高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞OPN、TGFβ1基因沉默位點(diǎn)的篩選

李天然，宋 斌，黃曉斌，盧光明，李延軍

1.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院放射科，北京 100048； 2.解放軍南京總醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科； 3.解放軍第九五醫(yī)院放射科

高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞OPN、TGFβ1基因沉默位點(diǎn)的篩選

李天然1,2，宋 斌3，黃曉斌3，盧光明2，李延軍2

1.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院放射科，北京 100048； 2.解放軍南京總醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科； 3.解放軍第九五醫(yī)院放射科

目的 通過對(duì)高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞進(jìn)行骨橋蛋白(osteopontin, OPN)和轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)基因沉默的位點(diǎn)進(jìn)行篩選，篩選最佳基因沉默位點(diǎn)。方法 qPCR檢測(cè)MHCC97-H和MHCC97-L細(xì)胞兩種因子表達(dá)差異情況，對(duì)MHCC97-H TGFβ1和MHCC97-L OPN高表達(dá)組進(jìn)行基因沉默，每組確定3個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行沉默，Western blotting法分析各組OPN和TGFβ1表達(dá)。qPCR定量分析各組沉默效果。結(jié)果 qPCR檢測(cè)顯示:與MHCC97-L細(xì)胞比較，MHCC97-H細(xì)胞中TGFβ1表達(dá)量更高，與MHCC97-H細(xì)胞比較，MHCC97-L細(xì)胞中OPN的表達(dá)量更高(P<0.05)。qPCR定量分析3個(gè)位點(diǎn)沉默效果顯示MHCC97-L OPN siRNA 226、MHCC97-H TGFβ1 siRNA 1382沉默效果較好(P<0.05)。MHCC97-L OPN不同位點(diǎn)沉默效果電泳圖結(jié)果顯示所有沉默組MHCC97-L細(xì)胞中OPN蛋白已降到非常低水平，而MHCC97-H TGFβ1不同位點(diǎn)沉默效果電泳圖結(jié)果顯示TGFβ1沉默效果1382位點(diǎn)明顯。結(jié)論 不同的基因位點(diǎn)沉默效果存在差異，MHCC97-L OPN siRNA 226和MHCC97-H TGFβ1 siRNA 1382位點(diǎn)沉默效果最佳。通過確定最佳沉默效能的基因位點(diǎn)，可以達(dá)到基因最佳沉默效能為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供研究基礎(chǔ)。

肝癌；轉(zhuǎn)移；骨橋蛋白；轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β1；基因沉默

基因工程技術(shù)為開展腫瘤在基因水平的研究提供了手段[1]，具有高低轉(zhuǎn)移潛能特點(diǎn)的肝癌細(xì)胞是研究肝癌轉(zhuǎn)移行為的最佳模型[2]，通過基因工程技術(shù)修飾高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和增殖相關(guān)基因，使之低表達(dá)或高表達(dá)，觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為和增殖行為的變化情況，為尋找合適的干預(yù)治療提供線索。本課題組注意到骨橋蛋白(osteopontin, OPN)主要與腫瘤的轉(zhuǎn)移行為有關(guān)，轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)主要與腫瘤的增殖行為有關(guān)[3-4]，為進(jìn)一步探討兩種生物因子在肝癌轉(zhuǎn)移行為和增殖行為中的作用，擬對(duì)具有高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞進(jìn)行OPN和TGFβ1基因沉默，使之低表達(dá)OPN和TGFβ1因子，觀察肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為和增殖行為的變化。然而，不同的沉默基因位點(diǎn)沉默效果差距較大[5]，因此，基因的沉默效果需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究對(duì)高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞進(jìn)行 OPN和TGFβ1基因沉默的位點(diǎn)進(jìn)行篩選，為下一步研究做好前期工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及分組實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞(MHCC97-H和MHCC97-L)由上海復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所提供。兩組基因沉默基因位點(diǎn)沉默前qPCR檢測(cè)MHCC97-H和MHCC97-L細(xì)胞的兩種因子表達(dá)差異情況，根據(jù)結(jié)果顯示MHCC97-H高表達(dá)TGFβ1，MHCC97-L高表達(dá)OPN，因此，僅需對(duì)高表達(dá)組進(jìn)行相應(yīng)的沉默，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)初步篩選的結(jié)果設(shè)計(jì)分組(見表1)。

表1 高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞OPN、TGFβ1基因沉默實(shí)驗(yàn)分組

Tab 1 Experimental groups of TGFβ1 and OPN gene silencing in hepatocellular carcinoma cells with high and low metastatic potential

注：數(shù)值表示沉默位點(diǎn)信息。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料高純總RNA快速提取試劑盒購(gòu)自Generay公司(貨號(hào)：#GK3012)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Thermo Scientific Fisher公司(貨號(hào)：#K1622)；qPCR試劑SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)購(gòu)自天根公司(貨號(hào)：#FP205-02)。PVDF膜購(gòu)自Millipore公司；彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas公司；ECL Plus發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、Western及IP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天公司；Tris-Hcl/SDS(1.5 mmol/L，pH=8.8)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器OD值測(cè)量?jī)x器(高精度分光光度計(jì))為Merinton SMA4000；定量PCR儀為CFX connect Real-Time PCR System，配套使用的分析軟件為BIO-RAD CFX Manager；酶標(biāo)儀：SPECTRA max Plus 384，Molecular Devices公司；電泳系統(tǒng)：Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD公司；凝膠成像儀：ChemiDoc XRS+ System，Bio-RAD公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 qPCR分析MHCC97-H和MHCC97-L細(xì)胞OPN和TGFβ1表達(dá)差異實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)步驟：(1)Trizol-離心柱法提取細(xì)胞總RNA：收集約106個(gè)細(xì)胞，裂解，11 000 r/min,4 ℃離心10 min；(2)RNA純度的測(cè)定和RNA的定量：以相應(yīng)溶劑為對(duì)照，取2 μl RNA溶液于Merinton SMA4000檢測(cè)，觀察A260/A280、A260/A230比值及連續(xù)波長(zhǎng)吸收峰，并計(jì)算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質(zhì)量；(3)逆轉(zhuǎn)錄；(4)熒光定量PCR擴(kuò)增(見表2)。

表2 OPN和TGFβ1基因沉默引物序列

Tab 2 OPN and TGFβ1 gene silencing primer sequences

基因名稱引物(5'-3')homoActinForwardAGCGAGCATCCCCCAAAGTThomoActinReverseGGGCACGAAGGCTCATCATThomoOPNFAGGAGGAGGCAGAGCACAhomoOPNRCTGGTATGGCACAGGTGATGhomoTGFβ1FGGCGATACCTCAGCAACCGhomoTGFβ1RCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT

1.4.2 高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞基因序列的篩選：根據(jù)MHCC97-H和MHCC97-L細(xì)胞表達(dá)OPN和TGFβ1差異結(jié)果，僅高表達(dá)組需進(jìn)行沉默，對(duì)MHCC97-H細(xì)胞中TGFβ1進(jìn)行基因沉默，對(duì)MHCC97-L細(xì)胞中OPN進(jìn)行基因沉默，每組根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定3個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行沉默，qPCR分析沉默效果(方法同1.4.1)。

1.4.3 高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞OPN及TGFβ1表達(dá)Western blotting實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)步驟：蛋白樣品制備：組織勻漿，裂解，臺(tái)式離心機(jī)，11 000 r/min,4 ℃離心10 min。BCA法測(cè)定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉， 孵育一抗， 洗膜， 孵育二抗，洗膜， ECL化學(xué)發(fā)光顯影。GAPDH作為參照基因。

2 結(jié)果

2.1 高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞MHCC97-H和MHCC97-L OPN、TGFβ1表達(dá)差異分析采用2-△△Ct作為計(jì)算結(jié)果，以β-action作為內(nèi)參照基因，以空白對(duì)照組(CK)作為對(duì)照基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后相對(duì)定量結(jié)果如下。檢測(cè)結(jié)果顯示，MHCC97-H細(xì)胞中TGFβ1表達(dá)量更高，MHCC97-L細(xì)胞中OPN的表達(dá)量更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

2.2 TGFβ1和OPN siRNA沉默序列篩選根據(jù)上述兩個(gè)基因表達(dá)差異選擇MHCC97-L細(xì)胞篩選OPN沉默序列，MHCC97-H細(xì)胞篩選TGFβ1沉默序列。每個(gè)基因合成3個(gè)不同位點(diǎn)的沉默序列備選。采用2-△△Ct作為計(jì)算結(jié)果，以β-action作為內(nèi)參照基因，以空白對(duì)照組(CK)作為對(duì)照基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后相對(duì)定量結(jié)果如下。

注：與MHCC97-L相比，*P<0.05。

結(jié)果顯示，3個(gè)沉默序列均有沉默效果，其中MHCC97-L OPN siRNA 226、MHCC97-H TGFβ1 siRNA 1382沉默效果較好，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 不同位點(diǎn)OPN、TGFβ1 siRNA效果比較(2-△△Ct)

Tab 3 Comparison of OPN,TGFβ1 siRNA at different sites(2-△△Ct)

注：與空白對(duì)照組比較，※P<0.05。

2.3 Western blotting檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示OPN沉默效果比較明顯，所有沉默組MHCC97-L細(xì)胞中OPN蛋白已降到非常低水平(見圖2)。TGFβ1沉默效果1382位點(diǎn)明顯，與空白對(duì)照組比較，TGFβ1蛋白表達(dá)有所降低(見圖3)。

圖2 MHCC97-L OPN不同位點(diǎn)沉默效果電泳圖

Fig 2 The effect of MHCC97-L OPN silence with different gene sites in electrophoresis

圖3 MHCC97-H TGFβ1不同位點(diǎn)沉默效果電泳圖

Fig 3 The effect of MHCC97-H TGFβ1 silence with different gene sites in electrophoresis

3 討論

OPN是與轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物因子，通過與整合素αvβ3相結(jié)合而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，OPN可通過改變細(xì)胞骨架引發(fā)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)新生血管生成，促進(jìn)細(xì)胞黏附、阻止細(xì)胞凋亡等。前期本課題組研究表明，外源性O(shè)PN通過抑制MHCC97-H細(xì)胞釋放內(nèi)源性O(shè)PN而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤侵襲的作用，主要通過激活MMP-2因子發(fā)揮作用[6]。另外，前期研究還發(fā)現(xiàn)，TGFβ1與腫瘤的增殖行為有關(guān)，在高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞亦存在差異[7]。因此本研究選擇沉默這兩個(gè)基因，然而，為選擇最佳的基因沉默效果，需要對(duì)沉默基因的效能進(jìn)行篩選，為下一步觀察經(jīng)OPN、TGFβ1沉默的具有高低轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的變化做前期研究工作。

基因在染色體上占有的特定位置叫基因位點(diǎn)，同一基因具有不同的位點(diǎn)。結(jié)果顯示不同基因位點(diǎn)沉默效果存在差異，將OPN、TGFβ1基因表達(dá)最低的位點(diǎn)序列作為最后沉默的基因位點(diǎn)，構(gòu)建該位點(diǎn)的沉默基因序列和載體，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)。本研究篩選方法采用PCR方法和Western blotting，兩者結(jié)果相關(guān)表明沉默該位點(diǎn)基因比較成功，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

RNA沉默技術(shù)是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制，具有很高的特異性，只降解與之序列相應(yīng)的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNA。林帆等[8]通過OPN的RNA沉默明顯抑制了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，Saito等[9]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在體外OPN siRNA可有效沉默外源和內(nèi)源性O(shè)PN表達(dá)。張志梅[10]發(fā)現(xiàn)TGFβ1 siRNA可以部分逆轉(zhuǎn)人肝癌細(xì)胞株HepG2對(duì)順鉑的耐藥性。Xu等[11]通過TGFβ1 siRNA可以延緩肝臟纖維化的進(jìn)程，主要是通過降低炎癥因子TNF-α、IL-1的表達(dá)水平，從而達(dá)到抑制肝臟纖維化的目的。

本研究結(jié)果顯示，不同的基因位點(diǎn)沉默效果存在差異，MHCC97-L OPN 226和MHCC97-H TGFβ1 1 382 位點(diǎn)沉默效果最好。因此，通過確定最佳沉默效能的基因位點(diǎn)，可以達(dá)到目的基因最佳沉默效能為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供研究基礎(chǔ)。通過基因工程技術(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行修飾，使之降低表達(dá)轉(zhuǎn)移和增殖相關(guān)因子，為尋找新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Screening of OPN and TGFβ1 gene silencing sites in hepatocellular carcinoma cells with high and low metastatic potential

LI Tianran1,2, SONG Bin3, HUANG Xiaobin3, LU Guangming2, LI Yanjun2

1.Department of Radiology, the First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048; 2.Department of Radiology, Chinese PLA Nanjing General Hospital; 3.Department of Radiology, Chinese PLA 95th Hospital, China

Objective To screen out the best OPN and TGFβ1 gene silencing sites in the high and low metastatic potential hepatocellular carcinoma cells.Methods Expression differences of MHCC97-H and MHCC97-L cells were tested by qPCR method. MHCC97-H TGFβ1 and MHCC97-L OPN gene silencing were carried out, and each group identified three sites for silencing. The OPN and TGFβ1 expressions were tested by Western blotting. The silence effect of each group was tested by qPCR quantitative method.Results qPCR detection showed that the expression of TGFβ1 was higher in MHCC97-H cells than in MHCC97-L cells, and the expression of OPN was higher in MHCC97-H cells than that in MHCC97-L cells (P<0.05). qPCR quantitative analysis of the 3 sites silencing effect showed that the MHCC97-L OPN siRNA 226 and MHCC97-H TGFβ1 siRNA 1382 silencing effect were better than other silencing sites (P<0.05). MHCC97-L OPN in different silencing sites effect electrophoresis results showed that all silent groups MHCC97-L OPN protein expression had been reduced to a very low level, and MHCC97-H TGFβ1 silence effect electrophoresis results showed TGFβ1 1382 silencing site effect was obvious.Conclusion The silencing effects of different gene sites are different, and the silencing effect of MHCC97-L OPN siRNA 226 and MHCC97-H TGFβ1 siRNA 1382 are the best. By determining the best silencing efficacy of different gene sites, it can provide the basis for the follow-up experiment.

Hepatocellular carcinoma; Metastasis; Osteopontin; Transforming growth factor β1; Gene silence

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271607)；南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生重點(diǎn)項(xiàng)目資助(11Z035)；國(guó)家博士后基金(2015M572810)

李天然，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：肝癌轉(zhuǎn)移潛能的研究。E-mail: lizhaoruixin@sina.com

宋斌，主任醫(yī)師，研究方向：醫(yī)學(xué)影像信息化系統(tǒng)。E-mail: ltranmd@yeah.net

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.01.019

R735.7

A

1006-5709(2017)01-0070-04

2016-02-29