固相萃取–高效液相色譜法同時測定飼料中4種磺胺類藥物殘留

陳卿卿，金遷，林靈超

(浙江福立分析儀器有限公司，浙江溫嶺 317500)

固相萃取–高效液相色譜法同時測定飼料中4種磺胺類藥物殘留

陳卿卿，金遷，林靈超

(浙江福立分析儀器有限公司，浙江溫嶺 317500)

建立固相萃取–高效液相色譜法同時測定飼料中的磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺喹惡啉4種磺胺類藥物殘留的方法。樣品用乙腈提取，然后用堿性氧化鋁固相萃取柱凈化，色譜柱為C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以水–乙腈(體積比為75∶25，含0.3%乙酸)為流動相，流量為1.0 mL／min，檢測波長為270 nm。4種磺胺類藥物的質(zhì)量濃度在1～10 μg／mL范圍內(nèi)與其色譜峰面積呈良好的線性，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.025～0.133 μg／g?；前奉愃幬餃y定結(jié)果的相對標準偏差為0.22%～0.30%(n=6)，樣品加標回收率為93.6%～106.7%。實際飼料樣品中均未檢出這4種磺胺組分。該方法具有干擾少，靈敏度高，重復性好的優(yōu)點，可以作為飼料中的磺胺類藥物殘留的一種檢測方法。

磺胺類藥物殘留；固相萃??；高效液相色譜；飼料

磺胺類藥物為人工合成的抗菌藥物，可用于預防和治療細菌感染性疾病，具有抗菌譜較廣、性質(zhì)穩(wěn)定和使用簡便等特點［1］。磺胺類藥物常被個別飼料生產(chǎn)企業(yè)私自加到商品飼料中，導致養(yǎng)殖環(huán)節(jié)長期被動使用，在畜產(chǎn)品體內(nèi)積累后，間接在人體內(nèi)積蓄，最終產(chǎn)生耐藥性，并影響人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起泌尿道損害、造血功能障礙、過敏性反應等，臨床上表現(xiàn)為晶尿、血尿、蛋白尿、溶血性貧血、再生障礙性貧血、皮疹、藥疹以及胃腸道反應等，并有致畸、致癌、致突變的可能性［2］。因此國際食品法典委員會、我國及歐美一些國家明確規(guī)定食品中磺胺類藥物總量不超過0.1 mg／kg，并且對于某些單一磺胺類藥物的殘留限量要求更低［3］。

目前，磺胺類藥物殘留的檢測方法主要有微生物學法、免疫法和理化分析方法等。微生物學法簡便、費用低，但操作費時而且敏感性、特異性較差，難以進行定性定量分析，不能滿足現(xiàn)代殘留檢測的需要，甚至有些檢測結(jié)果達不到最高殘留限量的要求［4］；免疫法［5–7］使用了檢測試劑盒檢測，具有簡便、快速，特異性強，靈敏度高，樣品預處理簡單等優(yōu)點，符合快速檢測的要求，但由于磺胺類藥物是小分子物質(zhì)，沒有免疫原性，必須連接到大分子載體上產(chǎn)生特異性免疫應答，所以藥物殘留試劑盒在穩(wěn)定性和準確度方面存在一定的局限性，檢測過程中容易出現(xiàn)假陽性，造成干擾［8］；理化分析方法包括表面等離子諧振傳感器法［9］、液質(zhì)聯(lián)用分析法［10–11］、毛細管電泳–電化學檢測法［12］、高效液相色譜法［13–16］等。筆者通過對飼料基質(zhì)的優(yōu)化處理和色譜分析條件的優(yōu)化選擇，建立了用固相萃取高效液相色譜法測定飼料中4種磺胺類藥物殘留的方法。該方法具有干擾少、靈敏度高、檢出限低、重復性好的優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC5090型，含紫外檢測器、自動進樣器，浙江福立分析儀器有限公司；

固相萃取真空裝置：VM24型，博納艾杰爾科技有限公司；

堿性氧化鋁萃取柱：Cleanert Alumina-B型，1 000 mg／12 mL，月旭材料(上海)有限公司；

電子分析天平：FA1104型，感量為0.1 mg，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

振蕩器：HY–2A型，江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；

氮吹儀：HGC–12A型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；

磺胺嘧啶(批號：201200)、磺胺二甲嘧啶(批號：201209)、磺胺甲惡唑(批號：201209)、磺胺喹惡啉(批號：201209)標準溶液：質(zhì)量濃度均為100 μg／mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所；

乙腈：色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?/p>

乙酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

實驗用水為超純水(自制)。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：SapphiresilTM–C18柱 (250 mm×4.6 mm，5μm，浙江福立分析儀器有限公司)；流動相：水–乙腈(體積比為75∶25，含0.3%乙酸)；流量：1.0 mL／min；柱溫：30℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：270 nm；進樣體積：20 μL。

1.3 樣品處理

1.3.1 提取

稱取飼料樣品約2 g，置于100 mL平底燒瓶中，加入25 mL乙腈，于振蕩器中震蕩提取30 min，轉(zhuǎn)移上清液。殘渣用25 mL乙腈重復提取1次，合并2次上清液，待凈化。

1.3.2 凈化

將堿性氧化鋁萃取柱置于固相萃取真空裝置上，以10 mL乙腈預淋洗，棄去淋洗液。取提取后上清液2 mL，移入堿性氧化鋁萃取柱中，令其自然流出。收集全部流出液，用氮吹儀吹至近干，用流動相溶解并定容至1.0 mL，過0.45 μm濾膜，待上機測試。

1.4 標準溶液配制

混合標準溶液：精密移取磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺喹惡啉標準溶液適量，加乙腈配制成磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺喹啉質(zhì)量濃度均為20 μg／mL的混合標準溶液，濾過，待用。

混合標準工作溶液：分別準確吸取適量混合標準溶液，用流動相稀釋成0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg／mL 6個系列濃度，臨用時配制。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

為達到較好的分離效果，對同規(guī)格(250 mm×4.6 mm，5 μm)的SapphiresilTM–C18色譜柱、Ultiamte XB–C18色譜柱、Inertsil ODS–3等系列色譜柱進行試驗考察。結(jié)果顯示，當使用SapphiresilTM–C18色譜柱時，色譜圖基線平穩(wěn)，分離度高，峰形良好，分析時間短。因此選擇SapphiresilTM–C18色譜柱。

2.2 流動相的選擇

分別選用水–乙腈（水相中含0.3%乙酸）、水–甲醇、水–乙腈進行了對比試驗。試驗結(jié)果表明，采用水–乙腈（體積比為75∶25，含0.3%乙酸）為流動相時，磺胺類各組分峰形、分離度較好，因此選用水–乙腈（體積比為75∶25，含0.3%乙酸）作為流動相。用水–乙腈(體積比為75∶25，含0.3%乙酸)為流動相時，磺胺類藥物標準溶液、實際樣品加標色譜圖分別見圖1、圖2。

圖1 磺胺混合標準溶液的色譜圖

圖2 空白樣品加標的色譜圖

2.3 檢測波長的選擇

由于磺胺類藥物均含有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)，在波長250～285 nm內(nèi)有強紫外吸收。試驗顯示，除磺胺喹唑啉的最大吸收波長在247 nm處，磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑三者的最大吸收波長均在267 nm附近。為了兼顧這幾種磺胺類藥物都要有較高的檢測靈敏度，又要盡量避開干擾，試驗選擇在270 nm波長下測定。

2.4 固相萃取凈化條件的選擇

由于磺胺具有可離子化和極性強的性質(zhì)，試驗對比了硅膠柱、Cleanert Alumina-B柱、Oasis HLB等固相萃取柱。試驗顯示，磺胺類藥物經(jīng)乙腈提取過硅膠柱后回收率較低；Oasis HLB凈化體系回收率在40%～80%之間，而且不穩(wěn)定；而Cleanert Alumina-B柱凈化效果和方法回收率均較好。因此實驗選擇Cleanert Alumina-B柱進行凈化。

2.5 方法的線性和檢出限

取1.4配制的系列混合標準工作溶液，按照1.2儀器條件進行測定，每個濃度進樣3次。以各自峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x，μg／mL)進行線性回歸分析，得到各磺胺類藥物的線性方程和相關(guān)系數(shù)；以信噪比S／N=3確定各組分的檢出限，結(jié)果見表1。

表1 標準曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限

由表1可知，4種磺胺類藥物的質(zhì)量濃度在0.1～10 μg／mL范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999。

2.6 精密度試驗

取2 μg／mL磺胺混標溶液，在1.2色譜條件下平行測定5次，記錄每次測定的峰面積，計算其相對標準偏差，結(jié)果見表2。由表2可知，該方法具有良好的精密度。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.7 實際樣品測定及加標回收試驗

對某維生素預混飼料樣品按照1.3進行樣品處理，在1.2色譜色譜條件下進樣分析，結(jié)果均未檢出這4種磺胺類藥物殘留。然后在此飼料樣品中分別加入一定量的混合標準工作溶液，使樣品中4種磺胺類藥物的含量分別為1，5，10 mg／kg，進行加標回收試驗，結(jié)果見表3。

表3 實際樣品測定及加標回收試驗結(jié)果

由表3可知，樣品加標回收率在93.6%～106.7%之間，說明該方法具有較高的準確度。

3 結(jié)語

采用固相萃取凈化處理飼料樣品，建立了高效液相色譜法測定飼料中磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺喹惡啉4種磺胺類藥物殘留的方法。該方法操作簡單，測定結(jié)果準確可靠，可滿足飼料中多種磺胺類藥物殘留日常檢測工作需求。

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上海硅酸鹽所研制出新型快檢試紙有望用于尿糖快速檢測

近年來，快速分析檢測技術(shù)在化學檢測、醫(yī)學診斷、司法鑒定、環(huán)境監(jiān)測和食品檢測等領(lǐng)域具有廣泛的應用。這一儀器分析檢測工作過去往往需要求助于某些特定單位(機構(gòu))，如科研單位、醫(yī)院、分析測試中心等。儀器分析方法具有高測定精度和低檢出限, 但由于所用儀器一般是大型精密儀器, 且采用交流電做電源，操作較為復雜，使用不方便，一般不適合用于現(xiàn)場快速檢測。隨著科學技術(shù)的進步，各種現(xiàn)場性、臨時性、快速高效的分析檢測手段相繼出現(xiàn)，這些分析檢測手段大多是通過顏色變化以及變化程度來實現(xiàn)的。試紙法作為一種快速的現(xiàn)場檢測方法，其特點是操作簡單、攜帶方便、價格便宜, 并具有一定的選擇性、準確性和靈敏度，在醫(yī)療衛(wèi)生、食品、水質(zhì)、空氣及其它檢測方面具有廣泛的應用。因此，具備諸多優(yōu)點的檢測試紙應運而生。例如，現(xiàn)今市場上銷售的早孕試紙為女性判斷是否懷孕提供了快速高效的檢測手段。

尿糖檢測對分析人體健康狀態(tài)非常重要，定期尿檢已經(jīng)成為大眾生活中不可缺少的一部分?，F(xiàn)今，尿糖檢測試紙已經(jīng)商品化。在尿糖的檢測中，通常需要用到葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶以及顯色劑。商業(yè)化的尿糖試紙將上述三種物質(zhì)負載在紙條上，通過顯色反應和比色卡來檢測尿糖含量。然而，葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶這類天然酶價格高，其制備、提純和儲存均耗時耗力，而且檢測活性易受外界環(huán)境如pH值、溫度等影響。

近年來，具有天然酶活性的人工模擬酶受到人們的廣泛關(guān)注。通過化學方法合成的人工模擬酶成本低，催化活性較為穩(wěn)定，有望取代部分天然酶應用于分析檢測領(lǐng)域。最近，中國科學院上海硅酸鹽研究所研究員朱英杰帶領(lǐng)的科研團隊發(fā)明了一種有望用于尿糖檢測的快速檢測試紙，該檢測試紙本身具有類似過氧化物酶的活性，可用于葡萄糖、過氧化氫等物質(zhì)的快速分析檢測。更重要的是該檢測試紙制備簡單、成本較低、穩(wěn)定性好，可實現(xiàn)多次重復回收利用。相關(guān)研究工作發(fā)表在國際期刊《歐洲化學》上，入選熱點論文和封面論文，并且申請了一項發(fā)明專利。論文發(fā)表后不久，Chemistry Views以Chemical Test Paper from Core/Shell Nanofibers為題對該研究工作做了報道。

研究團隊發(fā)明的方法很簡單，在羥基磷灰石超長納米線上原位生長具有類過氧化物酶活性的Fe基金屬有機框架復合物，利用羥基磷灰石超長納米線上的鈣離子與金屬有機框架復合物上的羧基之間的耦合作用，制備具有核殼結(jié)構(gòu)的羥基磷灰石超長納米線金屬有機框架復合物納米纖維，并將其用于制備快速檢測試紙。重要的是，該方法制備的快速檢測試紙可實現(xiàn)多次回收再利用，只需將使用后變色的檢測試紙浸泡在酒精中僅僅30 min后，檢測試紙就重新變回原來的顏色。

高柔韌性羥基磷灰石超長納米線是新型無機耐火紙的重要制造原料，在此之前，該團隊開展了羥基磷灰石超長納米線的制備方法探索研究，成功地制備出高柔韌性羥基磷灰石超長納米線。該研究工作是新型無機耐火紙的系列研究工作之一，是該團隊在成功研發(fā)出新型高柔韌性羥基磷灰石超長納米線耐火紙、新型高效抗菌羥基磷灰石超長納米線耐火紙、以及新型羥基磷灰石超長納米線防水耐火紙之后取得的又一個新的重要研究進展。

相關(guān)研究工作得到國家自然科學基金、上海市科委、中科院上海硅酸鹽研究所創(chuàng)新重點項目等資助。

（中國分析計量網(wǎng)）

食藥監(jiān)總局印發(fā)食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范

2015年新食品安全法出臺，規(guī)定“采用快速檢測方法對食品進行抽查檢測，被抽查人對檢測結(jié)果沒有異議的，可以作為行政處罰的依據(jù)”，某種程度上給快檢結(jié)論賦予了法律效力，由此催生食品快檢行業(yè)及快速檢測方法的高速發(fā)展。

2017年3月28日，為保證食品快速檢測方法評價工作的科學性和規(guī)范性，食品藥品監(jiān)管總局組織制定了《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》。這也意味著風頭正勁的快檢技術(shù)自此有了評價規(guī)范，變得有據(jù)可依。 （儀器信息網(wǎng)）

Simultaneous Determination of Four Suifonamide Residues in Feeds by High Performance Liquid Chromatography with Solid Phase Extraction

Chen Qingqing， Jin Qian， Lin Lingchao
(Zhejiang Fuli Analytical Instrumentation Co., Ltd.， Wenling 317500， China)

A method was developed for simultaneous determining sulfadiazine, sulfadimidine, sulphamethoxazole, sulfaquinoxaline in feeds by high performance liquid chromatography with solid phase extraction. The feed sample was extracted by acetonitrile and then purified with Cleanert Alumina–B Solid Phase Extraction column，and separated on C18colunm(250 mm×4.6 mm，5 μm) by using mobile phase of acetonitrile–water (volume ratio was 75∶25，with 0.3% acetic acid) at flow rate of 1.0 mL／min，then detected at 270 nm. The concentration of four suifonamide residues had good linear relationships with the chromatographic peak area in the range of 1–10 μg／mL，the correlation coefficients were more than 0.999, the detection limits were 0.025–0.133 μg／g. The relative standard deviation of determination results was 0.22%–0.30%(n=6). The average recoveries were in the range of 93.6%–106.7%. The four suifonamide residues were not determined in actual feed samples. This method has the advantages of less interference, high sensitivity，good repeatability，and it is suitable for the determination of four sulfonamides in feeds.

suifonamide residue; solid phase extraction; HPLC; feed

O657.7

A

1008–6145(2017)03–0084–04

聯(lián)系人：陳卿卿；E-mail: 740863318@qq.com

2017–02–18

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.03.020