老年高血壓患者肝腎陰虛證的特征

白玲玲，仲茂鳳，杜娟，凌昌全

第二軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系,上海200433

老年高血壓患者肝腎陰虛證的特征

白玲玲，仲茂鳳，杜娟，凌昌全

第二軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系,上海200433

目的觀察老年高血壓患者肝腎陰虛證臨床特征及外周血標(biāo)識(shí)基因表達(dá)，為中醫(yī)辨證論治老年高血壓提供依據(jù)。方法本研究首先分析老年高血壓患者高血壓分級(jí)和病程與肝腎陰虛證的相關(guān)性；再根據(jù)全基因組芯片在原發(fā)性肝癌患者的肝腎陰虛證與非肝腎陰虛證組中篩選的具有差異表達(dá)的17個(gè)基因mRNA的表達(dá)，基于異病同證原理，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)探索性觀察老年高血壓肝腎陰虛證患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中是否存在同樣的17個(gè)差異基因mRNA的表達(dá)。并應(yīng)用受試者特征性操作曲線（ROC曲線）構(gòu)建肝腎陰虛證的診斷模型。結(jié)果研究共納入老年高血壓患者（＞65歲）60名，其中肝腎陰虛證患者30名，非肝腎陰虛證患者30名，隨著高血壓病程延長(zhǎng)，老年高血壓肝腎陰虛證患者更多；與非肝腎陰虛證患者相比，老年高血壓肝腎陰虛證患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中MLH3表達(dá)減少，CD55表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步采用ROC分析，AUCMLH3=0.783，AUCCD55=0.737，MLH3和CD55作為老年高血壓肝腎陰虛證診斷模型的靈敏度分別為63.5%、57%，特異度分別為93%，90%。結(jié)論MLH3和CD55可能是老年高血壓肝腎陰虛證的標(biāo)識(shí)基因。

老年；高血壓；肝腎陰虛證；錯(cuò)配修復(fù)基因3；促衰變因子

隨著老齡化社會(huì)的到來，老年高血壓患者的數(shù)量近年來也持續(xù)增多，長(zhǎng)期服用降壓藥物及高血壓所帶來的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，尤其是老年高血壓患者[1]。有報(bào)道，高血壓發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增加[2]。高血壓在傳統(tǒng)祖國(guó)醫(yī)學(xué)中屬于“眩暈”、“頭痛”、“中風(fēng)”、“痰飲”、“水腫”、“耳鳴”等疾病范疇，其病理機(jī)制與肝、腎相關(guān)，多肝腎陰虛表現(xiàn)，這一點(diǎn)最早可追溯至《黃帝內(nèi)經(jīng)》[3]成書時(shí)期。現(xiàn)代著名醫(yī)家郭士魁[4]對(duì)原發(fā)性高血壓的發(fā)病認(rèn)為是“肝火可見于高血壓初期，熱證時(shí)久必?fù)p陰液形成陰虛陽亢，病情再發(fā)展，陰虛更甚，腎陰虛影響到肝陰虛，出現(xiàn)肝腎陰虛。”由于老年人的生理機(jī)能特點(diǎn)，肝腎陰虛證在老年高血壓患者中更為多見，接近17%的老年高血壓患者表現(xiàn)為肝腎陰虛[5]。本文基于“異病同治”的思想，在既往 mRNA芯片篩選出的肝癌肝腎陰虛標(biāo)識(shí)基因的基礎(chǔ)上，對(duì)老年高血壓患者肝腎陰虛進(jìn)行臨床癥狀分析，并探討其可能的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 60例病例來源2013年1月—2015年2月期間就診于第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院心內(nèi)科、上海市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科和上海龍華醫(yī)院的高血壓患者。按照中醫(yī)辨證 [辨證標(biāo)準(zhǔn)參考2002年版《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則 (試行)》]，分為肝腎陰虛組30例和非肝腎陰虛組30例。

1.2 診斷及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 參照《中國(guó)高血壓防治指南》2010年修訂版[6]制定的診斷標(biāo)準(zhǔn):（1）年齡＞65歲、血壓持續(xù)或 3次以上非同日坐位血壓收縮壓＞l40 mmHg和（或）舒張壓＞90mmHg。（2）l級(jí)高血壓收縮壓：140～159mmHg和（或）舒張壓90～99mmHg；2級(jí)高血壓:收縮壓160～179 mmHg和（或）舒張壓100～109 mmHg。(當(dāng)收縮壓與舒張壓屬不同分級(jí)時(shí),按較高的級(jí)別診斷)。辨證標(biāo)準(zhǔn):參照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2002年制定發(fā)布的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[7]按癥狀分級(jí)量化標(biāo)準(zhǔn)采樣歸納。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的分離及RNA抽提采集每例患者外周血3m L，EDTA抗凝，PBS稀釋，緩慢加入另一已加入淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，3 000 g離心30 min；分離PBMCs，加入Trizol，按照5:1的體積加入氯仿，室溫靜置，離心，提取上層水相，等體積加入異丙醇，離心，提取總RNA[8-9]。

1.4 RTPCR檢測(cè)參照文獻(xiàn)[10]，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入引物（見表1），SYBRGreen，ddH2O補(bǔ)足體積，配成20L反應(yīng)體系，進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)運(yùn)用IBM SPSS Statistic17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為主,組間基因相對(duì)表達(dá)差異的比較，選用檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)上述篩選的陽性差異表達(dá)基因，以非參數(shù)法構(gòu)建各自的受試者工作特征ROC曲線，計(jì)算曲線下面積 (Area under the Curve of ROC,簡(jiǎn)稱AUC)，從而構(gòu)建肝腎陰虛證的診斷模型。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 老年高血壓患者肝腎陰虛證的臨床特點(diǎn) 在肝腎陰虛證與非肝腎陰虛證患者中，依據(jù)高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)中的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，2組患者中診斷為高血壓1級(jí)的各1例，高血壓2級(jí)的分別為8例和10例，診斷為高血壓3級(jí)的分別為20例和19例。見表2。

表2 高血壓分級(jí)與證候

對(duì)入組患者原發(fā)性高血壓發(fā)病病程進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，并以＜5年、5～10年、11～15年、＞15年4個(gè)不同階段進(jìn)行分層，發(fā)現(xiàn)隨著老年患者病程的延長(zhǎng)，表現(xiàn)為肝腎陰虛者更多。見表3。

表3 高血壓病程與證候

2.2 老年高血壓患者肝腎陰虛證的標(biāo)識(shí)基因 既往采用mRNA芯片篩選肝癌患者肝腎陰虛證標(biāo)識(shí)基因，發(fā)現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的是：SEC62、ACSL6、PDE3B、BIRC3、TCF7、CR1、CCNB1、PAICS、PSPH、CD55、NT5E和MLH3（＜0.05）；表達(dá)上調(diào)的是PSMD6、KRAS、TRPC1、CTSK和XRCC4（＜0.05）；根據(jù)“異病同證”思想，其他疾病肝腎陰虛證患者可能存在相同的物質(zhì)基礎(chǔ)，檢測(cè)這17個(gè)基因在老年高血壓肝腎陰虛證患者的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非肝腎陰虛證組相比，肝腎陰虛證患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中僅有MLH3表達(dá)下調(diào)（＜0.05），CD55表達(dá)上調(diào)（＜0.05）。其余基因的表達(dá)2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 17個(gè)基因在老年高血壓肝腎陰虛證組與非肝腎陰虛證組的表達(dá)

2.3 構(gòu)建老年高血壓患者肝腎陰虛證證候診斷模型 根據(jù) MLH3和 CD55的受試者特征曲線，AUCMLH3=0.783,AUCCD55=0.737，MLH3和 CD55作為老年高血壓肝腎陰虛證診斷模型的靈敏度分別為63.5%和57%，特異度分別為93%和90%。見圖2。

圖2 MLH3和CD55的ROC曲線

3 討論

高血壓病按其臨床表現(xiàn)可歸屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“眩暈”、“頭痛”等范疇。老年高血壓病是高血壓病的一種特殊類型，其臨床表現(xiàn)多樣，病因病機(jī)復(fù)雜，發(fā)病與臟腑功能虛損的關(guān)系極為密切。肝腎虧虛、陰陽失調(diào)，是為本虛；肝陽上亢、痰濁閉阻，是為標(biāo)實(shí)。盧燦輝總結(jié)盧永兵治療老年高血壓病經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為老年高血壓是虛實(shí)夾雜、上實(shí)下虛之病，初病常以實(shí)為主，病久以虛為主，虛以肝腎陰虛、心脾氣虛多見，實(shí)以風(fēng)、火、痰、疲為主[11]。本研究的結(jié)果也正說明這一點(diǎn),隨著患者年齡的增長(zhǎng)及病程的延長(zhǎng)，患者證型多呈現(xiàn)出由實(shí)證向虛證轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。高血壓病程較長(zhǎng)的患者表現(xiàn)為肝腎陰虛的比例略高。

近幾十年來，有關(guān)證的生物學(xué)基礎(chǔ)研究開展的很多，雖然有一些現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)，但至今尚未有公認(rèn)的結(jié)論。前期研究發(fā)現(xiàn)，肝癌肝腎陰虛證患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中17個(gè)基因的mRNA表達(dá)與非肝腎陰虛證患者存在差異，為了體現(xiàn)中醫(yī)“異病同證”思想，減輕疾病本身對(duì)證候標(biāo)識(shí)基因的影響，同時(shí)選擇了肝腎陰虛發(fā)病率較高的老年高血壓患者進(jìn)行觀察，同樣檢測(cè)從肝癌患者中篩選出的這17個(gè)mRNA。與肝癌肝腎陰虛證相比，老年高血壓肝腎陰虛證與非肝腎陰虛證患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA中僅發(fā)現(xiàn)MLH3和CD55這兩個(gè)基因的mRNA表達(dá)在2組之間存在差異。而CD55在高血壓肝腎陰虛證中的表達(dá)與肝癌中相反?？赡茉颍海?）原發(fā)性肝癌與原發(fā)性高血壓屬于兩種不同的疾病，老年高血壓更是存在特殊性，因此很多基因的表達(dá)可能與疾病的關(guān)系更為密切。（2）由于老年高血壓入組患者年齡都大于65歲，普遍高于肝癌患者，可能會(huì)影響某些基因的表達(dá)。（3）樣本量偏小，離散度偏大。

證候與疾病的發(fā)生、發(fā)展是密不可分的，證候?qū)W對(duì)人們預(yù)防疾病、治療及預(yù)后康復(fù)的調(diào)整方面均有著一定的指導(dǎo)意義。然而，證候理論尚未有、形成完整的體系，有待完善。應(yīng)當(dāng)在繼承、整理、總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將證候理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的新思路、新方法相結(jié)合，探索中醫(yī)證候的分子基礎(chǔ)，拓展中醫(yī)證候理論。此研究是在假設(shè)“異病同證”存在相同的差異基因表達(dá)的前提下進(jìn)行的探索性研究，篩選出的標(biāo)識(shí)基因只能說是與老年高血壓肝腎陰虛證密切相關(guān)，與其他疾病的肝腎陰虛證是否相關(guān)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Clinical Features of Elderly Hypertensive Patients w ith Deficiency Syndrome of Both Liver and Kidney Yin

Bai Lingling,Zhong Maofeng,Du Juan,Ling Changquan*
Department of TCM,Second M ilitary Medical University,Shanghai,200433,P.R.China

Objective To observe the clinical features and expression of marker genes in peripheral blood in elderly hypertensive patients w ith deficiency syndrome of both liver and kidney yin.Methods The correlation of hypertension grades and the course of the disease to deficiency syndrome of both liver and kidney yin was first studied;17 mRNA expressions w ith differentia were screened out from primary liver cancer patients w ith deficiency syndrome of both liver an kidney yin and from primary liver cancer patients w ith no deficiency syndrome of both liver and kidney yin by chromosomal microarray,and then the real-time fluorescence quantitative PCR technology was applied in observing if there existed the mRNA expressions same w ith the 17 in peripheral blood mononuclear cells of the elderly hypertensive patients w ith deficiency syndrome of both liver an kidney yin;the diagnostic model was set up based on the Receiver Operating Characteristic(ROC)curves.Results In total,the study enrolled 60 elderly hypertensive patients(＞65 years old),30 patients w ith deficiency syndrome of both liver and kidney yin while 30 patients w ith no;more elderly hypertensive patients got deficiency syndrome of both liver and kidney yin w ith the course of hypertension lasting;the MLH3 expression in peripheral blood mononuclear cells of the elderly hypertensive patients w ith deficiency syndrome of both liver an kidney yin decreased much more than that in patients w ith no deficiency syndrome of both liver an kidney yin while CD55 expression was enhanced,the difference was of statistical significance;ROC analysis showed that AUCMLH3=0.783 and AUCCD55=0.737;the sensitivity of MLH3 and CD55 of the diagnostic model was 63.5% and 57%respectively.Conclusions MLH3 and CD55 may be the marker genes in elderly hypertensive patients w ith deficiency syndrome of both liver an kidney yin.

elderly;deficiency syndrome of both liver an kidney yin;MLH3;CD55

2016-11-25）

（本文編輯：夏世金）

國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目（81273881）

凌昌全，電子信箱:lingchangquan@hotmail.com

*Corresponding author:Ling Changquan,E-mail:lingchangquan@hotmail.com