氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定茶葉中的蒽醌＊

何正和，魏斌，魏云計(jì)，朱臻怡，何健，馮民，張科，秦嫻

［淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局，國家飼料安全檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(淮安)，江蘇淮安 223001］

氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定茶葉中的蒽醌＊

何正和，魏斌，魏云計(jì)，朱臻怡，何健，馮民，張科，秦嫻

［淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局，國家飼料安全檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(淮安)，江蘇淮安 223001］

建立氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法(GC–MS–MS)快速測定茶葉中蒽醌的方法。樣品中的蒽醌用色譜純乙腈提取，經(jīng)過渦旋1 min，超聲20 min，離心、濃縮后用固相萃取柱(SPE)凈化，以DB–5MS毛細(xì)管柱分離，以m／z207.9，152為定性離子對(duì)、m／z207.9，180為定量離子對(duì)，多反應(yīng)檢測模式下測定，外標(biāo)法定量。蒽醌的質(zhì)量濃度在1～500 μg／L范圍內(nèi)與定量離子的峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 98，方法的檢出限為1 μg／kg。在10，20，50 μg／kg加標(biāo)水平下，樣品加標(biāo)回收率為92.85%～98.10%，測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.50%～11.05%(n=5)。該方法簡單、快速，檢出限低，準(zhǔn)確度和精密度高，可用于茶葉中蒽醌的檢測。

茶葉；蒽醌；固相萃??；氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法

茶葉在中國由來已久，隨著經(jīng)濟(jì)全球化，茶葉開始流向國外，出口量不斷增多，國外對(duì)茶葉品質(zhì)的要求也越來越苛刻。蒽醌(Anthraquinone，CAS#84–65–1)為茶葉中的有害物質(zhì)之一，2014年10月，歐盟發(fā)布的(EU)No1146／2014要求茶葉中蒽醌的最高限量為0.02 mg／kg［1］。近兩年茶葉出口中，由于蒽醌超標(biāo)就被通報(bào)數(shù)十次［2］，給我國茶葉出口市場帶來巨大的沖擊。導(dǎo)致這一后果有多方面的因素，其中最主要的是茶葉前處理基質(zhì)較為復(fù)雜，國內(nèi)還沒有針對(duì)茶葉中蒽醌檢測的標(biāo)準(zhǔn)［3–5］，定量測定蒽醌的文獻(xiàn)也不多。為了保證國內(nèi)茶葉產(chǎn)品的質(zhì)量安全及茶葉出口的“絲綢之路”，建立茶葉產(chǎn)品中蒽醌殘留量快速、準(zhǔn)確的檢測方法十分必要。目前，蒽醌類定量測定的方法主要有分光光度法［6–7］、高效液相色譜法［8–9］、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法［10］、氣相色譜–質(zhì)譜法［11］、氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法［12］及比色定量法［13–14］等，其中多數(shù)方法測定的是蒽醌類化合物的總量。氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法由于定性可靠，檢測靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為化學(xué)污染物多殘留檢測的研究熱點(diǎn)［15–16］。2015年，柴蕓彬利用GPC凈化處理茶葉中復(fù)雜基質(zhì)，能夠較好地純化分離出蒽醌，采用氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法定量［12］，但此方法需凝膠色譜凈化系統(tǒng)，測定過程較為耗時(shí)。

筆者針對(duì)茶葉前處理中的復(fù)雜基質(zhì)，采用弗羅里硅土SPE小柱凈化，用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(GC–MS–MS)選擇離子掃描測定蒽醌的含量。該方法可以很好地分離出蒽醌并進(jìn)行定量測定，較其它方法快速高效。同時(shí)針對(duì)蒽醌不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑這一特性，利用乙腈、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑作為提取劑來探討蒽醌的提取效率，進(jìn)而建立一個(gè)能夠滿足茶葉蒽醌檢測要求的快速方法。該方法具有樣品前處理簡單、快速，檢出限低，準(zhǔn)確度和精密度高等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：Angilent 7890B–7000C型，美國安捷倫科技有限公司；

九陽料理粉碎機(jī)：C012型，九陽股份有限公司；

電子天平：PB–203E型，瑞士梅特勒–托利多公司；

超聲儀：SB–5200型，廣州滬瑞明儀器有限公司；

漩渦混合器：WH–86型，江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司；

離心機(jī)：3K15型，德國Sigma公司；

氮吹儀：N–EVAP14165型，美國Organomation公司；

SPE小柱：1 000 mg／6 mL，弗羅里硅土，河北津揚(yáng)濾材廠；

針式尼龍濾膜：0.22 μm，天津亳津科技有限公司；

乙腈、丙酮：HPLC級(jí)，美國Honeywell公司；

乙腈：分析純，南京化學(xué)試劑有限公司；

三氯甲烷：HPLC級(jí)，美國VBS公司；

正己烷、甲醇、乙醇：HPLC級(jí)，德國Merck公司；

乙酸乙酯、乙醚、氯化鈉、硫酸鈉：分析純，南京化學(xué)試劑有限公司；

蒽醌(Anthraquinone，CAS#84–65–1)標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.0%，德國Dr Ehrenstorfer公司；

實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱量30.9 mg的蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL的容量瓶中，用正己烷定容至標(biāo)線，然后稀釋成10 μg／mL的蒽醌標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中避光保存。

吸取一定體積的蒽醌標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用基質(zhì)空白溶液逐級(jí)稀釋成蒽醌的質(zhì)量濃度分別為1，5，10， 50，100，500 μg／L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品處理

將茶葉用粉碎機(jī)粉碎，過0.83 mm(20目)篩，混勻，常溫存放在100 mL干凈的棕色玻璃瓶中。精確稱取2.0 g(精確至0.01 g)粉碎后的茶葉樣品至50 mL離心管中，加入10 mL去離子水，渦旋30 s，放入45℃水浴鍋超聲20 min，冷卻至室溫后加入8 mL色譜純乙腈，渦旋1 min。離心管中加入1～3 g氯化鈉恒重，在離心機(jī)中于10 000 r／min離心3 min。將上清液轉(zhuǎn)移至試管中，用6 mL色譜純乙腈再提取一次，合并有機(jī)相，氮吹至約2 mL。SPE小柱加2 cm高度的無水Na2SO4，用3 mL正己烷–丙酮溶液(體積比為8∶2，下同)活化，將氮吹后的濃縮液轉(zhuǎn)移至SPE小柱，再用2 mL正己烷–丙酮溶液洗滌氮吹管2～3次，并將洗滌液移入SPE小柱中，用8 mL正己烷–丙酮溶液洗脫，濾液用氮?dú)獯抵帘M干，用丙酮定容至1 mL，過0.22 μm針式尼龍濾膜于色譜進(jìn)樣瓶中，用氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent122–5532UI DB–5MS柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；進(jìn)樣口溫度：280℃；載氣：高純氦，流量為1.0 mL ／min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫箱升溫程序：初始溫度70℃，保持1 min，以10℃／min升至280℃，保持2 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離模式：電子轟擊(EI)，70 eV；掃描方式：多反應(yīng)檢測模式(MRM)；離子源溫度：230℃；循環(huán)周期：24 s；色譜過濾峰寬：0.8 s；碰撞氣：高純氮?dú)猓髁繛?.5 mL／min；溶劑延遲：5 min；母離子、子離子、碰撞能量及駐留時(shí)間參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)參數(shù)

1.5 色譜圖與質(zhì)譜圖

在1.4儀器工作條件下，對(duì)100 μg／L的蒽醌標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、20 μg／kg空白白茶加標(biāo)樣品進(jìn)行分析，MRM離子流色譜圖分別見圖1、圖2。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜–質(zhì)譜條件的選擇

對(duì)于茶葉中蒽醌污染物，筆者采用一般農(nóng)殘分離的DB–5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣流速為1.0 mL／min。通過不斷調(diào)整進(jìn)樣口溫度、色譜柱溫控程序、載氣流速的色譜關(guān)鍵參數(shù)，避免基質(zhì)干擾峰與目標(biāo)化合物保留時(shí)間的重疊。在盡量提高分離度的情況下，縮短分析時(shí)間。最后經(jīng)過優(yōu)化得到合適的色譜柱升溫條件：70℃保持1 min，然后以10℃／min程序升至280℃，保持2 min。在優(yōu)化的色譜條件下，采用Q3 SCAN全掃描方式得到蒽醌化合物質(zhì)譜圖，選擇2～3個(gè)相對(duì)豐度較高、質(zhì)核比較大的作為產(chǎn)物離子。再將質(zhì)譜的方法改為產(chǎn)物離子掃描方式對(duì)選定的產(chǎn)物離子進(jìn)行掃描，分別選擇豐度較大的兩組離子m／z207.9，152，m／z207.9，180為定性及定量離子對(duì)。為了保證檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，選用不同大小的碰撞能量觀察兩組離子的響應(yīng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)定性及定量離子對(duì)合適的碰撞能量分別為15，10 eV。得到的蒽醌化合物MRM離子參數(shù)見表1。

圖1 100 μg／L的蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品MRM離子流色譜圖

圖2 空白白茶加標(biāo)樣品MRM離子流色譜圖

2.2 樣品前處理方式的選擇

將具有代表性茶葉樣品存放在500 mL干凈的玻璃瓶中。將茶葉用粉碎機(jī)粉碎，過0.83 mm(20目)篩，混勻，常溫存放在100 mL干凈的棕色玻璃瓶中。

針對(duì)茶葉樣品的復(fù)雜基質(zhì)，為了提高提取效率，筆者將樣品加入10 mL 去離子水渦旋并在45℃水浴鍋超聲，再用色譜純乙腈提取兩次。在純化過程中，選擇N-丙基乙二胺(PSA)、石墨碳黑(GCB)和弗羅里硅土SPE小柱進(jìn)行凈化，發(fā)現(xiàn)前兩者較后者易吸附目標(biāo)化合物且凈化不夠充分，試驗(yàn)結(jié)果見表2。對(duì)于前兩者凈化效果不好的原因文獻(xiàn)中也有報(bào)道［17］，GCB會(huì)吸附平面型結(jié)構(gòu)的化合物。因此采用弗羅里硅土SPE小柱純化分析樣品。

表2 不同萃取柱的空白添加樣品測定值

2.3 萃取溶劑的選擇

按1.3進(jìn)行操作，對(duì)提取溶劑進(jìn)行篩選試驗(yàn)，通過改變不同的提取溶劑測定蒽醌的含量。其中丙酮、甲醇和乙醇除不加水外處理步驟如1.3。不同溶劑的加標(biāo)回收率見表3。

表3 不同溶劑對(duì)樣品的加標(biāo)回收率測試結(jié)果

由表3可以看出，提取效率最好的是色譜純乙腈；乙醚、丙酮和甲醇的提取效率較低，并且丙酮和甲醇由于提取過程中沒有加水，直接提取后的基質(zhì)較為復(fù)雜；三氯甲烷和乙醇的提取結(jié)果偏高，乙醇提取同樣也存在基質(zhì)較為復(fù)雜問題；分析純乙腈和正己烷的提取效果較色譜純乙腈差，同時(shí)正己烷提取的穩(wěn)定性不好。因此選擇色譜純乙腈作為提取溶劑。

2.4 線性方程、線性相關(guān)系數(shù)與檢出限

為了避免基質(zhì)對(duì)蒽醌檢測的影響，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。按1.4儀器工作條件測定1.2配制的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以蒽醌的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、以定量離子的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算得線性回歸方程為Y=965.16X–217.85，線性范圍為1～500 μg／L，相關(guān)系數(shù)r=99.998%。以信噪比S／N=3確定方法的檢出限，信噪比S／N=10確定方法定量限，檢出限、定量限分別為1，5 μg／kg。

2.5 精密度試驗(yàn)

在1.4儀器工作條件下，對(duì)添加10，20，50μg／kg 3個(gè)濃度水平的空白茶葉樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.50%～11.05%，表明該方法的精密度較好，可以滿足茶葉中蒽醌檢測要求。

2.6 回收試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱量2.0 g(精確至0.01 g)不含檢測目標(biāo)化合物的空白茶葉樣品，在空白茶葉樣品中分別添加10，20，50 μg／kg的蒽醌，按1.3進(jìn)行樣品處理，在1.4儀器工作條件下測定，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，3種濃度的空白樣品加標(biāo)回收率在92.85%～98.10%之間，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度，可以滿足茶葉中蒽醌檢測要求。

2.7 樣品測試

按照1.3用色譜純乙腈為提取溶劑對(duì)市場購買的不同品種茶葉進(jìn)行樣品處理，在1.4儀器工作條件下平行測定3次，測定結(jié)果平均值見表6。由表6結(jié)果可知，竹葉青和鐵觀音的蒽醌含量低于歐盟(EU)No 1146／2014 規(guī)定的茶葉中蒽醌最大殘留限量(MRL)0.02 mg／kg；而龍井、毛峰和白茶中蒽醌的含量高于此值。

表6 樣品的測試結(jié)果

3 結(jié)語

以色譜純乙腈為萃取劑，弗羅里硅土SPE小柱凈化等前處理，經(jīng)氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法分析，建立了茶葉中蒽醌殘留的檢測方法。該方法快速高效，檢出限低，準(zhǔn)確度和精密度高，能夠滿足歐盟茶葉中蒽醌限量要求(＜0.02 mg／kg)，可用于茶葉蒽醌的檢測。通過幾類茶葉樣品的測試發(fā)現(xiàn)蒽醌存在于茶葉中是很普遍的現(xiàn)象。目前定量測定的方法不多，國標(biāo)中蒽醌的分析也只停留在定性階段。為了能夠給國內(nèi)茶葉出口提供技術(shù)支持，茶葉中蒽醌的來源分析也是以后研究的方向。只有從源頭上控制其含量，才能進(jìn)一步促進(jìn)我國的茶葉貿(mào)易。

［1］COMMISSION REGULATION (EU)No 1146／2014 of 23 October 2014. Amending Annexes II, III, IV and V to Regulation (EC) No 396/2005 of the European Parliament and of the Council as regards maximum residue levels for anthraquinone, benfluralin, bentazone, bromoxynil, chlorothalonil, famoxadone, imazamox, methyl bromide, propanil and sulphuric acid in or on certain products ［R］. European Union: Official Journal of the European Union，2014，L308: 3–59.

［2］朱鳳玲. 2014年歐美日通報(bào)我國不合格茶葉信息匯總［J］.中國茶葉，2015(2): 27–28.

［3］GB／T 23204–2008 茶葉中519種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 氣相色譜–質(zhì)譜法［S］.

［4］GB／T 2405–2006 蒽醌［S］.

［5］GB／T 19648–2006 蒽醌［S］.

［6］葉碧莎，趙琳，宋悅?cè)A.保健食品中總蒽醌的測定［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17 (5): 830–831.

［7］蔡曉，李宏.紫外分光光度法測定保健食品中總蒽醌的含量［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2007，19(1): 47–48.

［8］郭升平.高效液相色譜測定蒽醌［J］.精細(xì)石油化工，1996(1): 59–60.

［9］文島俊幸，本山總良，齊藤文孝，等.高效液相色譜法測定何首烏和夜交藤中蒽醌類成分的含量［J］.藥物分析雜志，1996，16 (4): 219–221.

［10］紀(jì)松崗，柴逸峰，吳玉田，等.超臨界流體萃取一膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法分離測定大黃中蒽醌類組分的含量［J］.分析化學(xué)研究簡報(bào)，1998，26(11): 1 388–1 390.

［11］唐成國.氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用分析蒽醌工作液的組成［J］.化學(xué)研究與利用，2000，12(3): 278–281.

［12］柴蕓彬. GPC凈化聯(lián)合GC–MS–MS檢測茶葉中的蒽醌［J］.廣州化工，2015，43 (4): 128–130.

［13］韓生銀，代海香.降脂靈沖劑總黃硐及總蒽醌的測定［J］.寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，23(2): 106–107.

［14］陳軍，方蕓，刁西輝.比色法測定逐瘀扶正膠囊中蒽醌類成分的含量［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2002，20(5): 298 –300.

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Determination of Anthraquinone in Tea by GC–MS–MS

He Zhenghe, Wei Bin, Wei Yunji, Zhu Zhenyi, He Jian, Feng Min, Zhang Ke, Qin Xian
［Huaian Entry–Exit Inspection and Quarantine Bureau, State Key Laboratory of Feed Safety Testing(Huaian), Huaian 223001, China］

The method for determination of anthraquinone in tea by gas chromatography–tandem mass spectrometry(GC–MS–MS) was established. The sample was extracted by acetonitrile of chromatographic purity, vortexed for 1 min, sonicated for 20 min, centrifuged and concentrated, then the extracts were purified by solid phase extraction(SPE). After being separated on DB–5MS capillary column, the target analyte was detected by GC–MS–MS under the multi reaction monitoring mode with a qualitative ion pair (m／z207.9, 152) and a quantitative ion pair (m／z207.9, 180), and quantified by the external standard method. The anthraquinone concentration and peak area of quantification ion had good relationship in the range of 1–500 μg／L, the correlation coefficient was 0.999 98. The detection limit was 1 μg／kg. The recoveries for 10, 20, 50 μg／kg spiked levels ranged from 92.85% to 98.10%, and the relative standard deviation of determination results was 8.50 %–11.05%(n=5). The method is suitable for determination of anthraquinone in tea with advantages of simple and rapid sample processing, low detection limit, high accuracy and precision.

tea; anthraquinone; solid phase extraction; GC–MS–MS

O657.7

A

1008–6145(2017)03–0018–04

*江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局2016科研項(xiàng)目(2016KJ52)

聯(lián)系人：何正和；E-mail: hezhenghehe@163.com

2017–02–12

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.03.004