白粉虱對不同黃瓜材料防御性酶基因相對表達量的影響

谷停停+王艷廷+許建鵬+李田田+劉永月+姜文芝+孫亞玲+楊亞會+曹辰興

摘要：以本課題組篩選的4個黃瓜自交系（4號、13號、19號、76號）為試材，以不抗白粉虱的大青把黃瓜材料為對照，探討了不同黃瓜材料接種白粉虱后防御性酶基因相對表達量的變化。結(jié)果表明，接種白粉虱后各黃瓜材料5種防御性酶（PPO、HPL、LOX、SOD、APX）基因相對表達量變化差異較大，白粉虱抗性從高到低排序為13號、4號、19號、76號、大青把。因此，13號是下一步培育抗白粉虱黃瓜新品種的首選材料。

關(guān)鍵詞：黃瓜；白粉虱；防御性酶基因

中圖分類號：S642.2：Q784文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）05-0039-07

Effects of Trialeurodes vaporariorum on Gene Relative Expression

Levels of Defensive Enzymes in Different Cucumber Materials

Gu Tingting， Wang Yanting， Xu Jianpeng， Li Tiantian， Liu Yongyue，

Jiang Wenzhi， Sun Yaling， Yang Yahui， Cao Chenxing

（College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University/

State Key Laboratory of Crop Biology， Taian 271018， China）

AbstractUsing four cucumber inbred lines （No. 4， 13， 19， 76） as test materials， and the Daqingba cucumber material which was not resistant to Trialeurodes vaporariorum as control， the changes of gene relative expression levels of defensive enzymes were studied before and after inoculation of Trialeurodes vaporariorum. The results showed that five kinds of defensive enzymes of each cucumber material presented obvious gene relative expression level changes after inoculation. The resistance to Trialeurodes vaporariorum showed the descending order as No.13， No.4， No.19， No.76 and Daqingba. So No.13 was the key material to breed new cucumber varieties resistant to Trialeurodes vaporariorum.

KeywordsCucumber； Trialeurodes vaporariorum； Defensive enzyme genes

黃瓜（Cucumis sativus L.）是重要的蔬菜作物之一，被稱為世界性蔬菜[1-3]。然而，隨著種植面積不斷擴大和集約化程度不斷提升，黃瓜病蟲害的發(fā)生越發(fā)嚴重[4]，尤其以白粉虱危害最為常見，嚴重影響黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)[5]。而以化學防治為主的防治措施給黃瓜集約化、規(guī)?；a(chǎn)造成了巨大的負面影響。因此，培育抗白粉虱黃瓜新品種就顯得尤為重要，其中，研究其抗性機理是育種的前提和關(guān)鍵。

酶是具有生物催化功能的高分子物質(zhì)，幾乎所有細胞活動進程都離不開相關(guān)酶的參與，諸多研究也表明酶活性的高低與植物抗蟲、抗逆性有密切關(guān)系[6-12]。如苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷類代謝途徑的重要催化酶，是連接初級代謝和苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，其活性的高低與次生代謝速度和次生代謝產(chǎn)物如酚類、單寧、木質(zhì)素、黃酮等積累相關(guān)，從而間接增強植物抗蟲性[13，14]；多酚氧化酶（PPO）可通過催化植物體內(nèi)酚類物質(zhì)氧化生成醌，使植物汁液對害蟲具有毒害作用而提高植物抗性[15]；脂氫過氧化物裂解酶（HPL）和脂加氧酶（LOX）可催化不飽和脂肪酸經(jīng)過脂質(zhì)生化代謝途徑形成C6、C9的醛、醇、酯類綠葉揮發(fā)物質(zhì)，從而提高植物抗逆性[16]；而超氧化物歧化酶（SOD）可以通過清除超氧陰離子自由基反應生成H2O2，過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸氧化酶（APX）則又具有分解H2O2的能力。正是各種酶之間的彼此協(xié)調(diào)、相互作用， 使細胞內(nèi)的活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）保持在適當水平， 從而減輕ROS對植物造成的毒害，提高植物的抗逆能力[17]。另外，APX 還是AsA-GSH（抗壞血酸—谷胱甘肽）循環(huán)中的關(guān)鍵酶之一，與植物H2O2清除、抗衰老、抗病性及抗蚜性密切相關(guān)[18-21]。目前植物中關(guān)于各種酶與抗性關(guān)系的研究更多的集中于各相關(guān)酶的活性研究，對各種酶相關(guān)基因表達量方面的探討并不多見，黃瓜白粉虱抗性響應研究方面更是至今未見報道。為此，本試驗以本課題組篩選的4種對白粉虱具有抗性的黃瓜自交系（4號、13號、19號、76號）為試材，以不抗的大青把黃瓜材料為參照，分別測定了接種白粉虱后多酚氧化酶（PPO）、脂氫過氧化物裂解酶（HPL）、脂加氧酶（LOX）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗壞血酸氧化酶（APX）5種防御性酶基因的相對表達量，探討了不同黃瓜材料接種白粉虱后各防御性酶基因相對表達量的變化，旨在加強對黃瓜抗白粉虱機理的研究，進一步為抗白粉虱黃瓜材料的篩選、新品種的培育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試材

試材為本課題組篩選出的4份抗白粉虱黃瓜自交系：4號、13號、19號、76號和1份感白粉虱材料：大青把。

供試白粉虱蟲源采自山東農(nóng)業(yè)大學園藝試驗站9號日光溫室內(nèi)黃瓜植株，并在山東農(nóng)業(yè)大學溫室中籠罩盆栽黃瓜植株上連續(xù)飼養(yǎng)多代（擴大蟲源）。

1.2試驗設計

試驗于2015年8月在山東農(nóng)業(yè)大學園藝試驗站9號日光溫室中進行。選取顆粒飽滿的黃瓜種子進行浸種催芽處理，然后播種于塑料育苗缽（直徑10 cm，高8 cm）內(nèi)，每育苗缽1株，生長至三葉一心時每份材料選取生長健壯、長勢一致的20株黃瓜幼苗，每株接種溫室白粉虱60頭，接種后每株用自制80目防蟲網(wǎng)隔開。

1.3樣品采集

接種白粉虱后，于第0、1、3、5、7 d取整片葉片，立即用鋁箔紙包好放入液氮罐中，并迅速帶回實驗室置于-40℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

1.4防御性酶基因相對表達量測定方法

1.4.1防御性酶基因序列確定首先在擬南芥基因庫（http：//www.arabido psis.org/）中查找苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、脂氫過氧化物裂解酶（HPL）、脂加氧酶（LOX）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸氧化酶（APX）7種酶的基因序列，然后在黃瓜基因庫（http：//cucumber.genomics. org.cn/page/ cucumber/index.jsp）中進行比對，比對出其中5種，分別為多酚氧化酶（PPO）、脂氫過氧化物裂解酶（HPL）、脂加氧酶（LOX）、超氧化物歧化酶（SOD）及抗壞血酸氧化酶（APX），具體為 PPO（CsPPO，Csa5M184820.1）、HPL（CsHPL，Csa7M041960.1）、LOX（CsLOX，Csa2M023850.1），SOD（CsSOD，Csa1M573600.2）和APX（CsAPX，Csa1M479610.2）。

1.4.2引物設計采用Beacon Designer 7軟件，以5種酶相關(guān)基因序列為模板設計引物，具體見表1。

1.4.3相關(guān)基因的實時熒光定量分析采用TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit（離心柱型）試劑盒提取黃瓜葉片RNA，操作嚴格按照說明書進行。采用TransGen Biotech公司生產(chǎn)的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒合成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR儀型號為Bio-Rad CFX96（USA），熒光定量PCR反應體系按SYBR Green PCR Master Mix說明書配制，每個樣品設3個重復，反應體系和反應條件參考許海峰等[22]的方法。其中，以UBI為內(nèi)參，每個基因擴增均有內(nèi)參同時擴增，默認條件下讀取Ct值，采用2-ΔΔCT方法分析[23]：△△CT=（CT，Target-CT，UBI）（待測樣本）-（CT，Target-CT，UBI）（校準樣本）。

1.5數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)為3次重復平均值，用Microsoft Excel 2010和DPS 7.05軟件進行統(tǒng)計分析，用鄧肯氏法進行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1大青把黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對表達量的變化

不抗白粉虱大青把黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對表達量測定結(jié)果見圖1?？梢钥闯觯鞣N酶基因相對表達量對白粉虱侵害的反應不同。接種1 d后LOX、SOD酶基因相對表達量無明顯變化，而PPO、HPL、APX三種酶基因迅速做出反應，其表達量極顯著降低。接種3 d后，5種酶基因相對表達量均極顯著低于接種前水平。隨后PPO酶基因表達量一直維持在較低水平；HPL、APX酶基因表達量雖然顯著回升，但接種7 d后仍極顯著低于接種前水平；LOX酶基因相對表達量恢復到接種前水平；僅SOD酶基因相對表達量在接種7 d后超過接種前水平。這表明大青把黃瓜材料對白粉虱的侵害未做出有利反應，即未增加能產(chǎn)生阻止昆蟲接近的揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)酶（HPL、LOX）基因相對表達量，又未增加產(chǎn)生對蟲害有毒害作用的次生代謝物相關(guān)的酶（PPO）基因相對表達量，對消除逆境環(huán)境的酶（APX）基因表達量也產(chǎn)生了不利的影響，對能消除逆境傷害的酶（SOD）基因表達量也是到白粉虱侵害7 d后才明顯升高。這些結(jié)果均說明大青把黃瓜材料對白粉虱侵害無積極反應，因而不抗白粉虱。

2.24號黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對表達量的變化

4號黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對表達量測定結(jié)果見圖2?？芍?種酶基因相對表達量在接種白粉虱后第1 d均極顯著高于接種白粉虱前，而在第3 d普遍下降，在第5～7 d，PPO、HPL、LOX、SOD酶基因相對表達量又上升，總體各種酶基因相對表達量的變化趨勢為先上升后下降再上升趨勢。除APX酶基因外，接種白粉虱后1～7 d PPO、HPL、LOX、SOD酶基因平均相對表達量均高于接種白粉虱前，為接種白粉虱前的1.33、1.88、4.43、1.29倍（均值）。

與對照大青把相比，4號黃瓜材料5種酶基因相對表達量在接種白粉虱1～7 d，除APX外均高于接種前，其中，在接種1 d后表達量差異均達到極顯著水平，可見4號黃瓜材料對白粉虱的侵害非常敏感，反應迅速，能及時合成大量的次生代謝物質(zhì)，從而阻止或者減緩白粉虱的進一步侵害，并對白粉虱的危害進行及時地修復。

2.313號黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對表達量的變化

13號黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對表達量測定結(jié)果見圖3?？芍?，接種白粉虱后5種酶基因相對表達量總體為上升-下降-上升的趨勢，其中，接種白粉虱1 d后PPO、HPL、LOX、SOD極顯著高于接種白粉虱前，而在第3 d又普遍下降，但仍高于接種前水平。接種1～7 d PPO、HPL、LOX、SOD、APX酶基因相對表達量均高于接種前，差異多數(shù)達到極顯著水平，平均為接種前的1.52、1.96、4.09、1.62、1.05倍。

同對照大青把相比，5種酶基因相對表達量均對白粉虱的侵害有明顯的積極響應，13號黃瓜材料對白粉虱的侵害極為敏感，比4號黃瓜材料敏感性更強。

2.419號黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對表達量的變化

19號黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對表達量測定結(jié)果見圖4?？芍?，接種白粉虱后除APX外，PPO、HPL、LOX、SOD 4種酶基因相對表達量總體為上升-下降-上升的趨勢，其中PPO表達量接種前后變化不明顯，HPL、LOX、SOD表達量接種白粉虱1 d后都極顯著高于接種白粉虱前，在接種3～5 d內(nèi)只有HPL酶基因表達量較接種前高，而APX表達量在接種白粉虱后1～7 d內(nèi)均極顯著低于接種前。

由上可知，5種酶中只有HPL、LOX、SOD 3種酶基因?qū)Π追凼那趾τ斜容^明顯的響應，可見19號黃瓜材料對白粉虱的侵害敏感性一般，比4號、13號材料弱。

2.576號黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對表達量的變化

76號黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對表達量測定結(jié)果見圖5?？芍?，接種白粉虱1 d后LOX表達量與接種前相比極顯著增加，PPO、HPL、SOD 3種酶基因相對表達量有所增加，但差異不顯著，而APX表達量極顯著降低，第3 d才極顯著高于接種前；在接種后5～7 d，除SOD明顯增加外，PPO、LOX酶基因表達量與接種前一致，而HPL、APX酶基因表達量變化規(guī)律不明顯。

由上可知，5種酶基因表達量變化對白粉虱侵害響應不明顯，可見76號黃瓜材料對白粉虱的侵害敏感性較差，僅比對照大青把反應強一些。

綜上對5個黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對表達量的測定結(jié)果可知，白粉虱抗性能力排序為13號>4號>19號>76號>對照。因此，13號為進一步重點培育的抗白粉虱黃瓜新材料。

3討論與結(jié)論

研究表明，同種寄主植物的不同品種如煙草、番茄、辣椒、豇豆等對白粉虱的抗性不同[24-27]，這與植株葉片內(nèi)防御性酶活性變化有密切聯(lián)系[28，29]。孔海龍等[28]研究發(fā)現(xiàn)，煙粉虱成蟲侵害導致辣椒葉片內(nèi)POD、SOD防御酶活性上升，而且品種抗性越強，上升幅度越大；陳奕磊等[29]研究表明，煙粉虱侵害番茄不同品種后，落蟲量多的防御酶活性變化顯著，落蟲量少的防御酶活性變化不顯著；王濤等[30]對不同黃瓜材料白粉虱侵害后研究發(fā)現(xiàn)，POD、PAL、PPO 等酶的活性普遍升高，并認為三種酶活性的增強與無毛黃瓜突變體對白粉虱的抗性緊密相關(guān)。本研究對5個黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對表達量的研究發(fā)現(xiàn)，4號、13號、19號多數(shù)酶表達量在接種白粉虱1 d后就極顯著增加，1～7 d總體為上升-下降-上升的變化趨勢。其中，4號黃瓜材料除APX外，接種白粉虱后1～7 d PPO、HPL、LOX、SOD酶基因平均相對表達量均高于接種白粉虱前；13號接種1～7 d PPO、HPL、LOX、SOD、APX 5種酶基因相對表達量均高于接種前，差異多數(shù)達到極顯著水平；但19號5種酶中只有HPL、LOX、SOD 3種酶基因?qū)Π追凼那趾τ休^明顯的響應；而76號接種白粉虱1 d后僅有LOX表達量與接種前相比極顯著增加，PPO、HPL、SOD 3種酶基因相對表達量增加不顯著，APX表達量卻極顯著降低，在接種5～7 d后，PPO、HPL、LOX、APX 4種酶基因表達量變化規(guī)律不明顯，總體與接種前相比為降低；對照材料接種1～7 d發(fā)現(xiàn)，總體上，與接種前相比PPO、HPL、LOX、APX等酶基因相對表達量均為下降。綜合分析認為白粉虱抗性排序為13號>4號>19號>76號>對照，這與本課題組許建鵬對這5種黃瓜材料抗白粉虱研究得到的PPO酶活性1～7 d變化趨勢及各材料抗性順序基本一致[31]。對于更深入的抗性機理有待借助分子生物學、基因克隆等手段進一步深入研究，以期為黃瓜抗白粉虱育種提供更加深入可靠的理論指導和理論支撐。

參考文獻：

[1]王濤.溫室白粉虱危害對無毛黃瓜次生代謝的影響[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2011.

[2]馬榮金.黃瓜抗蚜材料篩選及其抗蚜機理的研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2015.

[3]馬榮金，李田田，劉桂軍，等.不同黃瓜材料抗蚜性與部分次生代謝物及其相關(guān)酶活力的關(guān)系[J].中國農(nóng)學通報，2015，31（19）：80-86.

[4]石勇強，惠偉，陳川，等.國內(nèi)溫室白粉虱的生物學習性與防治研究綜述[J].陜西農(nóng)業(yè)科學，2002（9）：19-22.

[5]李家旺，凌云昕，王繼洲.黃瓜栽培科技示范戶手冊[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008：259-261.

[6]Mohammadi M， Kazemi H. Changes in peroxidase and polyphenol oxidase activities in susceptible and resistant wheat heads inoculated with Fusarium graminearum and induced resistance[J].Plant Science，2002，162（4）：491-498.

[7]Mondal A， Dutta S， Nandi S， et al. Changes in defence-related enzymes in rice responding to challenges by Rhizoctonia solani[J].Archives of Phytopathology & Plant Protection，2012，45（15）：1-12.

[8]袁慶華，桂枝，張文淑.苜?？垢泻职卟∑贩N內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化物酶和多酚氧化酶活性的比較[J].草業(yè)學報，2002，11（2）：100-104.

[9]秦秋菊，高希武.昆蟲取食誘導的植物防御反應[J].昆蟲學報，2005，48（1）： 125-134.

[10]宋瑞芳，丁永樂，宮長榮，等.煙草抗病性與防御酶活性間的關(guān)系研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2007，23（5）：309-314.

[11]譚永安，柏立新，肖留斌，等.綠盲蝽危害對棉花防御性酶活性及丙二醛含量的誘導[J].棉花學報，2010，22（5）：479-485.

[12]王西存，于毅，周洪旭，等.蘋果綿蚜對不同蘋果品種春梢生長期生理指標的影響[J].生態(tài)學報，2012，32（7）：2075-2081.

[13]Mauchmani B， Slusarenko A J. Production of salicylic acid precursors is a major function of phenylalanine ammonia-lyase in the resistance of arabidopsis to peronospora parasitica[J].Plant Cell，1996，8（2）：203-212.

[14]王敬文，薛應龍.植物苯丙氨酸解氨酶的研究—Ⅲ.玉米小斑病菌Helminthosporium maydis T 小種和大斑病菌Helminthosporium turcicum毒素對苯丙氨酸解氨酶（PAL）的刺激作用[J].植物生理學報，1982，8（3）：237-244.

[15]海蒂弗斯R，威廉斯P H.植物病理生理學[M].朱有紅，宋佑衡，傅淑云，譯.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1991：165-167.

[16]陳書霞，陳巧，王聰穎，等.綠葉揮發(fā)物代謝調(diào)控及分子機理研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2012，45（8）：1545-1557.

[17]張金鋒，薛慶中.稻飛虱為害脅迫對水稻植株內(nèi)主要保護酶活性的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2004，37（10）：1487-1491.

[18]陳青，張銀東.3種氧化酶與辣椒抗蚜性的相關(guān)性[J].熱帶作物學報，2004，25（3）： 42-46.

[19]郭團玉，劉招龍.亞硒酸鈉對梨葉片感染輪紋病菌后APX、SOD、GPX 和GR活性的影響[J].杭州師范學院學報（自然科學版），2007，6（1）：47-50.

[20]徐健容，葉華智.抗壞血酸氧化酶與小麥抗赤霉病關(guān)系的研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學學報，1998，16（3）： 319-321.

[21]余澤高，喬麗雅.小麥抗壞血酸氧化酶活性與抗病性關(guān)系的初步探討[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2003（1）：31-33.

[22]許海峰，王楠，姜生輝，等.新疆紅肉蘋果雜種一代4個株系類黃酮含量比較及其合成相關(guān)基因表達分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學， 2016，49（16）：3174-3187.

[23] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CT method[J].METHODS， 2001，25：402-408.

[24]王艷秋，林華峰，金鵬，等.Q型煙粉虱對20個煙草品種的選擇性[J].植物保護，2016，42（2）：84-88.

[25]胡榮利，喬辰云，孔海龍，等.Q型煙粉虱對不同番茄品種的適生性[J].植物保護學報，2015，42（5）：734-740.

[26]呂敏，吳琳，蘇建坤，等.Q型煙粉虱為害對不同辣椒品種葉綠素及營養(yǎng)物質(zhì)的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2014，30（6）：1316-1320.

[27]杜予州，孫偉，張莉，等.B型煙粉虱對不同豇豆品種的選擇及適生性研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39（12）：2498-2504.

[28]孔海龍，呂敏，吳琳，等.Q型煙粉虱為害對不同品種辣椒保護酶活性及次生物質(zhì)含量的影響[J].應用昆蟲學報，2014，51（6）：1553-1560.

[29]陳奕磊，崔旭紅，蔡沖，等.B型煙粉虱對番茄不同品種光合特征和防御酶活性的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2011，44（17）：3547-3556.

[30]王濤，雷關(guān)紅，曹辰興，等.溫室白粉虱對無毛黃瓜葉片PAL、PPO、POD活性的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2011，43（9）： 84-87.

[31]許建鵬.黃瓜抗粉虱材料篩選及其對煙粉虱抗性機理的研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2016.