• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    唑來膦酸對破骨細(xì)胞分化中CaMKⅡ δ及下游基因表達(dá)的影響*

    2017-06-05 14:57:37劉娟娟戚孟春
    重慶醫(yī)學(xué) 2017年10期
    關(guān)鍵詞:牙本質(zhì)骨細(xì)胞分化

    王 會,劉娟娟,戚孟春△,董 偉,李 任,孫 紅

    (華北理工大學(xué):1.口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科教研室;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,河北唐山 063000)

    論著·基礎(chǔ)研究

    唑來膦酸對破骨細(xì)胞分化中CaMKⅡ δ及下游基因表達(dá)的影響*

    王 會1,劉娟娟1,戚孟春1△,董 偉1,李 任1,孫 紅2

    (華北理工大學(xué):1.口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科教研室;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,河北唐山 063000)

    目的 研究唑來膦酸(ZOL)對破骨細(xì)胞分化中鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ δ(CaMKⅡδ)以及下游信號基因表達(dá)的影響。方法 將小鼠破骨前體細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞分為對照組和ZOL組;兩組細(xì)胞均用50 μg/L核因子κB受體激活蛋白配體(RANKL)誘導(dǎo)與第5天收獲,ZOL組同時加用1×10-6mol/L ZOL處理2 d。5 d后收獲細(xì)胞,檢測破骨細(xì)胞生成及CaMKⅡ δ、活化T細(xì)胞核因子蛋白c1(NFATc1)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)及c-Src基因表達(dá)情況。結(jié)果 ZOL組TRAP+多核破骨細(xì)胞數(shù)目、牙本質(zhì)吸收陷窩數(shù)目和面積分別是(20.0±3.2)、(18.0±4.2)和(6 335.3±1 043.2)μm2,顯著低于對照組的(36.0±8.4)、(37.2±5.0)和(11 636.2±3 661.1)μm2(P<0.05或P<0.01),分別下降了44.4%、51.6%和45.6%。ZOL處理還使破骨細(xì)胞分化中CaMKⅡδ及下游因子NFATc1、TRAP和c-Src 基因表達(dá)產(chǎn)生顯著抑制,mRNA水平分別下降了44.1%、49.0%、53.8%和49.6%(P<0.05或P<0.01),蛋白水平分別下降了43.5%、32.2%、45.5%和48.0%(P<0.05或P<0.01)。免疫熒光化學(xué)檢測顯示ZOL組CaMKⅡδ、NFATc1、TRAP和c-Src的熒光強度較對照組也明顯減弱。結(jié)論 ZOL可顯著抑制破骨細(xì)胞生成和骨吸收功能,并下調(diào)破骨細(xì)胞分化中CaMKⅡ δ及下游NFATc1、TRAP和c-Src基因表達(dá)。

    破骨細(xì)胞;唑來膦酸;鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱδ;活化T細(xì)胞核因子c1;抗酒石酸酸性磷酸酶;c-Src

    唑來磷酸(zoledronate,ZOL)能夠顯著抑制破骨細(xì)胞的生成及骨吸收功能,因而廣泛應(yīng)用于骨過度吸收性疾病[1];但其作用機制尚未弄清。鈣調(diào)蛋白(calmodulin)-活化T細(xì)胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells type c1,NFATc1)信號通路對破骨細(xì)胞的分化至關(guān)重要;而鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)是其中的關(guān)鍵信號分子[2-4]。CaMKⅡ有α、β、γ、δ 4個異構(gòu)體[5];國外學(xué)者研究顯示,異構(gòu)體δ對破骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用可能最為關(guān)鍵[6-7],但其是否參與ZOL誘發(fā)的破骨細(xì)胞抑制目前尚不清楚。本實驗通過檢測ZOL對CaMKⅡδ及其下游基因表達(dá)的影響,探討CaMKⅡδ在ZOL誘發(fā)的破骨細(xì)胞抑制中的作用,為唑來膦酸治療骨過度吸收性疾病提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株來自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;核因子-κB受體激活因子配體(RANKL)購自美國Biovision公司;DMEM培養(yǎng)基、唑來膦酸、胎牛血清購自中國四季青公司;兔抗鼠CaMKⅡ δ多克隆抗體、β-actin單克隆抗、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)單克隆抗體、NFATc1單克隆抗體、c-Src單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;TRAP染色試劑盒、異硫氰酸熒光素(FITC)、碘化丙啶(PI)購自美國Sigma公司;PCR引物購自上海生工;激光聚焦顯微鏡(LSCM)購自日本Olympus公司);Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀購自美國gene company limited。

    表1 Real-time PCR使用基因引物

    1.2 方法 RAW264.7細(xì)胞分為對照組和ZOL組。兩組細(xì)胞均用含50 μg/L RANKL的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d,使細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化;ZOL組在RANKL誘導(dǎo)1 d后,加用1×10-6mol/L ZOL處理2 d[8],繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.2.1 破骨細(xì)胞生成及功能檢測 (1)TRAP染色:細(xì)胞以5×103/cm2密度種在載玻片上制備細(xì)胞爬片。收獲細(xì)胞后,按TRAP試劑盒說明進(jìn)行染色,光鏡200倍下選取6個視野,計數(shù)TRAP+多核細(xì)胞數(shù)目(細(xì)胞核大于或等于3個),取平均值;每組檢測3個細(xì)胞爬片[8]。(2)牙本質(zhì)吸收陷窩檢測:用新鮮拔除的下頜阻生智齒制備厚約0.2 mm的牙本質(zhì)磨片,超聲震蕩,高溫高壓滅菌;細(xì)胞接種密度為5×103個/cm2。細(xì)胞收獲后掃描電鏡(Scanning Electron Microscope,SEM)觀察,500倍下每個磨片上選取6個視野,測量吸收陷窩總數(shù)目及總面積,取平均值,作為該磨片的吸收陷窩數(shù)目及面積;每組檢測3個牙本質(zhì)磨片[8]。

    1.2.2 CaMKⅡ δ及其下游因子NFATc1、TRAP、c-Src基因表達(dá)檢測

    1.2.2.1 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測 以5×103個/cm2密度接種在激光共聚焦皿里。5 d后收獲細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,4%多聚甲醛固定30 min,0.4%的TritonX-100 PBS室溫孵育25 min,單克隆抗體一抗4 ℃過夜,F(xiàn)ITC標(biāo)記為二抗,37 ℃避光孵育90 min,PI復(fù)染胞核,甘油封片,激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察,每個共聚焦小皿隨機檢測6個視野,實驗重復(fù)3次。

    1.2.2.2 Real-time PCR檢測 Trizol法提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;在Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀上檢測;引物見表1。反應(yīng)條件為:95 ℃,30 s;95 ℃ 15 s,56 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,45個循環(huán)。計算目的基因mRNA相對表達(dá)量;每個因子設(shè)3個復(fù)孔。

    1.2.2.3 Western blot檢測 加蛋白酶抑制劑(RIPA)提取細(xì)胞總蛋白,Bradford法測蛋白濃度;加入1×buffer后,煮沸5 min變性;蛋白上樣,凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜;室溫封閉1 h,一抗4 ℃過夜,二抗37 ℃孵育35 min,ECL顯色儀上顯色。用Image-Lab分析軟件檢測膜上條帶光密度值;實驗重復(fù)3次。

    2 結(jié) 果

    2.1 ZOL對破骨細(xì)胞的生成和骨吸收功能影響 RANKL誘導(dǎo)5 d后,兩組均出現(xiàn)TRAP+多核破骨細(xì)胞(細(xì)胞質(zhì)紅染),見圖1 ;與對照組比較,ZOL組多核破骨細(xì)胞顯著減少,破骨細(xì)胞下降了44.4%(P<0.05),見表2。掃描電鏡(SEM)觀察,兩組牙本質(zhì)磨片上均出現(xiàn)不同程度的吸收陷窩;ZOL組吸收陷窩的數(shù)目和面積均顯著少于對照組(P<0.05或P<0.01),見表2,分別下降了51.6%和45.6%。ZOL可顯著抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能。

    A:對照組TRAP染色;B:ZOL組TRAP染色;C:對照組牙本質(zhì)吸收陷窩檢測;D:ZOL組牙本質(zhì)吸收陷窩檢測。

    圖1 破骨細(xì)胞生成與功能

    2.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src表達(dá) 經(jīng)檢測,CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src在兩組細(xì)胞中均有表達(dá);但在對照組中熒光較強;而在ZOL組中則表達(dá)明顯較弱(圖2,F(xiàn)ITC標(biāo)記靶蛋白,PI標(biāo)記細(xì)胞核)。ZOL對破骨細(xì)胞分化中CaMKⅡ δ以及下游因子NFATc1、TRAP、c-Src蛋白表達(dá)均產(chǎn)生了顯著的抑制作用。

    2.3 Real-time PCR檢測CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src mRNA水平 經(jīng)Real-time PCR分析,CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src在兩組中都有表達(dá),但ZOL組mRNA水平明顯下降。ZOL組CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src mRNA水平分別為0.595±0.007、0.503±0.014、0.474±0.006和0.494±0.016,顯著低于對照組的1.065±0.066、0.986±0.013、1.026±0.070和0.981±0.016(P<0.05或P<0.01),較對照組分別下降了44.1%、49.0%、53.8%和49.6%。唑來膦酸顯著下調(diào)了破骨細(xì)胞分化中CaMKⅡ δ及下游NFATc1、TRAP、c-Src mRNA水平。

    表2 破骨細(xì)胞計數(shù)及牙本質(zhì)磨片吸收陷窩定量分析

    a:P<0.05,與對照組比較;b:P<0.01,與對照組比較。

    圖2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測CaMKⅡ δ及其下游基因在兩組破骨細(xì)胞中表達(dá)(LSCM×400)

    組別CaMKⅡδNFATc1TRAPc-Src對照組205.104±13.006243.283±10.200169.350±12.089223.276±11.830ZOL組115.921±5.891164.849±11.82592.322±8.307116.040±11.655t10.8188.6999.09611.183P<0.05<0.01<0.01<0.01

    圖3 Western blot檢測兩組中CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src蛋白表達(dá)

    2.4 Western blot檢測CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src蛋白表達(dá) 經(jīng)Western-blot檢測,ZOL組中CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src的蛋白表達(dá)量較對照組明顯減弱(圖3);定量數(shù)據(jù)分析顯示(表3),ZOL組中CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP和c-Src蛋白條帶光密度值較對照組分別下降了43.5%、32.2%、45.5%和48.0%(P<0.01或P<0.05)。上述結(jié)果說明,ZOL能夠顯著降低CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src蛋白表達(dá),從而對破骨細(xì)胞的生成產(chǎn)生抑制作用。

    3 討 論

    臨床上牙周炎、骨腫瘤、種植體周圍炎等疾病造成的骨過度吸收均與破骨細(xì)胞數(shù)目及活性異常有關(guān)[9];ZOL作為臨床上治療骨過度吸收性疾病的常用藥物,主要通過抑制破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能發(fā)揮作用[1]。在本研究中,應(yīng)用1×10-6mol/L ZOL處理RANKL誘導(dǎo)下的RAW264.7細(xì)胞48 h,發(fā)現(xiàn)TRAP+多核破骨細(xì)胞生成及骨吸收功能受到顯著抑制,破骨細(xì)胞數(shù)及牙本質(zhì)吸收陷窩顯著少于未經(jīng)處理的對照組;從而進(jìn)一步證實了ZOL對破骨細(xì)胞的抑制功能。需要指出的是,ZOL加入的時間為RANKL誘導(dǎo)第2~3天,此時正是單核破骨細(xì)胞向多核破骨細(xì)胞融合,即細(xì)胞多核化階段;因而上述結(jié)果證實,ZOL可在破骨細(xì)胞分化中期,即破骨細(xì)胞多核化階段發(fā)揮對破骨細(xì)胞的抑制作用,從而影響破骨細(xì)胞的生成及后期的骨吸收功能。破骨細(xì)胞分化相關(guān)信號通路研究近年來取得了許多進(jìn)展,其中NFATc1信號通路的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是一個重要突破[2-4]。在該信號通路中,CaMKs是Calmodulin下游Ca2+信號傳遞的重要分子;在CaMKs中,CaMK Ⅱ和CaMK Ⅳ在破骨細(xì)胞分化中的作用尤為重要。CaMK Ⅳ對破骨細(xì)胞分化的作用已證實[4],而CaMK Ⅱ相關(guān)研究尚無明確定論。Park-Min等[10]發(fā)現(xiàn), RANKL刺激可使破骨細(xì)胞分化中CaMK Ⅱ磷酸化;William等[11]研究顯示,RANKL顯著提高了破骨細(xì)胞中CaMKⅡ 的活性,提示CaMKⅡ 在破骨細(xì)胞分化中可能發(fā)揮著重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),唑來膦酸可顯著抑制破骨細(xì)胞分化中CaMKⅡ 和CaMK Ⅳ基因表達(dá)[8,12],進(jìn)一步說明了CaMKⅡ可能發(fā)揮的作用。

    CaMKⅡ有ɑ、β、γ、δ四種異構(gòu)體[5];在破骨細(xì)胞分化過程中異構(gòu)體ɑ、β表達(dá)較弱或幾乎不表達(dá),而異構(gòu)體δ表達(dá)則較強[4,6-7];提示CaMKⅡδ與破骨細(xì)胞分化密切相關(guān);而CaMKⅡδ是否參與了ZOL對破骨細(xì)胞生成的抑制,目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),唑來膦酸處理可使破骨細(xì)胞分化中CaMKⅡ δ基因表達(dá)在mRNA及蛋白水平均顯著下降,提示該因子可能參與了ZOL對破骨細(xì)胞分化的抑制。

    NFATc1是破骨細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)基因,參與Cathepsin K、TRAP、integrin β3、c-Src、DC-STAMP、Atp6v0d2等許多破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)的調(diào)控,對破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能至關(guān)重要[2,13-14]。NFATc1基因敲除的胚胎干細(xì)胞不能向破骨細(xì)胞分化;而NFATc1過表達(dá)則在沒有RANKL的條件下骨髓基質(zhì)細(xì)胞依然能分化成破骨細(xì)胞[15]。本研究中,ZOL處理使破骨細(xì)胞分化中NFATc1、TRAP、c-Src蛋白及mRNA水平均較對照組顯著降低;提示上述因子參與了ZOL對破骨細(xì)胞生成的抑制;鑒于NFATc1在破骨細(xì)胞分化中的作用,其表達(dá)下調(diào)可能是ZOL誘發(fā)的破骨細(xì)胞生成抑制的主要原因。

    有關(guān)CaMKⅡδ調(diào)控NFATc1基因表達(dá)及破骨細(xì)胞分化的機制,目前尚不清楚。Chang等[6]研究認(rèn)為,CaMKⅡ與CaMK Ⅳ一樣[4],通過cAMP response element (CRE)-binding protein(CREB)及c-fos信號通路來發(fā)揮作用;而Yao 等[7]則認(rèn)為,CaMKⅡδ 具有拮抗CREB 信號通路的作用,因而支持Park-Min等[10]的研究結(jié)論,即CaMKⅡδ 通過MEK-ERK 信號通路來發(fā)揮對破骨細(xì)胞的調(diào)控作用。然而,CaMKⅡδ是怎樣調(diào)控NFATc1基因表達(dá)及破骨細(xì)胞分化的?有哪些信號分參與其中,尚待進(jìn)一步研究。

    本研究表明,唑來膦酸可顯著抑制破骨細(xì)胞生成及CaMKⅡδ、NFATc1、TRAP、c-Src基因表達(dá);唑來膦酸對破骨細(xì)胞生成的抑制與上述因子表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

    [1]Roelofs AJ,Thompson K,Ebetino FH,et al.Bisphosphonates:molecular mechanisms of action and effects on bone cells,monocytes and macrophages[J].Curr Pharm Des,2010,16(27):2950-2960.

    [2]Negishi-Koga T,Takayanagi H.Ca2+-NFATc1 signaling is an essential axis of osteoclast differentiation[J].Immunol Rev,2009,231(1):241-256.

    [3]Zhang L,Mckenna M,Said-Al-Naief N,et al.Osteoclastogenesis:the role of Calcium and calmodulin[J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr,2005,15(1):1-13.

    [4]Sato K,Suematsu A,Nakashima T,et al.Regulation of osteoclast differentiation and function by the CaMK-CREB pathway[J].Nat Med,2006,12(12):1410-1416.

    [5]Colbran RJ.Targeting of Calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ[J].Biochemical Journal,2004,378(1):1-16.

    [6]Chang EJ,Ha J,Huang H,et al.The JNK-dependent CaMK pathway restrains the reversion of committed cells during osteoclast differentiation[J].J Cell Sci,2008,121(Pt 15):2555-2564.

    [7]Yao CH,Zhang P,Zhang L.Differential protein and mRNA expression of CaMKs during osteoclastogenesis and its functional implications[J].Biochem Cell Biol,2012,90(4):532-539.

    [8]李鵬,林玨杉,張鵬,等.唑來膦酸對破骨細(xì)胞分化中鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ基因表達(dá)的影響[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,2013,48(11):694-698.

    [9]Edwards JR,Weivoda MM.Osteoclasts:malefactors of disease and targets for treatment[J].Discov Med,2012,70(3):201-210.

    [10]Park-Min KH,Ji JD,Antoniv T,et al.IL-10 supresses calcium-mediated costimulation of receptor activator NF-kappa B signaling during human osteoclast differentiation by inhibiting.TREM-2 expression[J].J Immunol,2009,183(4):2444-2455.

    [11]Williams JP,Micoli K,Mcdonald JM.Calmodulin-an often ignored signal in osteoclasts[J].Ann N Y Acad Sci,2010(1192):358-364.

    [12]劉娟娟,李鵬,董偉,等.唑來膦酸對破骨細(xì)胞分化中鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ和Ⅳ基因表達(dá)的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2016,42(1):19-23.

    [13]Zhao Q,Wang X,Liu Y,et al.NFATc1:functions in osteoclasts[J].Int J Biochem Cell Biol,2010,42(5):576-579.

    [14]Seales EC,Micoli KJ,Mcdonald JM.Calmodulin is a critical regulator of osteoclastic differentiation,function,and survival[J].J Cell Biochem,2006,97(1):45-55.

    [15]Takayanagi H,Kim S,Koga T,et al.Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) integrate RANKL signaling in terminal differentiation of osteoclasts[J].Dev Cell,2002,3(6):889-901.

    Effects of zoledronate on CaMKⅡ δ and down-stream gene expressions during osteoclast differentiation*

    WangHui1,LiuJuanjuan1,QiMengchun1△,DongWei1,LiRen1,SunHong2

    (1.TeachingandResearchingSectionofOralandMaxillofacialSurgery,CollegeofStomatology;2.TeachingandResearchingSectionofPathology,CollegeofBasicMedicine,North-ChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei063000,China)

    Objective To study the effect of zoledronate (ZOL) on Ca2+/calmodulin-dependent kinase Ⅱ δ (CaMKⅡδ) and down-stream gene expressions during osteoclast differentiation.Methods Mouse osteoclast precursors RAW264.7 cells were divided into the control group and ZOL group.The cells in both groups were induced with 50 μg/L receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL) and were harvested on 5 d,while the cells in ZOL group were also simultaneously treated with 1×10-6mol/L ZOL for 2 d.Five days later,the cells were harvested and examined osteoclastogenesis,as well as gene expressions of CaMKⅡδ,nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1 (NFATc1),tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and cell-sarcoma receptor coactivator (c-Src).Results The number of TRAP positive multinuclear osteoclasts,number and size of dentin absorption lacunae and area in the ZOL group were (20.0±3.2),(18.0±4.2) and (6 335.3±1 043.2)μm2respectively,which were significantly lower than (36.0±8.4),(37.2±5.0) and (11 636.2±3 661.1)μm2in the control group and decreased by 44.4%,51.6% and 45.6% respectively (P<0.01).ZOL also significantly inhibited the gene expressions of CaMKⅡ δ,NFATc1,TRAP and c-Src,and the mRNA levels of these genes were decreased by 44.1%,49.0%,53.8% and 49.6% respectively,the protein level were decreased by 43.5%,32.2%,45.5% and 48.0% respectively.The immunofluorescent cytochemistry detection results showed the fluorescence intensity of CaMKⅡδ,NFATc1,TRAP and c-Srcin in the ZOL group was significantly weakened when compared with the control group.Conclusion ZOL could significantly inhibit the osteoclast formation and bone absorption function,and down-regulates gene expressions of CaMKⅡ δ,NFATc1,TRAP and c-Src in osteoclast differentiation.

    osteoclasts;zoledronic acid;Ca2+/calmodulin-dependent kinase Ⅱ δ;nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1;tartrate-resistant acid phosphatase;c-Src

    10.3969/j.issn.1671-8348.2017.10.004

    國家自然科學(xué)基金資助項目(81270965);河北省教育廳重點項目(ZD2015005)。 作者簡介:王會(1983-),碩士,主要從事唑來膦酸對破骨細(xì)胞分化中作用機制的研究?!?/p>

    ,E-mail:qimengchun@163.com。

    R782

    A

    1671-8348(2017)10-1308-04

    2016-10-28

    2017-01-24)

    猜你喜歡
    牙本質(zhì)骨細(xì)胞分化
    機械應(yīng)力下骨細(xì)胞行為變化的研究進(jìn)展
    兩次中美貨幣政策分化的比較及啟示
    調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能的相關(guān)信號分子的研究進(jìn)展
    治療牙本質(zhì)敏感驗方
    分化型甲狀腺癌切除術(shù)后多發(fā)骨轉(zhuǎn)移一例
    骨細(xì)胞在正畸牙移動骨重塑中作用的研究進(jìn)展
    Ⅲ型牙本質(zhì)發(fā)育不全(殼牙)伴多生牙1例
    Single Bond Universal牙本質(zhì)粘結(jié)強度及牙本質(zhì)保護(hù)作用的實驗研究
    Cofilin與分化的研究進(jìn)展
    3M Adper Prompt自酸蝕黏結(jié)劑治療超聲潔牙術(shù)后牙本質(zhì)敏感癥的臨床觀察
    村上凉子中文字幕在线| 在线看三级毛片| 岛国在线免费视频观看| 久久精品综合一区二区三区| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲av美国av| 在线观看免费视频日本深夜| 伊人久久精品亚洲午夜| 性欧美人与动物交配| 校园人妻丝袜中文字幕| 精品乱码久久久久久99久播| 热99在线观看视频| 成人av一区二区三区在线看| 99视频精品全部免费 在线| 国内精品一区二区在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久人妻av系列| 真实男女啪啪啪动态图| 最新在线观看一区二区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品欧美国产一区二区三| 在现免费观看毛片| 午夜精品在线福利| 99riav亚洲国产免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲美女黄片视频| 午夜免费成人在线视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美又色又爽又黄视频| av在线观看视频网站免费| 日韩欧美 国产精品| 熟女电影av网| 国产精品久久久久久久电影| 又紧又爽又黄一区二区| 免费无遮挡裸体视频| 色5月婷婷丁香| 老司机深夜福利视频在线观看| 欧美日本视频| av在线亚洲专区| 免费无遮挡裸体视频| 女同久久另类99精品国产91| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 伊人久久精品亚洲午夜| 伊人久久精品亚洲午夜| 成年版毛片免费区| 成人特级黄色片久久久久久久| 精品一区二区三区人妻视频| 一区二区三区高清视频在线| 一区二区三区高清视频在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| 男人舔奶头视频| 成人国产一区最新在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 我的老师免费观看完整版| 日本黄大片高清| 精品一区二区三区人妻视频| 日韩一本色道免费dvd| 国产精品99久久久久久久久| 99热精品在线国产| 免费黄网站久久成人精品| 欧美高清性xxxxhd video| 欧美色视频一区免费| 久久亚洲真实| 国模一区二区三区四区视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 午夜免费激情av| 亚洲欧美日韩高清专用| 一进一出抽搐动态| 少妇人妻精品综合一区二区 | 男女那种视频在线观看| 国产成人a区在线观看| 联通29元200g的流量卡| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日日夜夜操网爽| av在线亚洲专区| 看十八女毛片水多多多| 国产精品1区2区在线观看.| 又紧又爽又黄一区二区| 午夜福利高清视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 成人特级黄色片久久久久久久| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲成人久久性| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产一区二区三区av在线 | 在线看三级毛片| 免费看av在线观看网站| 三级毛片av免费| 99久国产av精品| 男女那种视频在线观看| 成人综合一区亚洲| 99热这里只有是精品50| 国产综合懂色| 黄色欧美视频在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 18+在线观看网站| 免费看光身美女| 我的老师免费观看完整版| 日韩精品青青久久久久久| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | avwww免费| 香蕉av资源在线| 久久精品综合一区二区三区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产黄色小视频在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲av一区综合| 在线观看美女被高潮喷水网站| 男女之事视频高清在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 禁无遮挡网站| x7x7x7水蜜桃| 直男gayav资源| 99热这里只有是精品50| 国产精品亚洲美女久久久| 成年版毛片免费区| 男人舔奶头视频| 久久这里只有精品中国| 97超视频在线观看视频| 久久6这里有精品| 精品一区二区三区视频在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品野战在线观看| 内射极品少妇av片p| 一个人看的www免费观看视频| 动漫黄色视频在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 午夜a级毛片| 97超视频在线观看视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 美女cb高潮喷水在线观看| 一级黄片播放器| 久久久久久久久久久丰满 | 国产高清不卡午夜福利| 日韩人妻高清精品专区| 五月伊人婷婷丁香| 午夜福利18| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美一区二区亚洲| 色播亚洲综合网| 亚洲国产色片| 欧美3d第一页| 中文字幕久久专区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| av.在线天堂| 国产精品无大码| 亚洲自偷自拍三级| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲四区av| 国产中年淑女户外野战色| 九九爱精品视频在线观看| 日日夜夜操网爽| 欧美不卡视频在线免费观看| 97碰自拍视频| 欧美精品国产亚洲| 日本免费a在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲av.av天堂| 精品免费久久久久久久清纯| 一本一本综合久久| 午夜激情福利司机影院| 欧美最黄视频在线播放免费| 精品福利观看| 亚洲真实伦在线观看| 88av欧美| 欧美黑人巨大hd| 午夜精品在线福利| 国产精品久久电影中文字幕| 中文资源天堂在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 两个人视频免费观看高清| 精品一区二区三区视频在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 在线观看舔阴道视频| 身体一侧抽搐| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | av在线天堂中文字幕| 好男人在线观看高清免费视频| 国产久久久一区二区三区| 亚洲性久久影院| av在线蜜桃| 亚洲精品成人久久久久久| 欧美一区二区国产精品久久精品| 午夜福利视频1000在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久久久久久中文| 国产老妇女一区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成熟少妇高潮喷水视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 日韩欧美 国产精品| 国产私拍福利视频在线观看| 岛国在线免费视频观看| 亚洲欧美激情综合另类| 国产在线精品亚洲第一网站| 韩国av一区二区三区四区| 一区二区三区高清视频在线| 色吧在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 九九爱精品视频在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲精品一区av在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 精品久久久久久久末码| 免费看日本二区| 在线播放无遮挡| 中文字幕av成人在线电影| 88av欧美| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品综合久久久久久久免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 99精品久久久久人妻精品| 老女人水多毛片| 婷婷精品国产亚洲av| av国产免费在线观看| 九九热线精品视视频播放| 好男人在线观看高清免费视频| 高清在线国产一区| 日本熟妇午夜| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产欧美日韩精品亚洲av| 天天躁日日操中文字幕| 免费看日本二区| av专区在线播放| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 性插视频无遮挡在线免费观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 波多野结衣巨乳人妻| 精品人妻偷拍中文字幕| 长腿黑丝高跟| 久9热在线精品视频| 99久久精品一区二区三区| 国产精品久久久久久久电影| 黄色女人牲交| 日本免费a在线| 亚洲欧美激情综合另类| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产极品精品免费视频能看的| 久久中文看片网| 男插女下体视频免费在线播放| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 一区二区三区激情视频| 亚洲av免费在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲国产高清在线一区二区三| 88av欧美| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲一区二区三区色噜噜| 长腿黑丝高跟| 美女 人体艺术 gogo| 波多野结衣巨乳人妻| 免费看a级黄色片| 18禁在线播放成人免费| 国产69精品久久久久777片| av在线亚洲专区| 亚洲乱码一区二区免费版| a级毛片免费高清观看在线播放| 在线免费观看不下载黄p国产 | 免费电影在线观看免费观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 夜夜夜夜夜久久久久| 啦啦啦韩国在线观看视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产高清视频在线观看网站| 美女免费视频网站| 欧美成人性av电影在线观看| 观看免费一级毛片| 亚洲成人久久性| 搡老妇女老女人老熟妇| 日韩欧美国产在线观看| 午夜福利高清视频| 一级毛片久久久久久久久女| av女优亚洲男人天堂| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美激情在线99| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产高清视频在线播放一区| 波多野结衣高清作品| 免费观看的影片在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 色哟哟哟哟哟哟| 十八禁网站免费在线| 日韩亚洲欧美综合| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲av中文av极速乱 | 国产高清三级在线| 免费在线观看影片大全网站| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 日韩精品有码人妻一区| 午夜免费激情av| a级一级毛片免费在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 听说在线观看完整版免费高清| 女人被狂操c到高潮| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| eeuss影院久久| 亚洲va在线va天堂va国产| 窝窝影院91人妻| 国产三级在线视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 中文在线观看免费www的网站| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 久久亚洲真实| 男女那种视频在线观看| 久久精品91蜜桃| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 一本一本综合久久| 麻豆一二三区av精品| 日韩精品有码人妻一区| 国产成人影院久久av| 精品国内亚洲2022精品成人| 日本五十路高清| 亚洲黑人精品在线| 日本一本二区三区精品| 国产av在哪里看| 中亚洲国语对白在线视频| 窝窝影院91人妻| 深夜a级毛片| 亚洲欧美日韩高清专用| 久久久久久久久中文| 五月伊人婷婷丁香| 禁无遮挡网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 99精品久久久久人妻精品| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品,欧美在线| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 我的女老师完整版在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 日本熟妇午夜| 色吧在线观看| 美女高潮的动态| 在线天堂最新版资源| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| or卡值多少钱| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲成人久久性| 日本爱情动作片www.在线观看 | 乱码一卡2卡4卡精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 成人二区视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久久久国产a免费观看| 老司机福利观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 很黄的视频免费| 不卡视频在线观看欧美| 美女黄网站色视频| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 高清日韩中文字幕在线| 三级毛片av免费| 亚洲经典国产精华液单| 少妇的逼好多水| 中出人妻视频一区二区| 波野结衣二区三区在线| 少妇的逼好多水| 亚洲avbb在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲av一区综合| 亚洲第一电影网av| 波多野结衣高清无吗| 午夜福利在线观看吧| 国产激情偷乱视频一区二区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 精品久久久久久久末码| 午夜激情欧美在线| 99热6这里只有精品| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久亚洲真实| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产高清激情床上av| 国产成人aa在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 88av欧美| 午夜福利成人在线免费观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 天美传媒精品一区二区| 中文字幕久久专区| 久久亚洲精品不卡| 午夜爱爱视频在线播放| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 十八禁网站免费在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 深爱激情五月婷婷| 亚洲avbb在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 欧美激情在线99| 在线播放无遮挡| 美女黄网站色视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产高潮美女av| 中国美女看黄片| 色5月婷婷丁香| 欧美精品国产亚洲| 亚洲精品456在线播放app | 亚州av有码| 亚洲一区高清亚洲精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日本 欧美在线| 亚洲无线观看免费| 精品乱码久久久久久99久播| 51国产日韩欧美| 日本黄色视频三级网站网址| 制服丝袜大香蕉在线| 十八禁国产超污无遮挡网站| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 99riav亚洲国产免费| 老司机深夜福利视频在线观看| 色综合站精品国产| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 不卡视频在线观看欧美| 男女边吃奶边做爰视频| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 波多野结衣巨乳人妻| 88av欧美| 又爽又黄a免费视频| 久久精品国产自在天天线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 成年女人看的毛片在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 嫩草影视91久久| 禁无遮挡网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美三级亚洲精品| 日韩av在线大香蕉| 中文字幕av在线有码专区| av国产免费在线观看| 在线观看午夜福利视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 色哟哟·www| 国产高清三级在线| 午夜福利欧美成人| 两人在一起打扑克的视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 最后的刺客免费高清国语| 欧美精品啪啪一区二区三区| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 级片在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 极品教师在线免费播放| 极品教师在线视频| 成年版毛片免费区| 国产高清激情床上av| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲国产色片| 直男gayav资源| 午夜视频国产福利| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 色哟哟哟哟哟哟| 精品久久久久久久末码| 不卡视频在线观看欧美| 舔av片在线| 中文字幕av在线有码专区| 国产高清视频在线观看网站| 黄色丝袜av网址大全| 色噜噜av男人的天堂激情| 一级av片app| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲不卡免费看| 日本成人三级电影网站| 69人妻影院| 中文资源天堂在线| 免费电影在线观看免费观看| 午夜老司机福利剧场| 国产伦在线观看视频一区| 色吧在线观看| bbb黄色大片| 在线a可以看的网站| 岛国在线免费视频观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 午夜免费激情av| 99久久九九国产精品国产免费| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品国内亚洲2022精品成人| 99热只有精品国产| 在线播放国产精品三级| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美3d第一页| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产午夜精品论理片| 国产精品日韩av在线免费观看| 中文字幕久久专区| 国产精品人妻久久久影院| 日本三级黄在线观看| 黄片wwwwww| 极品教师在线视频| 一级a爱片免费观看的视频| 在线看三级毛片| 一区二区三区高清视频在线| 午夜精品在线福利| 一区二区三区激情视频| 久久久久九九精品影院| 熟女电影av网| 桃红色精品国产亚洲av| 伦理电影大哥的女人| 久久久久久久精品吃奶| 免费看光身美女| 观看美女的网站| 成人永久免费在线观看视频| 99九九线精品视频在线观看视频| 麻豆一二三区av精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 黄色女人牲交| 亚洲国产精品久久男人天堂| 精品久久久久久久久亚洲 | 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 日韩欧美 国产精品| 国产淫片久久久久久久久| 国产高清视频在线播放一区| 久久久国产成人免费| 国产极品精品免费视频能看的| 午夜免费激情av| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲四区av| 三级国产精品欧美在线观看| av女优亚洲男人天堂| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲 国产 在线| 韩国av在线不卡| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 两人在一起打扑克的视频| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲图色成人| 99久久中文字幕三级久久日本| 黄色欧美视频在线观看| 色综合站精品国产| 尾随美女入室| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产伦人伦偷精品视频| 国产免费男女视频| 两个人视频免费观看高清| 看十八女毛片水多多多| 一边摸一边抽搐一进一小说| 全区人妻精品视频| 亚洲最大成人手机在线| 国内精品美女久久久久久| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 22中文网久久字幕| av女优亚洲男人天堂| 亚洲精品亚洲一区二区| 午夜激情福利司机影院| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品伦人一区二区| 久久精品国产自在天天线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产免费av片在线观看野外av| 老女人水多毛片| 免费电影在线观看免费观看| 国产探花在线观看一区二区| 久久久久久大精品| 色5月婷婷丁香| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 成年版毛片免费区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产高清不卡午夜福利| 男人和女人高潮做爰伦理| 在线天堂最新版资源| 成人av在线播放网站| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 国产熟女欧美一区二区| a在线观看视频网站| av在线蜜桃| 少妇人妻精品综合一区二区 | 超碰av人人做人人爽久久| 搞女人的毛片| 嫩草影院新地址| 一级黄色大片毛片| 久久国内精品自在自线图片| 在线观看av片永久免费下载| 久99久视频精品免费| 久久久午夜欧美精品|