔抗人β-actin多克隆抗體(武漢Boster公司)，山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)-辣根過(guò)氧化物酶(HRP，北京Solarbio公司)，增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光液(北京Solarbio公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，超凈工作臺(tái)(美國(guó)Fisher公司)，倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)，TS-10高速離心機(jī)(湖南湘儀公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(芬蘭MμLtiskan Ascent公司)。

1.2 方法

1.2.1 人HSFB體外培養(yǎng) 采用林尊文等[7]的改良組織塊貼壁結(jié)合胰蛋白酶消化法體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞：從整形手術(shù)中切取HS在無(wú)菌操作條件下，迅速帶至實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)中(超凈臺(tái)預(yù)先紫外燈照射約1 h)放置在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，徹底去除表皮和脂肪組織，殘留白色質(zhì)硬的瘢痕組織PBS漂洗3次；用眼科剪將組織塊剪成0.5～1.0 mm3大小的微粒 ，加入0.25%的胰蛋白酶約1 mL浸沒組織塊，置于4 ℃冰箱中冷消化過(guò)夜；第2天PBS漂洗3次后(以去除殘留胰酶)，用1 mL注射器將組織塊接種至培養(yǎng)瓶中，組織塊間隙在0.3～0.5 cm，將已經(jīng)接種好的培養(yǎng)瓶豎立置于37 ℃，5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中干燥約1 h；緩慢取出培養(yǎng)瓶，分別加入約3 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液于各培養(yǎng)瓶中，使組織塊沒入培養(yǎng)液中，平放置于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每隔3～5 d換液1次。顯微鏡下觀察，適時(shí)去除漂浮及無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)組織塊，待組織塊周圍爬出的細(xì)胞基本融合成片，密度達(dá)80%以上時(shí)，將瓶底細(xì)胞按1∶2傳代培養(yǎng)。取第4代細(xì)胞用于試驗(yàn)研究。

1.2.2 VialininA 干預(yù)HSFB

1.2.2.1 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)USP4、TβRI及Smad7蛋白表達(dá) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HS成纖維細(xì)胞消化、離心及棄去上清液，加入2 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液混勻制成細(xì)胞懸液，取10 μL計(jì)數(shù)，確定細(xì)胞濃度，以每孔2×105密度將細(xì)胞接種到6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入適量含5 μmol/L Vialinin A的培養(yǎng)液，分別在0、12、24、48 h后收集細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒結(jié)合酶標(biāo)儀檢測(cè)對(duì)上述細(xì)胞蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，將上述已定量的蛋白樣本加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，沸水中煮10 min使蛋白充分變性，取總蛋白20 μg上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺(PAGE)電泳后濕法轉(zhuǎn)膜，隨后用5%脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜約2 h；將封閉好硝酸纖維素膜放入適當(dāng)稀釋度的兔抗人一抗溶液中4 ℃過(guò)夜，USP4、TβRI、Smad7及內(nèi)參β-actin分開孵育；應(yīng)用TBST洗膜后，將硝酸纖維素膜放入適當(dāng)稀釋度的山羊抗兔IgG二抗中室溫下孵育1 h。應(yīng)用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和灰度分析，結(jié)果以目的蛋白灰度值與β肌動(dòng)蛋白灰度值之比表示。

1.2.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取生長(zhǎng)良好的已被干預(yù)的HS成纖維細(xì)胞與未被干預(yù)的細(xì)胞分別常規(guī)消化、離心及吸棄上清液，收集細(xì)胞及重懸細(xì)胞，以每孔1×104/mL密度將已被Vialinin A干預(yù)的增生瘢痕成纖維細(xì)胞(試驗(yàn)組)與未干預(yù)的細(xì)胞(對(duì)照組)接種于96孔板，每孔為200 μL，即2 000 /孔，兩組細(xì)胞均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并各設(shè)置1個(gè)調(diào)零孔(即只加20 μL DMEM完全培養(yǎng)基)，以此方式再接種2塊96孔板；然后置于恒溫箱中培養(yǎng)，24 h后從培養(yǎng)箱中取出1塊板，在避光下向每孔加入20 μL MTT工作溶液，避光置于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)；加入150 μL DMSO于每個(gè)細(xì)胞孔中，避光置于搖床低速振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物；用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔吸光度值(A值)，波長(zhǎng)為490 nm，記錄并分析結(jié)果。48、72 h后分別取出1塊96孔板，按以上步驟測(cè)量各孔A值并記錄。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)觀察 HS培養(yǎng)的原代瘢痕成纖維細(xì)胞在光鏡下自第5天時(shí)可見單個(gè)呈梭形狀細(xì)胞從組織塊周圍爬出，第7天時(shí)可見較多細(xì)胞爬出，放射狀排列于組織塊周圍，倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，核圓，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)均勻，胞體豐滿。傳代后大部分細(xì)胞生長(zhǎng)良好，性狀穩(wěn)定。近3周時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)基本融合，可消化傳代。

2.2 Vialinin A對(duì)細(xì)胞內(nèi)USP4、TβRI及Smad7蛋白表達(dá)的影響 Vialinin A作用后，隨著時(shí)間推移，HSFB中的USP4蛋白表達(dá)逐漸減低；TβRI的蛋白也逐漸減低，在作用12 h后明顯降低，與0時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Smad7的蛋白表達(dá)則逐漸升高，與0時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A:Western blot蛋白條帶；B：不同時(shí)間段的HSFB中TβRI不同時(shí)間段的蛋白表達(dá)；C:不同時(shí)間段的Smad7與β-actin灰度值比較。

圖1 干預(yù)USP4后HSFB中TβRI與Smad7不同時(shí)間段的表達(dá)

2.3 Vialinin A對(duì)HS成纖維細(xì)胞增殖的影響 Vialinin A作用后，試驗(yàn)組中HSFB增殖活性明顯受到抑制，試驗(yàn)組與對(duì)照組組同一時(shí)間段A值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組Vialinin A對(duì)HSFB的A值比較值)

3 討 論

HS是成纖維細(xì)胞異常增殖，分泌大量膠原、基質(zhì)，引起膠原等基質(zhì)代謝合成與降解失衡，導(dǎo)致過(guò)多細(xì)胞外基質(zhì)分泌和沉積的一種纖維化疾病。至今，學(xué)術(shù)界對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究尚未有明確的定論，臨床上也尚無(wú)有效的治療方法?，F(xiàn)已證實(shí)多種細(xì)胞因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞外基質(zhì)參與瘢痕形成，而TGF-β/Smad信號(hào)通路是已被證明與瘢痕形成密切相關(guān)的機(jī)制[8-9]。其中，Smads根據(jù)不同分型，對(duì)成纖維細(xì)胞膠原代謝具有雙向調(diào)控作用。Smad7主要負(fù)調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路，TGF-β刺激后，Smad7移至胞質(zhì)中，與Smad3競(jìng)爭(zhēng)TβRI，進(jìn)而阻止Smad3活化，抑制TGF-β信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控正、負(fù)性Smads蛋白之間的平衡[10-11]。Smad7 還可通過(guò)E3泛素連接酶-Smurf (Smurf1和Smurf2)誘導(dǎo)Smad2與TβRI的泛素化降解，下調(diào)TβRI在胞膜上的分布水平，進(jìn)而負(fù)反饋?zhàn)饔糜赥GF-β/Smad信號(hào)通路[12]。

而泛素-蛋白酶體途徑是真核細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的蛋白質(zhì)降解調(diào)節(jié)系統(tǒng)，是進(jìn)化過(guò)程中高度保守的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，緊密地調(diào)節(jié)TGF-β家族信號(hào)[13]。它可通過(guò)對(duì)底物蛋白的泛素化進(jìn)行蛋白酶體降解,可影響多種細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞受體功能、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)及腫瘤生長(zhǎng)等[14]。該途徑也通過(guò)去泛素化酶(DUBs)逆轉(zhuǎn)泛素化過(guò)程。USP4是第1個(gè)在哺乳動(dòng)物中被確定的去泛素化酶，由原癌基因USP4編碼，作為DUBs中重要一員，USP4最初被報(bào)道可以與腫瘤抑制因子pRb和相關(guān)袋狀蛋白 p107、p130相互作用[15]。它主要通過(guò)與特異性靶蛋白結(jié)合使之去泛素化阻止其降解或改變性狀，在多種信號(hào)通路中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，比如Wnt/β-catenin 信號(hào)通路、固有免疫應(yīng)答通路及p53 信號(hào)通路，尤其在TGF-β/Smad信號(hào)通路[16]。其在TGF-β/Smad信號(hào)通路的潛在機(jī)制是TβRI通過(guò)Smad7/Smurf2復(fù)合體進(jìn)行泛素化降解，而USP4可與TβRI直接結(jié)合，使之去泛素化，介導(dǎo)泛素化與去泛素化平衡，維持TβRI在質(zhì)膜上的水平，調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路的水平。一系列體內(nèi)外試驗(yàn)也表明在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和斑馬魚胚胎中，USP4在調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。在對(duì)惡性乳腺癌細(xì)胞分析顯示，體外試驗(yàn)表明USP4可調(diào)節(jié)TGF-β誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移，體內(nèi)試驗(yàn)表明USP4可激活TGF-β/Smad信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移[17]。這項(xiàng)研究還表明USP4可被蛋白激酶B(AKT)磷酸化，磷酸化后使細(xì)胞核中的USP4重新定位于胞質(zhì)和胞膜，與TβRI結(jié)合，進(jìn)而去泛素化，增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的致瘤反應(yīng)。如果USP4缺失，則由AKT誘導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移也會(huì)受到抑制。由此可見，USP4通過(guò)選擇性介導(dǎo)TGF-β/Smad信號(hào)通路中關(guān)鍵組件的去泛素化，參與調(diào)控了TGF-β/Smad信號(hào)通路的水平。一旦其功能紊亂，就會(huì)使TGF-β/Smad信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，進(jìn)而引起一系列病生改變，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。

最新研究表明，USP4可去泛素化促進(jìn)Th17細(xì)胞功能并且可提高風(fēng)濕性心臟病患者的CD4+T細(xì)胞水平，進(jìn)一步利用Vialinin A抑制USP4活性，將可抑制Th17細(xì)胞分化，這意味著USP4有望成為Th17介導(dǎo)的自身免疫疾病的治療靶點(diǎn)[18]。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)USP4可通過(guò)去泛素化正向調(diào)節(jié)維甲酸誘導(dǎo)基因I(RIG-I)介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)，穩(wěn)定RIG-I的表達(dá)水平。Hou等[20]發(fā)現(xiàn)在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中USP4蛋白表達(dá)水平增加，并直接與受體相互作用蛋白1(RIP1)相互作用，使之去泛素化，負(fù)調(diào)控RIP1介導(dǎo)的NF-κB活性，促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的凋亡。因此這相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)USP4是屬于抑癌蛋白。然而Zhang等[21]的研究發(fā)現(xiàn)USP4可直接與TβRI結(jié)合，使之去泛素化，最終促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的乳腺癌的發(fā)展。由此可見，抑制USP4可負(fù)調(diào)控TGF-β信號(hào)通路，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，屬于癌蛋白。從以上研究不難看出關(guān)于USP4在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中功能尚無(wú)確切定論。

本試驗(yàn)以HS成纖維細(xì)胞為載體，利用Vialinin A(USP4抑制劑)干預(yù)HS成纖維細(xì)胞，分別在不同時(shí)間段收集細(xì)胞總蛋白行Western blot檢測(cè)及MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：USP4在Vialinin A作用12 h后，表達(dá)逐漸減低，說(shuō)明Vialinin A抑制USP4有效；TβRI的蛋白表達(dá)也在作用12 h后明顯降低，而Smad7蛋白表達(dá)則逐漸升高。并且本課題組前期發(fā)現(xiàn)USP4與TβRI蛋白在HS成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，而Smad7蛋白在HS成纖維細(xì)胞中低表達(dá)。綜合表明USP4可能通過(guò)調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路影響瘢痕細(xì)胞增殖。其次，MTT結(jié)果顯示：加入泛素特異性蛋白酶抑制劑Vialinin A后，HSFB的增殖活性逐漸減低，尤其在72 h明顯。以上結(jié)果可能暗示著USP4與TβRI相互作用，通過(guò)抑制Smad7介導(dǎo)的信號(hào)通路阻止TβRI的泛素化降解，從而維持TβRI的高水平和Smad7的低水平，抑制USP4表達(dá)，導(dǎo)致TβRI的低表達(dá)及Smad7的高表達(dá)，從而負(fù)調(diào)控TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)通路，抑制HS成纖維增殖，但其具體的分子機(jī)制還需深入研究。

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The effect of USP4 on the proliferation of human hypertrophic scar fibroblasts*

ChenYan1,ZhangJie2△

(1.DepartmentofSkinSurgery,SirRunRunShawHospitalSchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou,Zhejiang310020,China;2.OralandMaxillofacialPlasticSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To investigate the effects of USP4 on the proliferation of human hypertrophic scar fibroblasts(HSFB).Methods HSFB were cultured in vitro.The fourth generation of HSFB in logarithmic growth phase was selected in the experiment.HSFB were intervened by Vialinin A which was the inhibitor of USP4 for 0,12,24,48 h,then collected cells and the their expression of USP4 and TβRI and Smad7 protein was detected by Western blot.MTT assay was used to detect the effect of Vialinin A on the proliferation of HS fibroblasts and the cells were divided into experimental group and control group (without intervention).Results After treatment with Vialinin A in HSFB,the expression of USP4 and TβRI protein in HSFB decreased gradually,especially in 12 h(P<0.05),and Smad7 protein expression was increased gradually(P<0.05).The proliferative activity of intervened HSFB reduced gradually,the difference between experimental group and control group was statistically significant(P<0.05).Conclusion USP4 might inhibit the proliferation of scar cells and down-regulation of USP4 expression in hyperplastic scar fibroblasts,which can slow proliferative activity of intervened HSFB by regulating TGF-β/Smad signaling pathway.

ubiquitination；cicatrix,hypertrophic；fibroblast；USP4；hypertrophic scar；Vialinin A；proliferation

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460295)；江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(20155201)。 作者簡(jiǎn)介：陳燕(1988-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事瘢痕修復(fù)及皮膚美容方面研究?！?/p>

，E-mail:zhjprs@163.com。

R619.6

A

1671-8348(2017)15-2021-03

2016-11-22

2017-02-10)