基于線粒體COⅠ基因的竹筍夜蛾親緣關(guān)系*

張 琴 莫有迪 張亞波 舒金平 王浩杰 吳 鴻

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 富陽(yáng) 311400； 2.杭州市林業(yè)科學(xué)研究院 杭州 311300；3.廣東省肇慶市懷集縣林業(yè)局 肇慶 526400)

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基于線粒體COⅠ基因的竹筍夜蛾親緣關(guān)系*

張 琴1,2莫有迪3張亞波1舒金平1王浩杰1吳 鴻1

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 富陽(yáng) 311400； 2.杭州市林業(yè)科學(xué)研究院 杭州 311300；3.廣東省肇慶市懷集縣林業(yè)局 肇慶 526400)

【目的】 基于mtDNA COⅠ基因探究竹筍夜蛾的親緣關(guān)系，以確定其分類(lèi)地位，為系統(tǒng)進(jìn)化軌跡提供分子理論基礎(chǔ)?！痉椒ā?以分布于浙江杭州周邊竹子產(chǎn)區(qū)的4種竹筍夜蛾為研究對(duì)象，使用通用引物分別克隆4種竹筍夜蛾線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶亞基Ⅰ(mtDNA COⅠ) 基因5′端709 bp 片段序列，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析4種竹筍夜蛾親緣關(guān)系。【結(jié)果】 1) 4種竹筍夜蛾遺傳距離較??； 2)與比對(duì)昆蟲(chóng)相比，4種竹筍夜蛾同屬一個(gè)進(jìn)化群，分支支持率達(dá)到100%?！窘Y(jié)論】 4種竹筍夜蛾親緣關(guān)系接近，除薩夜蛾外，建議將其他3種竹筍夜蛾歸為一個(gè)屬。4種竹筍夜蛾形態(tài)差異較小，生態(tài)習(xí)性相似，分布區(qū)域基本一致，可作為理想的同域物種進(jìn)化研究素材。本研究可為4種竹筍夜蛾分類(lèi)地位的確定提供初步分子基礎(chǔ)，同時(shí)可為竹筍夜蛾DNA條形碼鑒定提供理論基礎(chǔ)。

竹筍夜蛾； COⅠ基因； 序列比較； 親緣關(guān)系

竹筍夜蛾屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，是竹子筍期的主要害蟲(chóng)之一。竹筍夜蛾鉆蛀取食竹筍，活動(dòng)場(chǎng)所隱蔽，且幼蟲(chóng)期較長(zhǎng)，竹筍被危害嚴(yán)重時(shí)，被害率高達(dá)95%以上。被害竹筍能生長(zhǎng)成竹者，亦為斷頭、折梢、蟲(chóng)孔累累、材質(zhì)硬脆，竹材利用率低(徐天森， 1962； 徐天森等， 2004)。被害竹林大量退筍，使竹林日趨退化，影響筍用林產(chǎn)業(yè)的發(fā)展(胡正堅(jiān)等， 1992； 梁光紅等； 2003； Yoshimatsuetal., 2005； 舒金平等， 2012； 葉碧歡等， 2014)。在我國(guó)，研究報(bào)道的竹筍夜蛾主要有基夜蛾(Kumasiakumaso)、竹筍禾夜蛾(Oligiavulgaris)、筍秀夜蛾(Apameaapameoides)和薩夜蛾(Sapporiarepetita)(徐天森等， 2004； 舒金平等， 2012)。這4種竹筍夜蛾均鉆蛀取食竹筍，屬寡食性昆蟲(chóng)，生活史極其相似，生態(tài)位嚴(yán)重重疊，在時(shí)間、空間和營(yíng)養(yǎng)等資源利用上存在激烈競(jìng)爭(zhēng)(羅梅浩等， 2002； 黃瓊瑤等， 2009)，且在同一地區(qū)均有分布(黃煥華等， 2003)。此外，4種竹筍夜蛾成蟲(chóng)體色差異小，大小接近，實(shí)際生產(chǎn)生活中難以區(qū)分，人們常將其混淆，統(tǒng)稱為竹筍夜蛾，導(dǎo)致研究和生產(chǎn)防治中對(duì)象模糊，目標(biāo)不清。

傳統(tǒng)昆蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)對(duì)這4種竹筍夜蛾的分類(lèi)一直存在爭(zhēng)議，拉丁學(xué)名一再變更，屬的歸屬難以確定(徐天森等， 2004)。例如： 基夜蛾，曾用名淡竹筍夜蛾，其拉丁學(xué)名曾為Apamea(秀夜蛾屬)kumaso(Sugi)(朱弘復(fù)， 1964； Inoueetal,1982； 陳一心， 1985； 1992)；筍秀夜蛾，曾用名筍秀禾夜蛾，其拉丁學(xué)名曾為Oligia(禾夜蛾屬)apameoidis(Draudt)(陳一心， 1985)；竹筍禾夜蛾，曾用名竹筍夜蛾，其拉丁學(xué)名曾為Polydesma(紛夜蛾屬)vulgaris(Butler)、Oligiavulgaris(Hampson)、Bambusiphilavulgaris(Sugi)(朱弘復(fù)， 1964； Inoueetal., 1982； 陳一心， 1985; 1992)；薩夜蛾，曾用名筍連秀夜蛾，其拉丁學(xué)名曾為Apamea(秀夜蛾屬)repetita(Butler)、Trachea(陌夜蛾屬)repetita(Hampson)、Apamea(秀夜蛾屬)repetita(Chen)、Sapporia(薩夜蛾屬)repetita(Sugi)(Inoueetal., 1982； 陳一心， 1985； 1992)。在研究中更顯混亂，竹筍夜蛾的學(xué)名難以統(tǒng)一。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基于DNA所攜帶的遺傳信息進(jìn)行生物分類(lèi)已逐漸成為研究熱點(diǎn)。其中，昆蟲(chóng)線粒體基因組中細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ(mtDNA COⅠ)基因序列因既具有高度保守序列，又具有足夠變異位點(diǎn)的特性，被廣泛用于昆蟲(chóng)分類(lèi)、種群和進(jìn)化關(guān)系研究(Luntetal., 1996)。2002年，德國(guó)進(jìn)化生物學(xué)家Tautz等首先提出將DNA作為生物分類(lèi)研究平臺(tái)的觀點(diǎn)，即以DNA 序列為基礎(chǔ)建立物種鑒定體系(Tautzetal., 2003)。2003年，加拿大學(xué)者Hebert 等提出建立DNA條形碼鑒定系統(tǒng)，即以線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(COⅠ) 基因5′端648 bp 的序列多樣性為基礎(chǔ)進(jìn)行物種鑒定。Hebert 等(2003)還發(fā)現(xiàn)這段序列在鱗翅目200個(gè)近緣種中鑒定的成功率為100%。本研究針對(duì)4種竹筍夜蛾近緣種生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性相似、分類(lèi)地位上存在爭(zhēng)議的問(wèn)題，克隆4種竹筍夜蛾線粒體COⅠ基因5′端709 bp片段系列，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析其親緣關(guān)系，為其進(jìn)一步明確其分類(lèi)地位提供分子理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

2013年4月—2014年4月，在浙江省安吉市竹博園和富陽(yáng)竹子產(chǎn)區(qū)采集4種供試竹筍夜蛾幼蟲(chóng)各200頭，室內(nèi)飼養(yǎng)至成蟲(chóng)羽化，拍照，搜集活體成蟲(chóng)浸泡于無(wú)水乙醇中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)材料

TAKALA MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit VER.5.0 試劑盒，TaKaRa MiniBest DNA Fragment Purification Kit Ver 3.0試劑盒，PMD-19-T載體，大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞，其中擴(kuò)增4種竹筍夜蛾的線粒體COⅠ基因所用引物來(lái)自通用引物(Folmeretal., 1994):

L1490-5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATT G-3’;

H2198-5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAA AA T-3’。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 4種竹筍夜蛾總基因組DNA的提取 分別選取4種竹筍夜蛾成蟲(chóng)樣本，按照TAKALA MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit VER.5.0 試劑盒操作步驟提取4種竹筍夜蛾總基因組DNA。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，使用紫外成像系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行觀察和拍照。

1.3.2 4種竹筍夜蛾線粒體COⅠ基因的擴(kuò)增 以提取到的竹筍夜蛾總基因組DNA為模板，引物為上述通用引物，按照如下反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對(duì)4種竹筍夜蛾線粒體COⅠ基因進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：25 μL，其中上下游引物各1 μL，10×擴(kuò)增緩沖液 2.5 μL，4種dNTP混合物2 μL，DNA模板5 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，ddH2O 13.2 μL。反應(yīng)條件為： 預(yù)變性94 ℃ 2 min，變性94 ℃1 min，退火50 ℃1 min，延伸72 ℃1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。取3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用紫外成像系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行觀察和拍照。

1.3.3 4種竹筍夜蛾線粒體COⅠ基因PCR產(chǎn)物純化、克隆和測(cè)序 產(chǎn)物經(jīng)電泳后，按照TaKaRa MiniBest DNA Fragment Purification Kit Ver 3.0試劑盒操作步驟對(duì)4種竹筍夜蛾線粒體COⅠ基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化的PCR 產(chǎn)物與PMD-19-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)，16 ℃過(guò)夜。將連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞，待菌落長(zhǎng)出來(lái)后，挑選單個(gè)陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，鑒定重組質(zhì)粒。測(cè)序公司為生工生物工程(上海)測(cè)序部，要求雙向測(cè)通并進(jìn)行拼接。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 利用MEGA 5.0軟件分析4種竹筍夜蛾的堿基組成、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、堿基替換模式和遺傳距離等特性。登錄NCBI對(duì)4種竹筍夜蛾線粒體COⅠ基因進(jìn)行同源性搜索，選取其他21條(15屬21種)線粒體COⅠ基因(表1)的氨基酸序列，分別采用鄰接法(NJ)、最大簡(jiǎn)約法(ML)和最大似然法(MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。分析其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，其中NJ法選用的模型是P-Distance。所有方法均運(yùn)用Bootstrap檢驗(yàn)重復(fù)，抽樣1 000次，其余參數(shù)為默認(rèn)。

表1 21種蛾類(lèi)昆蟲(chóng)COⅠ 基因信息①Tab.1 Information of COⅠ genes of 21 noctuid insects

① *：無(wú)中文屬名No Chinese name.

2 結(jié)果與分析

2.1 4種竹筍夜蛾成蟲(chóng)形態(tài)特征

由圖1可知，4種竹筍夜蛾成蟲(chóng)形態(tài)基本接近，主要區(qū)別在于其體色和斑紋。4種竹筍夜蛾成蟲(chóng)形態(tài)相關(guān)指標(biāo)見(jiàn)表2。

2.2 4種竹筍夜蛾COⅠ基因目的片段序列的克隆與鑒定

對(duì)4種竹筍夜蛾COⅠ基因片段克隆產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均出現(xiàn)1條700 bp左右的特異性條帶(圖2)，與試驗(yàn)?zāi)康南喾?。樣品?jīng)測(cè)序公司測(cè)序拼接后，獲得4種竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因片段堿基序列，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)序3次，結(jié)果相同，長(zhǎng)度均為709 bp(登錄號(hào)分別為基夜蛾KR780071、薩夜蛾KR780072、竹筍禾夜蛾KR780073、筍秀夜蛾KR780074)。將該片段序列在NCBI上進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果同比對(duì)的夜蛾科中Noctuaatlantic(AY600452.1)等昆蟲(chóng)的線粒體COⅠ基因序列相似度極高(94%以上)。

圖1 4種竹筍夜蛾成蟲(chóng)形態(tài)Fig.1 Adult morphological characteristic of 4 bamboo shoot-boring noctuids

表2 4種竹筍夜蛾成蟲(chóng)形態(tài)特征Tab.2 Adult morphological characteristic of 4 bamboo shoot-boring noctuids

圖2 竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因克隆陽(yáng)性菌落PCR電泳Fig 2 MtDNA COⅠgene’s positive colony PCR electrophoregram of bamboo shoot borers

2.3 4種竹筍夜蛾及其比對(duì)昆蟲(chóng)mtDNA COⅠ基因片段的序列特征

4種竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因片段堿基序列同源性達(dá)98.2%。在4種竹筍夜蛾樣本mtDNA COⅠ基因709 bp序列片段中，多態(tài)性位點(diǎn)為30個(gè)，僅占整個(gè)序列的4.2%，與其他物種同源基因序列進(jìn)行堿基比對(duì)發(fā)現(xiàn)，獲得的4條樣本基因片段均為編碼區(qū)序列，并且沒(méi)有堿基插入和缺失。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，4種竹筍夜蛾的mtDNA COⅠ基因片段均從第3個(gè)堿基開(kāi)始翻譯，無(wú)移碼現(xiàn)象，編碼235個(gè)氨基酸，同源性高達(dá)99.89%，其中僅薩夜蛾第162個(gè)氨基酸與其他3種夜蛾不同，其余3種夜蛾氨基酸片段完全相同。

2.4 4種竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因片段的遺傳變異分析

使用MEG5.0軟件計(jì)算4種竹筍夜蛾及其比對(duì)昆蟲(chóng)mtDNA COⅠ基因序列的遺傳距離，計(jì)算模型為p-Distance。結(jié)果表明，筍秀夜蛾與基夜蛾間的遺傳距離為0.014，與竹筍禾夜蛾間的遺傳距離為0.006，與薩夜蛾間的遺傳距離為0.069； 基夜蛾與竹筍禾夜蛾間的遺傳距離為0.008，與薩夜蛾間的遺傳距離為0.067； 竹筍禾夜蛾與薩夜蛾間的遺傳距離為0.063(表3)。4種竹筍夜蛾中，除了薩夜蛾與其他3種夜蛾的種間遺傳距離較大，大于所有比對(duì)昆蟲(chóng)的平均種間距離外，其他3種種間遺傳距離均較小，與比對(duì)昆蟲(chóng)的種內(nèi)距離相近。

4種竹筍夜蛾及其比對(duì)昆蟲(chóng)的堿基替換模式為： Ts >Tv，R值為12.6(表4)。TC間發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換次數(shù)最多，達(dá)16次，占替換總數(shù)(19)的84.2%； TA發(fā)生堿基顛換次數(shù)最多，達(dá)13次，占顛換總數(shù)(16)的81.25%， CA和TG間的顛換次數(shù)較少，分別為2次和1次，CG間沒(méi)有替換發(fā)生。

表3 4種竹筍夜蛾種間遺傳距離Tab 3 Interspecific genetic distance between the our kinds of bamboo shoot borers

表4 4種竹筍夜蛾及其比對(duì)昆蟲(chóng)mtDNA COⅠ基因的堿基替換頻次①Tab 4 Base substitution frequencies in mitochondrial DNA COⅠ gene from bamboo Shoot borers and other lepidopterous insects

① Ts堿基轉(zhuǎn)換數(shù)Transition;Tv:堿基顛換數(shù)Transversion.R=Ts/Tv.

圖3 基于mtDNA COⅠ基因構(gòu)建的4種竹筍夜蛾系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(NJ法)Fig.3 Molecular phylogenetic tree of mtDNA COⅠ for bamboo shoot borers sequence with methods of Neighbor-Joining

在4種竹筍夜蛾樣本mtDNA COⅠ基因709 bp序列片段中，檢測(cè)到保守性位點(diǎn)(conserved sites)555個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)(variable sites)154個(gè)，占總檢測(cè)位點(diǎn)的21.72%； 簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(parsimony-informative sites)118個(gè)，占16.64%； 單突變位點(diǎn)(singleton site)36個(gè)，占5.07%。

2.5 4種竹筍夜蛾基于mtDNA COⅠ基因片段的系統(tǒng)進(jìn)化分析

用4種竹筍夜蛾及其比對(duì)昆蟲(chóng)的mtDNA COⅠ氨基酸序列在Mega5.0中構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),結(jié)果如圖3、4、5所示，3種進(jìn)化樹(shù)顯示結(jié)果大致相同。與比對(duì)序列相比，4種竹筍夜蛾分屬同一支，分支支持率達(dá)100%，親緣關(guān)系最近，其中薩夜蛾與其他3種夜蛾分屬2個(gè)分支，分支支持率為70%左右。MP法進(jìn)化樹(shù)中，基夜蛾又與竹筍禾夜蛾和筍秀夜蛾分為2支，分支支持率為30%。3種進(jìn)化樹(shù)均顯示，4種竹筍夜蛾與禾夜蛾屬、秀夜蛾屬的昆蟲(chóng)遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖4 基于mtDNA COⅠ基因構(gòu)建的4種竹筍夜蛾系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(ML法)Fig.4 Molecular phylogenetic tree of mtDNA COⅠ for bamboo shoot borers sequence with methods of Maximum Likelihood

3 討論

Foster等(1997)認(rèn)為，線粒體基因密碼子位點(diǎn)在物種進(jìn)化過(guò)程中由于受選擇壓力影響，會(huì)表現(xiàn)出不同程度的堿基突變。在不同的密碼子位點(diǎn)上，4種竹筍夜蛾及其比對(duì)昆蟲(chóng)mtDNA COⅠ基因片段堿基含量變化規(guī)律一致。但密碼子第2位點(diǎn)的A+T含量顯著高于第1、3 位點(diǎn)，說(shuō)明4種竹筍夜蛾密碼子第2位點(diǎn)上的堿基突變由純化選擇導(dǎo)致(陳星等， 2012)。此外，密碼子第2位點(diǎn)的堿基突變大多屬于同義突變，容易在進(jìn)化過(guò)程中通過(guò)自然選擇固定下來(lái)(周繼亮等， 2001)。本研究結(jié)果與櫟黃掌舟蛾(Phaleraassimilis)mtDNA COⅠ基因密碼子位點(diǎn)變異特點(diǎn)不同，其密碼子第3位點(diǎn)的A+T含量顯著高于第1、2 位點(diǎn)(楊瑞生等， 2013)，可能是由于夜蛾種類(lèi)不同導(dǎo)致。在堿基替換模式上，本研究中4種竹筍夜蛾的mtDNA COⅠ基因均為堿基轉(zhuǎn)換高于顛換，其R值為12.6，與鱗翅目蛾類(lèi)昆蟲(chóng)的堿基替換模式一致(楊瑞生等， 2008； 2011； 2013)。生物進(jìn)化可以說(shuō)是生物體在基因水平上堿基突變不斷累積的結(jié)果，一旦同種生物不同個(gè)體間的堿基突變累積到一定程度(量變)，就會(huì)產(chǎn)生種的分化(質(zhì)變)。Hebert(2003)等對(duì)動(dòng)物界11門(mén)13 320種的COⅠ 基因序列進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)98%的物種間的遺傳距離大于0.002，而種內(nèi)遺傳距離多小于0.001，很少超過(guò)0.002，而同屬種之間的mtDNA COⅠ基因平均距離為0.011 3，除刺細(xì)胞動(dòng)物門(mén)的物種外，COⅠ基因的序列多樣性足以區(qū)分所有動(dòng)物中的近緣種。本研究結(jié)果表明，4種竹筍夜蛾及其比對(duì)昆蟲(chóng)種間遺傳距離為0.002～0.093，符合Hebert等(2003)的研究結(jié)果。

圖5 基于mtDNA COⅠ基因構(gòu)建的4種竹筍夜蛾系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(MP法)Fig.5 Molecular phylogenetic tree of mtDNA COⅠ for bamboo shoot borers sequence with methods of maximum parsimony(MP)

基于COⅠ基因建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，4種夜蛾親緣關(guān)系非常接近，而與秀夜蛾屬和禾夜蛾屬其他昆蟲(chóng)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因未能檢索到基夜蛾屬和薩夜蛾屬其他昆蟲(chóng)COⅠ基因，故無(wú)法比較其親緣關(guān)系。分類(lèi)學(xué)上對(duì)4種竹筍夜蛾的歸屬研究一直存在爭(zhēng)議，本研究或可提供部分參考。本研究中筍秀夜蛾與基夜蛾、竹筍禾夜蛾、薩夜蛾的遺傳距離分別為0.014、0.006、0.069，所建進(jìn)化樹(shù)也表明筍秀夜蛾與竹筍禾夜蛾親緣關(guān)系較近，其次為基夜蛾，與薩夜蛾親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。綜上所述，本研究建議可將基夜蛾、竹筍禾夜蛾和筍秀夜蛾歸為同一個(gè)屬，薩夜蛾由于其在浙江分布較少，主要分布于廣東茶稈竹上，與這3種竹筍夜蛾親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，其分類(lèi)地位可進(jìn)一步進(jìn)行確認(rèn)。此外，4種竹筍夜蛾成蟲(chóng)形態(tài)差異較小，生態(tài)習(xí)性相似，分布區(qū)域基本一致，分子進(jìn)化樹(shù)初步確定其親緣關(guān)系接近，可作為理想的同域物種進(jìn)化研究素材。

昆蟲(chóng)線粒體DNA 相對(duì)于核基因來(lái)說(shuō)，具有進(jìn)化速率快、物種間序列保守等特點(diǎn)，因而成為篩選條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因的首選(Hebertetal., 2003)。研究發(fā)現(xiàn)， 昆蟲(chóng)線粒體DNA含有13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因(Boore， 1999； Taanman， 1999)，其中因?yàn)閙tDNA COⅠ基因的序列保守性強(qiáng)，在種間鑒定上具有較高的可靠性，且易于擴(kuò)增，被絕大多數(shù)研究者選為昆蟲(chóng)的DNA 條形碼基因。利用DNA條形碼鑒定的研究中，63.7%的研究樣本來(lái)自昆蟲(chóng)，其中又以鱗翅目的研究居多(李青青等， 2010)，其次為雙翅目(Nelsonetal., 2007)、鞘翅目(Monaghanetal., 2005)等。本研究克隆了4種竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因片段，可為竹筍夜蛾DNA條形碼鑒定提供理論基礎(chǔ)。線粒體基因上保守基因眾多，多基因片段聯(lián)合的DNA 條形碼鑒定系統(tǒng)已經(jīng)成為一個(gè)探索的趨勢(shì)(肖金花等， 2004)，進(jìn)一步驗(yàn)證DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定和物種親緣關(guān)系研究中的適用性。此外，由于4種竹筍夜蛾親緣關(guān)系較近，今后可通過(guò)采集不同地理種群，克隆其mtDNA COⅠ基因及其他保守序列(COⅡ、16sRNA等)，研究其進(jìn)化過(guò)程，進(jìn)一步揭示4種竹筍夜蛾的進(jìn)化關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究利用4種竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因片段構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明4種竹筍夜蛾親緣關(guān)系接近，可為4種竹筍夜蛾分類(lèi)地位的確定提供初步分子基礎(chǔ)，同時(shí)可為竹筍夜蛾DNA條形碼鑒定提供理論基礎(chǔ)。鑒于本研究克隆的只是4種竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因的5′端部分序列，今后可通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)竹筍夜蛾mtDNA COⅠ序列全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，以提高mtDNA COⅠ 基因DNA條形碼的可靠性。4種竹筍夜蛾形態(tài)差異較小，生態(tài)習(xí)性相似，分布區(qū)域基本一致，可作為理想的同域物種進(jìn)化研究素材。

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(責(zé)任編輯 朱乾坤)

Genetic Relationship of Shoot-Boring Noctuids Based on Mitochondrial Cytochrome Oxidase Ⅰ Gene

Zhang Qin1,2Mo Youdi3Zhang Yabo1Shu Jinping1Wang Haojie1Wu Hong1

(1.ResearchInstituteofSubtropicalForestry,CAFFuyang311400; 2.HangzhouAcademyofForestryHangzhou311300; 3.HuaijiForestryBureauofZhaoqing,GuangdongProvinceZhaoging526000)

【Objective】 The bamboo shoot-boring noctuid is a joint name for several species of moths which are hamful to bamboo shoot stage in southern China. There are four dominant species that have sympatric distribution and the same host. Their biological and ecological characteristics are similar. However,the classification status and evolutionary approach are still controversial. To determine their classification status and provide a molecular theory foundation for the system evolution, their genetic relationship was studied in the paper. 【Method】The bamboo shoot borers, distributing in the bamboo production areas surrounding in Hangzhou, Zhejiang Province, were used as the research object, and four 709 bp segments of cytochrome C oxidase subunit Ⅰ(COⅠ) gene were cloned, using universal primers, from mitochondrial DNA of different bamboo shoot borers′ individuals and compared with homologous sequences from other lepidopterous insects to analyze their base composition characteristics and the genetic relationship for accurate identification of bamboo shoot borers at molecular level by building system evolutionary trees．【Result】1)The results indicated that the genetic distance between the four kinds of bamboo shoot borers was small.2)Three phylogenetic trees showed that they got 100% support on the branch.【Conclusion】 The four bamboo shoot borers have closed genetic relationship,among which three species can be classified into one genus exceptSapporiarepetita.Furthermore, the four kinds of bamboo shoot borers could be used as ideal samples for sympatric speciation research for its similarity in body and habits and distribution.This study provides preliminary molecular basis for the genetic relationship and DNA barcoding technology of the 4 kinds of bamboo shoot moths at the same time.

shoot-boring noctuids; mitochondrial cytochrome oxidaseⅠgene; sequence comparison; genetic relationship

10.11707/j.1001-7488.20170411

2015-05-14；

2016-12-07。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201304403)。

S718.7

A

1001-7488(2017)04-0096-09

* 舒金平為通訊作者。