桉木APMP制漿廢水抽出物提取及其抑藻效應(yīng)研究

程富江， 劉廷志， 李祥祥， 亓 暉， 鐘麗鳴

(天津科技大學(xué) 造紙學(xué)院；天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

桉木APMP制漿廢水抽出物提取及其抑藻效應(yīng)研究

CHENG Fujiang

程富江， 劉廷志*， 李祥祥， 亓 暉， 鐘麗鳴

(天津科技大學(xué) 造紙學(xué)院；天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

采用乙酸乙酯和甲基叔丁基醚2種有機(jī)溶劑對(duì)自制桉木堿性過(guò)氧化氫機(jī)械漿(APMP)制漿廢水進(jìn)行有機(jī)物提取，采用GC-MS分析對(duì)比了2種溶劑抽出物的組成。結(jié)果表明：乙酸乙酯提取的抽提物得率為204 mg/L，甲基叔丁基醚提取得率為132 mg/L，經(jīng)GC-MS分析表明2種溶劑提取的物質(zhì)種類(lèi)分別為44種和49種，主要包含有機(jī)酸類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)，其中酸類(lèi)物質(zhì)的含量最高，分別為76%和80%左右。將乙酸乙酯抽提物應(yīng)用于銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)的抑藻效應(yīng)研究，發(fā)現(xiàn)不同濃度的化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻均具有一定程度的抑制作用，且隨濃度增加抑藻效應(yīng)增強(qiáng)。較低濃度的化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻有抑制作用但不顯著；高濃度的化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻具有顯著抑制效應(yīng)，50、100 mg/L時(shí)培養(yǎng)7天抑制率分別達(dá)到24.8%和77.2%；藻液在446 nm的吸光值測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步證明了APMP制漿廢水中提取的有機(jī)物質(zhì)具有抑藻效果。

化感物質(zhì)； 抑制作用； APMP制漿廢水； 銅綠微囊藻

水體富營(yíng)養(yǎng)化對(duì)淡水及近岸海水生態(tài)系統(tǒng)所產(chǎn)生的眾多負(fù)面影響是當(dāng)今水環(huán)境所面臨的主要問(wèn)題[1]。嚴(yán)重的富營(yíng)養(yǎng)化會(huì)導(dǎo)致藻類(lèi)快速爆發(fā)，并會(huì)對(duì)人體及水生生物安全造成很大的危害[2]。安全、高效、簡(jiǎn)便的抑藻方法成為水環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，而化感物質(zhì)和化感效應(yīng)的應(yīng)用為解決該問(wèn)題提供了一條新的思路，相關(guān)研究受到國(guó)內(nèi)外的普遍關(guān)注。植物化感作用是植物通過(guò)向環(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)(化感物質(zhì))而對(duì)另一種生物產(chǎn)生有害或有益的作用?；凶饔弥幸砸种谱饔幂^為普遍， 亦稱(chēng)為化感作用或相生相克作用[3-5]。水生植物種間化感作用因受季節(jié)性影響，以及受藻類(lèi)爆發(fā)時(shí)藻類(lèi)毒素對(duì)水體及水生生物產(chǎn)生的巨大破壞作用影響，大規(guī)模應(yīng)用具有很大局限性。與水生植物相比，陸生植物生物量大、原料易得，其次生代謝物質(zhì)更加豐富，有廣泛存在于水生植物中的化感物質(zhì)。有研究表明多種陸生植物對(duì)水生藻類(lèi)具有良好的抑制作用[6-7]。因此，陸生植物在抑藻滅藻方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。1994年，美國(guó)水生植物管理中心將用量為50 g/m3的大麥秸稈直接投加到富營(yíng)養(yǎng)化水體中用于藻類(lèi)抑制，取得了巨大成功[8]。與之類(lèi)似，在蘇格蘭一處面積為25 000 m2、藍(lán)藻和硅藻大量爆發(fā)的水域應(yīng)用大麥秸稈抑藻研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，水體中的藻量減少一半，水華現(xiàn)象得到了有效控制[9]。馬妍等[10]研究了13種陸生植物對(duì)銅綠微囊藻和萊茵衣藻的抑藻作用，結(jié)果表明，雪松、楓楊、核桃楸和核桃這4種植物是具有應(yīng)用前景的陸生抑藻植物材料。另外，與水生植物類(lèi)似，陸生植物化感物質(zhì)同樣為植物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，一般均能在自然條件下降解，不會(huì)在生態(tài)系統(tǒng)中長(zhǎng)期積累，生態(tài)安全性好。與直接利用植物體化感效應(yīng)相比，化感物質(zhì)提取物不影響水體感官，更易于實(shí)施和大規(guī)模利用。高等植物化感物質(zhì)的種類(lèi)繁多，按照化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為5類(lèi)：脂肪族、芳香族、含氧雜環(huán)化合物、類(lèi)萜和含氮化合物，多數(shù)化感物質(zhì)為植物中脂溶性成分，其提取過(guò)程復(fù)雜，是大規(guī)模應(yīng)用于抑藻滅藻過(guò)程中存在的關(guān)鍵性問(wèn)題。目前，高等植物化感物質(zhì)多采用直接有機(jī)抽提、熱水或蒸汽抽出后再進(jìn)行有機(jī)抽提等工藝獲得。制取后殘?jiān)幚淼葐?wèn)題是限制其大規(guī)模應(yīng)用的關(guān)鍵。堿性過(guò)氧化氫機(jī)械漿(APMP)制漿時(shí)首先對(duì)原料木片進(jìn)行熱水預(yù)浸漬，然后經(jīng)擠壓疏解后進(jìn)行化學(xué)浸漬，再經(jīng)磨漿制備高得率漿，其中預(yù)浸漬和化學(xué)浸漬是APMP制漿廢水的主要來(lái)源。利用有機(jī)溶劑從制漿廢水中提取有機(jī)物，這與植物精油(化感物質(zhì))提取技術(shù)中的先熱水浸提再有機(jī)溶劑提取工藝相似[11-13]。因此，從制漿廢水中提取有機(jī)抽出物作為化感物質(zhì)是一種很好的嘗試。桉樹(shù)屬桃金娘科桉屬，是世界著名的三大速生樹(shù)種之一，廣泛用于制漿造紙、人造板、細(xì)木工板、家具等領(lǐng)域，且具有培育周期短、木材產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，窿緣桉、尾葉桉等對(duì)藻類(lèi)具有化感作用[14-16]。銅綠微囊藻是我國(guó)淡水領(lǐng)域中產(chǎn)生藍(lán)藻水華的主要藻類(lèi)，其水華爆發(fā)率極高，并能產(chǎn)生一種環(huán)狀七肽的微囊藻毒素，不僅嚴(yán)重影響水質(zhì)，而且通過(guò)食物鏈傳遞，還會(huì)影響人類(lèi)的健康，是研究水華藻抑藻的代表性藻種[17]。本研究從桉木APMP制漿廢水中提取有機(jī)抽出物，并將其應(yīng)用于銅綠微囊藻的抑制研究，以期達(dá)到既降低制漿廢水處理負(fù)荷又可對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行精煉的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桉木木片，取自山東某大型制漿造紙企業(yè)，巴西進(jìn)口尾葉桉和廣西藍(lán)桉按質(zhì)量比8 ∶2混合木片，進(jìn)口木片樹(shù)齡約為6年，廣西藍(lán)桉木片樹(shù)齡約為5～6年。藻種：銅綠微囊藻(MicrocystisaeruginosaFACHB-905)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)。二乙基三胺五乙酸(DTPA)，化學(xué)純；硅烷化試劑(BSTFA)，濃度≥90%；H2O2、Na2SiO3、MgSO4、NaOH、乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

ZQS1型蒸煮鍋，陜西科技大學(xué)機(jī)械廠；js10型螺旋擠壓機(jī)，安丘汶瑞機(jī)械制造有限公司；VARIAN4000 us型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)VARIAN公司。

1.2 桉木APMP制漿廢水抽出物的提取

1.2.1 桉木APMP制漿廢水的收集 廢水：實(shí)驗(yàn)室模擬APMP制漿工藝自制廢水。具體過(guò)程如下：稱(chēng)取一定量桉木木片，按液比1 ∶4(g ∶g，木片與水質(zhì)量比，下同)加入80 ℃熱水，在蒸煮鍋中升溫至80 ℃后保溫40 min，經(jīng)瀝水后采用螺旋擠壓機(jī)擠壓疏解，收集廢水；疏解后的原料進(jìn)行化學(xué)預(yù)浸漬，液比1 ∶4，溶液配比為H2O23%、Na2SiO32%、二乙基三胺五乙酸(DTPA) 0.5%、MgSO40.1%、NaOH 3%、其余為水，浸漬溫度80 ℃，保溫40 min，收集廢水。合并上述熱水浸漬廢水和化學(xué)預(yù)浸漬廢水即為桉木APMP制漿廢水，冰箱冷藏備用。

1.2.2 廢水中抽出物的提取 取100 mL 1.2.1節(jié)廢水調(diào)節(jié)pH值至2.0，加入50 mL有機(jī)溶劑，振蕩萃取5 min，離心并收集有機(jī)相；再將水相pH值調(diào)節(jié)到9.0，重新加入50 mL有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，最后將兩部分有機(jī)溶劑混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5 mL左右，轉(zhuǎn)入預(yù)先洗凈并烘干稱(chēng)質(zhì)量的小瓶中，用5 mL有機(jī)溶劑洗滌蒸餾瓶2次，轉(zhuǎn)入有機(jī)相小瓶中，60 ℃揮發(fā)有機(jī)溶劑12 h，干燥器內(nèi)干燥12 h得到黏稠膠狀物質(zhì)，稱(chēng)質(zhì)量并計(jì)算得率，冰箱冷凍備用。

1.3 有機(jī)溶劑抽出物的成分分析

將所得抽出物進(jìn)行硅烷化[18]處理，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行成分分析，參照NIST05標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)，分析抽出物中有機(jī)物質(zhì)的種類(lèi)和相對(duì)含量[16]。

1.4 銅綠微囊藻的培養(yǎng)及抑藻研究

銅綠微囊藻采用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)[19]。在250 mL錐形瓶中加入150 mL無(wú)菌培養(yǎng)基，接入藻種，接種量為10%，置于恒溫(25±1)℃、光照強(qiáng)度為(2 000 Lx)、明暗比為12 h/12 h的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)搖瓶?jī)纱?。待?xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于抑藻研究。取適量乙酸乙酯抽出物，用二甲基亞砜溶解并適當(dāng)稀釋?zhuān)凑找欢舛忍砑拥綄?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液中，為避免溶劑的影響，添加到試樣中二甲基亞砜的量保持一致并不超過(guò)藻液總體積的0.2%。

1.5 測(cè)定方法

采用藻細(xì)胞密度和藻液吸光度來(lái)衡量藻類(lèi)生長(zhǎng)狀況，用于評(píng)價(jià)抑藻效果。

藻細(xì)胞密度采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定，并繪制藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。以藻細(xì)胞抑制率表示化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻的抑制率，計(jì)算公式如下[20]：

I=(1-N/N0)×100%

式中：I—藻細(xì)胞抑制率，%；N—處理組藻細(xì)胞密度，個(gè)/mL；N0—對(duì)照組藻細(xì)胞密度，個(gè)/mL。

藻液吸光度通過(guò)測(cè)定446 nm處吸光度進(jìn)行衡量，銅綠微囊藻藻液在446 nm處具有特征吸收峰，用于估算藻密度及溶解葉綠素含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 APMP制漿廢水中抽出物GC-MS分析

采用乙酸乙酯和甲基叔丁基醚2種有機(jī)溶劑對(duì)桉木APMP制漿廢水中抽出物進(jìn)行抽提，其中乙酸乙酯提取的抽提物得率為204 mg/L，甲基叔丁基醚提取的抽提物得率為132 mg/L。Gominho等[21]對(duì)葡萄牙賽圖加爾地區(qū)長(zhǎng)樹(shù)齡桉木研究發(fā)現(xiàn)，桉木木材樹(shù)齡越長(zhǎng)，抽出物含量越高；7～8年齡尾葉桉二氯甲烷抽出物總量為0.3%；Coloma等[22]對(duì)智利的桉木干材進(jìn)行生物處理，研究生物處理對(duì)抽出物的影響，7天組和21天組的正己烷與乙酸乙酯(體積比8 ∶2)抽出物分別為0.27%和0.30%，且處理時(shí)間越長(zhǎng)，抽出物含量越高。有研究表明杉木粉中含精油為2.5 mg/g[23]。本研究所用木片為混合桉木木片，由巴西進(jìn)口尾葉桉木片及廣西藍(lán)桉木片混合而成(尾葉桉與藍(lán)桉質(zhì)量比為8 ∶2)，其中進(jìn)口木片樹(shù)齡約為6年，廣西藍(lán)桉木片樹(shù)齡約為5～6年，用于APMP漿生產(chǎn)，因此抽出物應(yīng)在0.25%～0.30%左右。從APMP制漿過(guò)程1.1～1.2噸原料可生產(chǎn)1噸APMP漿，精油以2.5 mg/g計(jì)，每噸原料中所含精油約2.5 kg，每噸漿原料中精油約為2.7～3.0 kg，每噸漿廢水產(chǎn)量約10～15噸，按抽提得率0.2 kg/t廢水計(jì)(乙酸乙酯抽提率為204 mg/L)，總抽提率不小于70%，因此采用有機(jī)溶劑從APMP制漿廢水中提取抽出物有很好的可行性。

通過(guò)對(duì)2種有機(jī)溶劑抽出物進(jìn)行GC-MS分析，得到的總離子流圖如圖1所示，乙酸乙酯抽出物中有機(jī)物為44種，而甲基叔丁基醚抽提的則為49種，其正匹配度和逆匹配度均在64%～95%之間。

表1給出了2種有機(jī)溶劑抽出物主要有機(jī)物種類(lèi)及其GC含量。從表1可以看出，乙酸乙酯抽出物中有機(jī)物主要包含有機(jī)酸類(lèi)、胺類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)、酚類(lèi)，其中有機(jī)酸類(lèi)GC含量最高，約占76%，其次為有機(jī)胺類(lèi)，約占7%，醇和酯的GC含量均為5%左右，另外還有少量酚類(lèi)。資料顯示，有機(jī)酸和胺類(lèi)物質(zhì)多為植物化感物質(zhì)主要成分，且有關(guān)有機(jī)酸和胺類(lèi)物質(zhì)對(duì)藻類(lèi)的化感作用已有大量研究。陳國(guó)元等[24]研究表明，黃菖蒲中的有機(jī)酸組分對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。鄧?yán)^選等[25]研究發(fā)現(xiàn)，大麥秸稈粗提物中胺類(lèi)和酯類(lèi)含量較高，為大麥秸稈中主要的化感物質(zhì)，并對(duì)銅綠微囊藻有抑制作用。甲基叔丁基醚抽出物中有機(jī)物主要包含有機(jī)酸類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)、酚類(lèi)，其中有機(jī)酸類(lèi)約80%，酯類(lèi)約12%。

圖1 2種溶劑抽出物總離子流圖

表1 2種溶劑抽出物中有機(jī)物種類(lèi)及其GC含量

從組成成分上看，乙酸乙酯抽出物中GC含量最高的5種物質(zhì)為2-十一烯酸、 3-(3，4-二羥基苯基)丙酸、乙胺、 3，4-二羥基苯甲酸和鄰苯二甲酸二丁酯；甲基叔丁基醚抽出物中GC含量最高的5種物質(zhì)為鄰苯二甲酸二丁酯、 3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯丙酸、2-羥基- 4-甲基戊酸和十六烷酸。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)2種有機(jī)溶劑所提取的有機(jī)物化學(xué)成分中有28種是相同的，二者具有較好的相似度。

2.2 抽出物對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

2.2.1 較低濃度抽出物 通過(guò)對(duì)藻種的馴化和培養(yǎng)，測(cè)得銅綠微囊藻的生長(zhǎng)曲線，將藻種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，添加不同濃度的化感物質(zhì)，研究化感物質(zhì)對(duì)藻類(lèi)細(xì)胞密度的作用效果，圖2給出了較低濃度化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響。

圖2 較低濃度化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線的影響

從圖2可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞密度都呈現(xiàn)不斷增長(zhǎng)趨勢(shì)。在培養(yǎng)前期，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組藻細(xì)胞密度增加差異不大，甚至還出現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞密度超過(guò)對(duì)照組現(xiàn)象；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抽出物對(duì)藻類(lèi)的抑制作用才逐漸顯現(xiàn)出來(lái)，10 mg/L時(shí)抑藻率最高達(dá)到了20%以上。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是較低濃度化感物質(zhì)對(duì)藻類(lèi)的抑制作用不顯著，尤其是培養(yǎng)前期，藻細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞活力高，對(duì)化感物質(zhì)抵抗能力強(qiáng)，甚至部分化感物質(zhì)還可被藻細(xì)胞降解或作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，表現(xiàn)為對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的“促進(jìn)作用”，與文獻(xiàn)[26-27]結(jié)果一致。培養(yǎng)后期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，藻細(xì)胞進(jìn)入衰老和快速死亡階段，化感物質(zhì)對(duì)藻類(lèi)的抑制作用逐漸顯現(xiàn)出來(lái)，造成藻細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)快速死亡、分解，從而顯現(xiàn)出了較顯著的抑藻效率?？傊?，較低濃度化感物質(zhì)有一定抑藻效應(yīng)但不顯著。

2.2.2 較高濃度抽出物 將抽出物質(zhì)量濃度提高到50和 100 mg/L，研究了較高濃度化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，對(duì)照組藻細(xì)胞濃度隨培養(yǎng)時(shí)間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表現(xiàn)為正常的生長(zhǎng)曲線狀態(tài)。50 mg/L實(shí)驗(yàn)組中藻細(xì)胞密度雖然也呈現(xiàn)出逐漸上升趨勢(shì)，但明顯低于對(duì)照組，表現(xiàn)出了顯著的抑藻效果，抑制率穩(wěn)定在20%左右，最高可到24.8%，從藻細(xì)胞密度增加的速度來(lái)看，從第4天開(kāi)始，藻細(xì)胞密度開(kāi)始明顯增加，隨后逐漸穩(wěn)定，但始終比對(duì)照組低很多。Nakai等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在投加大型植物(如狐尾藻、水蘊(yùn)草、菹草等)浸提液抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)時(shí)，藻細(xì)胞在培養(yǎng)8d后開(kāi)始恢復(fù)生長(zhǎng)，抑藻作用減弱，這與本研究50 mg/L的抑藻結(jié)果類(lèi)似，只是時(shí)間段略有不同。100 mg/L實(shí)驗(yàn)組中，除第1天藻密度略高于對(duì)照組外，從第2天開(kāi)始出現(xiàn)急劇下降。第1天實(shí)驗(yàn)組藻密度偏高可能與顯微鏡計(jì)數(shù)無(wú)法區(qū)分藻細(xì)胞生存狀態(tài)有關(guān)，部分細(xì)胞受到抑制甚至已經(jīng)死亡但未解體也會(huì)被計(jì)入藻細(xì)胞密度。 從培養(yǎng)狀態(tài)來(lái)看，從第2天開(kāi)始，藻液顏色開(kāi)始變淺，由深綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色、淡黃色，且藻細(xì)胞出現(xiàn)大量聚集、絮沉現(xiàn)象，鏡檢也發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞碎片，說(shuō)明藻細(xì)胞出現(xiàn)了大量死亡和解體現(xiàn)象，抑制率也逐漸上升，第7天達(dá)到77.2%。培養(yǎng)后期鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)了不規(guī)整現(xiàn)象，說(shuō)明可能存在藻細(xì)胞的死亡和裂解。有學(xué)者研究了蘆葦化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞膜和亞顯微結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)化感物質(zhì)可以使銅綠微囊藻細(xì)胞壁脫落，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)含物滲出，細(xì)胞內(nèi)片層結(jié)構(gòu)解體，內(nèi)含物的總量上升，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)損壞，藻細(xì)胞由最初的質(zhì)壁分離進(jìn)而細(xì)胞壁脫落，最終藻細(xì)胞裂解死亡[29-30]。吳湘等[31]研究黃花水龍化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，化感物質(zhì)質(zhì)量濃度為50～75 mg/L時(shí)，培養(yǎng)4～7d內(nèi)對(duì)藻細(xì)胞相對(duì)抑制率達(dá)50%～95%。聶江力等[17]發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸對(duì)銅綠微囊藻的抑制率總體上呈現(xiàn)隨濃度的增加抑制率提高的現(xiàn)象。本研究的結(jié)果與之類(lèi)似，說(shuō)明從APMP制漿廢水中提取的抽出物與傳統(tǒng)手段得到的化感物質(zhì)化感效果相似。

圖3 較高濃度的化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線的影響

2.3 抽出物對(duì)銅綠微囊藻藻液吸光度的影響

藻液吸光度不僅與藻細(xì)胞密度有關(guān)，也與培養(yǎng)液中溶解的色素、葉綠素含量等相關(guān)，在藻細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，由于細(xì)胞活性強(qiáng)、生長(zhǎng)狀態(tài)良好，由細(xì)胞解體釋放的有色物質(zhì)較少，其吸光度與細(xì)胞數(shù)有線性相關(guān)性，可輔助衡量藻類(lèi)生物量[32]。通過(guò)全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻藻液在446 nm有較強(qiáng)特征吸收峰，因此在培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)藻液在446 nm處的吸光度變化進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。由圖4(a)可見(jiàn)，添加5和10 mg/L抽出物的藻液在446 nm處的吸光值隨培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)與對(duì)照組相同，都呈上升趨勢(shì)，其中實(shí)驗(yàn)組略低于對(duì)照組，但差異不大，表明添加低濃度的化感物質(zhì)對(duì)藻類(lèi)有抑制作用但不明顯，與文獻(xiàn)[33]結(jié)果一致。當(dāng)較高濃度(50、100 mg/L)時(shí)，從第1天開(kāi)始實(shí)驗(yàn)組446 nm吸光度值明顯高于對(duì)照組，且100 mg/L組遠(yuǎn)高于50 mg/L組，第1天吸光度值增加就達(dá)到47.8%，單獨(dú)藻密度增加不可能造成吸光值如此大幅度的增加。而隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，增長(zhǎng)趨勢(shì)逐漸放緩，并從第5天開(kāi)始逐漸被對(duì)照組超越。這可解釋為較高濃度的化感物質(zhì)導(dǎo)致了藻類(lèi)的大量死亡，藻細(xì)胞出現(xiàn)了集中大量解體現(xiàn)象，導(dǎo)致有色物質(zhì)大量溶出，從而使藻液色度增加。隨著培養(yǎng)的繼續(xù)，100 mg/L實(shí)驗(yàn)組吸光度還出現(xiàn)了下降趨勢(shì)， 這可能是由于隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，溶解出的有色物質(zhì)逐漸被分解褪色，而細(xì)胞增殖帶來(lái)的色度增加無(wú)法抵消褪色幅度，導(dǎo)致了色度下降，與文獻(xiàn)[34]結(jié)果一致。50 mg/L實(shí)驗(yàn)組吸光度值雖然也出現(xiàn)了第1天吸光度激增的現(xiàn)象，但后期增加速度逐漸放緩，最終與對(duì)照組比較接近，前期的激增跟有色物質(zhì)溶出干擾有關(guān)，后期隨著培養(yǎng)的繼續(xù)，藻密度的增加和溶解物的共同作用使得吸光度值與對(duì)照組逐漸接近。有關(guān)色度物質(zhì)的變化機(jī)理等還有待于進(jìn)一步詳細(xì)研究。

圖4 不同濃度化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻吸光度的影響(446 nm)

3 結(jié) 論

3.1 采用乙酸乙酯和甲基叔丁基醚2種有機(jī)溶劑從桉木APMP制漿廢水中提取抽出物，并采用GC-MS對(duì)抽出物的成分進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：乙酸乙酯提取的抽提物得率為204 mg/L，甲基叔丁基醚提取的抽提物得率為132 mg/L；2種抽出物中有機(jī)物種類(lèi)分別為44種和49種，且均以有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)為主，GC含量分別為76%和80%左右，還有部分醇類(lèi)、酯類(lèi)、酚類(lèi)等物質(zhì)。

3.2 將乙酸乙酯抽提物應(yīng)用于銅綠微囊藻的抑藻效應(yīng)研究。結(jié)果表明：桉木APMP制漿廢水中提取的抽提物對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)抑制作用與抽出物濃度密切相關(guān)，較低濃度抽出物有抑藻效果但不顯著，對(duì)吸光度影響不明顯；較高濃度時(shí)抑藻效果顯著，初期由于藻細(xì)胞大量死亡溶出有色物質(zhì)導(dǎo)致吸光度急劇增加，后期隨著有色物質(zhì)的分解沉降吸光度逐漸降低，100 mg/L抽出物培養(yǎng)7天時(shí)對(duì)藻細(xì)胞密度抑制率最高可達(dá)77.2%。

3.3 由抽出物抑藻效應(yīng)可以看出，從桉木APMP制漿廢水中提取的抽出物抑藻效果與從植物原料中直接獲得的植物精油(化感物質(zhì))效果接近，可被認(rèn)為是化感物質(zhì)一個(gè)全新來(lái)源。從制漿廢水中提取化感物質(zhì)不僅無(wú)殘?jiān)a(chǎn)生，有利于后續(xù)廢水無(wú)害化處理，同時(shí)為化感物質(zhì)提取提供了很好的來(lái)源，符合生物質(zhì)精煉和清潔生產(chǎn)發(fā)展模式。

[1]倪利曉,陳世金,任高翔,等.陸生植物化感作用的抑藻研究進(jìn)展[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào),2011,20(6):1176-1182. NI L X, CHEN S J, GAO X, et al. Advance research on the allelopathy of terrestrial plants in inhibition of algae[J]. Ecology and Environmental Sciences, 2011,20(6):1176-1182.

[2]柴民偉,石福臣,馬妍,等.藥用植物浸提液抑制蛋白核小球藻生長(zhǎng)的化感效應(yīng)[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2010,30(18): 4960-4966. CHAI M W, SHI F C, MA Y, et al. The allelopathic and inhibitive effects of extracts from medicinal plants on the growth ofChlorellapyrenoidosa[J]. Acta Ecologica Sinica, 2010,30(18): 4960-4966.

[3]RICE E L. Allelopathy[M].2nd ed. London: Academic Press,1984:1-2.

[4]胡洪營(yíng),門(mén)玉潔,李鋒民.植物化感作用抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)的研究進(jìn)展[J].生態(tài)環(huán)境,2006,15(1):153-157. HU H Y, MEN Y J, LI F G. Research progress on phyto-allelopathic algae control[J]. Ecology and Environment, 2006,15(1):153-157.

[5]張彬,郭勁松,方芳,等.植物化感抑藻的作用機(jī)理[J].生態(tài)學(xué)雜志,2010,29(9):1846-1851. ZHANG B, GUO J S, FANG F, et al. Actionme chanisms of allelopathy ininhibit in galgae: A review[J]. Chinese Journal of Ecology, 2010, 29(9):1846- 1851.

[6]陳孝花,潘連德,張飲江.水中絲狀藻類(lèi)有害藻華的形成與對(duì)策[J].南方水產(chǎn)科學(xué),2011,7(2):80-86. CHEN X H, PAN L D, ZHANG Y J. Formation and countermeasures of harmful filamentous algae in water[J]. South China Fisheries Science, 2011, 7(2):80-86.

[7]王聰,張飲江,李巖,等.陸生植物化感作用抑制有害藻應(yīng)用研究進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2011,35(1):115-121. WANG C, ZHANG Y J, LI Y, et al. Research progress on allelopathic effects of terrestrial plants for inhibitting harmful algae[J]. Environmental Science & Technology,2011,35(1):115-121.

[8]EVERALL N C, LEES D R. The identification and significance of chemichals released from decomposing barley straw during reservoir algal control[J]. Water Research, 1997,31:614-620.

[9]BARRETT P R F, LITTLEJOHN J W, CURNOW J. Long-term algal control in a reservoir using barley straw[J]. Hydrobiologia, 1999, 415(3):309-313.

[10]馬妍,石福臣,柴民偉,等.幾種植物對(duì)銅綠微囊藻和萊茵衣藻的影響[J].南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2010,43(3)：81-87. MA Y, SHI F C, CHAI M W, et al. Effects of allelochemicals from several terrestrial plants onMicrocystisaeruginosaandChlamydomonasreinhardtii[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Nankaiensis,2010,43(3):81-87.

[11]趙華,張金生,李麗華.植物精油提取技術(shù)的研究進(jìn)展[C]∥第六屆全國(guó)微波化學(xué)會(huì)議論文集,2006:137-140. ZHAO H, ZHANG J S, LI L H. Development on exaction technique of essential oil from plants [C]∥Proceedings of the Sixth National Symposium on Microwave Chemistry,2006:137-140.

[12]楊君,張獻(xiàn)忠,高宏建,等.天然植物精油提取方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2012,18(9):31-35. YANG J, ZHANG X Z, GAO H J, et al. Research progress of natural plant essential oil extraction methods[J]. Food and Nutrition in China,2012,18(9):31-35.

[13]洪喻,胡洪營(yíng),黃晶晶,等.不同溶劑提取蘆竹化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響[J].環(huán)境科學(xué),2008,29(11):3143-3147. YU H, HU H Y, HUANG J J, et al. Growth ofMicrocystisaeruginosaaffected by allelochemicals ofArundodonaxLinn. extracted with different solvents [J]. Environmental Science, 2008,29(11):3143-3147.

[14]曾任森,李蓬為.窿緣桉和尾葉桉的化感作用研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1997,18(1): 6-10. ZENG R S, LI P W. Allelopathic effects ofEucalytusexsertaandE.urophylla[J].Journal of South China Agricultural University,1997,18(1): 6-10.

[15] CHOU C H, YAW L K. Allelopathic research of subtropical vegetation in Taiwan[J]. Journal of Chemical Ecology, 1986,12(6):1431-1447.

[16]楊維東,劉玉榮,劉潔生,等.桉木粉對(duì)塔瑪亞歷山大藻的抑制作用及其化學(xué)基礎(chǔ)研究[J].環(huán)境科學(xué),2008,29(8):296-301. YANG W D, LIU Y R, LIU J S, et al. Inhibitory effects and chemical basis ofEucalyptusorellianawood meals on the growth ofAlexandriumtamarense[J]. Environmental Science, 2008,29(8):2296-2301.

[17]聶江力,裴毅.五倍子對(duì)銅綠微囊藻的化感作用[J].北方園藝,2014(24):139-143. NIE J L, PEI Y. Allelopathy ofGallachinensisonMicrocysticaeruginosa[J]. Northern Horticulture,2014(24):139-143.

[18]劉廷志.黑曲霉發(fā)酵接合絮凝+氧化工藝處理?xiàng)钅続PMP廢液研究[D].天津: 天津科技大學(xué)博士學(xué)位論文, 2011. LIU T Z.Aspergillusnigeraerobic fermentation-coagulation-oxidation process for poplar APMP effluent treatment[D].Tianjin: Doctoral Dissertation of Tianjin University of Science & Technology, 2011.

[19]辛文克. 大萍及其堿類(lèi)提取物對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制作用研究[D].哈爾濱: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2013. XIN W K.The study on inhibition effects ofMicrocystisaeruginosagrowth byPistiastratiotesand its alkali extracts[D]. Harbin: Master Degree Thesis of Harbin Institute of Technology, 2013.

[20] LI F M, HU H Y. Isolation and effects on green algaChlorellapyrenoidosaof algal-inhibiting allelochemicals in the Macrophyte,PhragmitescommunisTris[J]. Environment Science,2004,25 (5):89-92.

[21] GOMINHO J, LOURENCO A, NEIVA D, et al. The effect of eucalypt tree overaging on pulping and paper properties[J]. European Journal of Wood and Wood Products, 2016, 74(1):101-108.

[22] COLOMA J, REYES L, NAVARRETE J, et al. Effect of albino ophiostoma strains on eucalyptus nitens extractives[J]. Maderas: Ciencia Y Tecnología, 2015, 17(1): 161-170.

[23] 商文, 楊維東, 李麗璇,等. 杉木粉對(duì)兩種赤潮藻去除的試驗(yàn)研究[J].海洋環(huán)境科學(xué),2009,28(4):371-373. SHANG W, YANG W D, LI L X. Mesocosm experiment removedKareniamikimotoiandProrocentrumdonghaiensewith Chinese firwood meals[J]. Marine Environmental Science, 2009,28(4):371-373.

[24] 陳國(guó)元,李青松,唐凱.黃菖蒲有機(jī)酸組分對(duì)銅綠微囊藻的化感作用[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2013,36(9):26-30. CHEN G Y, LI Q S, TANG K. Allelopathic effect of organic acids fromIrispseudacorusL. onMicrocystisaeruginosa[J]. Environmental Science & Technology, 2013, 36(9): 26-30.

[25] 鄧?yán)^選,鄒華,莊嚴(yán).大麥秸稈抑藻物質(zhì)的分離及其抑藻作用研究[J].安全與環(huán)境學(xué)報(bào),2013,13(6):39-43. DENG J X, ZOU H, ZHUANG Y. On the isolation of anti-algal compounds from the wheat straw and the algae inhibiting effect[J]. Journal of Safety and Environment, 2013,13(6):39-43.

[26] 李慶華,郭沛涌,田美燕,等.兩種陸生植物浸提液對(duì)蛋白核小球藻的化感作用[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào): 理學(xué)版,2010,37(1):80-86. LI Q H, GUO P Y, TIAN M Y, et al. Allelopathy of two kinds of terraneous plant extracts onChlorellapyrenoidosa[J]. Journal of Zhejiang University:Science Edition, 2010， 37(1):80-86

[27] 李慶華,郭沛涌,田美燕,等.柳樹(shù)葉浸提液對(duì)蛋白核小球藻的化感作用[J].生態(tài)學(xué)雜志,2009, 28(5):884- 888. LI Q H, GUO P Y, TIAN M Y, et al. Allelopathy of Salixba by lonicaleaf extracts onChlorellapyrenoidosa[J]. Chinese Journal of Ecology, 2009, 28(5):884-888.

[28] NAKAI S, INOUE Y, HOSOMI M, et al. Growth inhibition of blue-green algae by allelopathic effects of macrophytes[J]. Water Science & Technology, 1999, 39(8):47-53.

[29] 李鋒民,胡洪營(yíng),種云霄,等. 2-甲基乙酰乙酸乙酯對(duì)藻細(xì)胞膜和亞顯微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 環(huán)境科學(xué),2007,28(7):1534-1538. LI F M, HU H Y, CHONG Y X, et al. Effects of allelochemical EMA isolated fromPhragmitescommunison algal cell membrane lipid and ultrastructure[J]. Environmental Science, 2007,28(7):1534-1538.

[30] 張庭廷,何梅,吳安平,等.對(duì)羥基苯甲酸對(duì)銅綠微囊藻的化感效應(yīng)以及對(duì)鯉魚(yú)的毒性作用[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2008, 28(9):1887-1893. ZHANG T T, HE M, WU A P, et al.Allelopathic inhibition ofp-hydroxybenzoicacid onMicrocystisaeruginosaKueitz with no toxicological effects onCyprinuscarpioLinnaeus[J].Acta Scientiae Circumstantiae, 2008, 28(9):1887-1893.

[31] 吳湘,吳昊,葉金云.黃花水龍化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)及藻毒素產(chǎn)生和釋放的影響[J].海洋與湖沼,2014,45(4):783-788. WU X, WU H, YE J Y. Influences of allelochemical extracted fromJusslaeastipulaceaOhwi on growth, microcystins production, and release ofMicrocystisaeruginosa[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2014,45(4):783-788.

[32] 張錫龍.典型行業(yè)廢水對(duì)四種微藻的急性毒性效應(yīng)研究[D].大連: 大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文,2013. ZHANG X L.Acute toxic effects of typical industry wastewater on four microalgae[D]. Dalian: Master Degree Thesis of Dalian University of Technology,2013.

[33] XIAO X, HUANG H, GE Z, et al. A pair of chiral flavonolignans as novel anti-cyanobacterial allelochemicals derived from barley straw (Hordeumvulgare): Characterization and comparison of their anti-cyanobacterial activities[J]. Environmental Microbiology, 2013,16(5):1238-1251.

[34] 劉光濤,周長(zhǎng)芳,孫利芳，等.鳳眼蓮化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻、斜生柵藻生長(zhǎng)及細(xì)胞數(shù)相對(duì)比例的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2011, 31(10):2303-2311. LIU G T, ZHOU C F, SUN L F, et al. Effects ofEichhorniacrassipesallelochemicals on the growth of two mono-and co-cultured algaeMicrocystisaeruginosaandScenedesmusobliquus[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2011, 31(10) : 2303-2311.

Extractives of Organics from Eucalyptus APMP Effluents and Its Inhibition Effect on Growth ofMicrocystisaeruginosa

CHENG Fujiang, LIU Tingzhi, LI Xiangxiang, QI Hui, ZHONG Liming

(Tianjin Key Laboratory of Pulp & Paper; College of Papermaking Science and Technology,Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China)

Eucalyptus APMP effluents were extractedby ethyl acetate (EA) and methyl tertiary butyl ether (MTBE) and the extractives were anaylyzes by GC-MS. The results showed that the yield of EA extractive was 204 mg/L with 44 kinds of organic compounds, and the yield of MTBE extractive was 132 mg/L with 49 kinds of organic compounds. The extractives were composed by acids, alcohols and esters，in which acids were the main compounds accounting for about 76% (extracted by EA) and 80% (extracted by MTBE), respectively. Inhibition effect of EA extractives on the growth ofMicrocystisaeruginosawas investigated. The results showed that the extractives from APMP effluents inhibited the growth ofM.aeruginosawith different effect in different concentrations. The inhibition effect was not remarkable at low extractive concentrations, and the inhibition effect was significant when the concentrations were over 50 and 100 mg/L, with the inhibition rates of 24.8% and 77.2%, respectively. The inhibition effect would be further investigated through the absorbent under 446 nm.

allelochemicals; inhibition; APMP effluents;Microcystisaeruginosa

10.3969/j.issn.0253-2417.2017.02.007

2016- 06- 07

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(14JCZDJC40500);天津市國(guó)家級(jí)大創(chuàng)項(xiàng)目(201610057039)

程富江(1991— )，男，山東泰安人，碩士生，主要從事生物質(zhì)材料高附加值利用的研究工作

*通訊作者：劉廷志，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事污水治理及生物質(zhì)精煉等方面的研究工作；E-mail:liutz@tust.edu.cn。

TQ35; TS79; X524

A

0253-2417(2017)02- 0057- 08

程富江，劉廷志，李祥祥，等.桉木APMP制漿廢水抽出物提取及其抑藻效應(yīng)研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2017，37(2)：57-64.